CN111892647B - 一种提高达托霉素发酵产量的补料方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高达托霉素发酵产量的补料方法，属于微生物发酵技术领域，该补料方法向发酵液中以等速率梯度的方式流加癸酸‑油酸甲酯溶液，癸酸和油酸甲酯的体积比1∶1，流加开始的时间为菌丝形态开始分化并转入代谢期。本发明提供的补料方法，通过在菌丝形态开始分化并转入代谢期的发酵液中，以等速率梯度的方式流加体积比1∶1的癸酸‑油酸甲酯，显著提高了达托霉素的发酵单位，可达4000mg/L，远高于目前技术能够达到的2500mg/L，通过补料方式的改变，增强了菌体活力该补料方法成本低，工艺简单易于推广且易于在大规模生产上使用。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种提高达托霉素发酵产量的补料方法。
背景技术
达托霉素(Daptomycin)是由玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)通过生物发酵法产生的一种新型环脂肽类抗生素，其分子式为C72H101N17O26，分子量为1620.67，化学名为N-癸酰—L-色氨酸—L-天冬酰胺酰—L-天冬氨酰—L-苏氨酰甘氨酰—L-鸟氨酰—L-D-天冬氨酰—D-丙氨酰—L-天冬氨酰甘氨酰—D-丝氨酰—threo-3-甲基—L-谷氨酰—3-丙氨酸ε1-内酯。由一个十碳烷侧链与一个环状β氨基酸肽链N-末端的色氨酸连接而成，结构式见附图1。达托霉素在体外显示出很强的广谱抗革兰阳性菌的活性，它对15个属35个种的革兰阳性菌都有抑制作用，是继“抗生素最后一道防线”万古霉素后的新型抗生素。主要用于耐药菌，如耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP)，耐万古霉素的肠球菌(VRE)，糖肽类敏感的金黄色葡萄球菌(GISA)，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)和凝固酶阴性的葡萄球菌(CNS)的感染。
目前国内外一般采用生物发酵法获得达托霉素，但是发酵水平普遍较低，一般发酵单位为2500mg/L，无法满足市场需求和临床需要。达托霉素的发酵类型属于典型的非生长偶联型，发酵过程中存在2个生理阶段，即菌丝生长阶段和产物合成阶段。生物发酵法生产达托霉素的过程中，前体癸酸的补加时间和补加浓度是两个关键因素。癸酸补加时间过早会对菌丝产生毒性，影响菌丝生长；补加过迟造成前期形成的母核不能及时酰化，进而对整个代谢途径产生反馈抑制效应，不利于达托霉素的生成。过量补加癸酸会影响发酵溶氧并对菌体产生毒性，癸酸补加量不足则无法保证合成大量的达托霉素。现比较成熟的补加癸酸的方式为流加补料法，但是流加到发酵液中的浓度差别很大，无法有效提升达托霉素的发酵单位。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：如何通过补料方法的改进提高玫瑰孢链霉菌发酵液中达托霉素产量。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种提高达托霉素发酵产量的补料方法，包括以下步骤：向发酵液中以等速率梯度的方式流加癸酸-油酸甲酯溶液，癸酸和油酸甲酯的体积比1∶1，流加开始的时间为菌丝形态开始分化并转入代谢期。
本发明的有益效果在于：本发明提供的补料方法，通过在菌丝形态开始分化并转入代谢期的发酵液中，以等速率梯度的方式流加体积比1∶1的癸酸-油酸甲酯，显著提高了达托霉素的发酵单位，可达4000mg/L，远高于目前技术能够达到的2500mg/L。通过补料方式的改变，增强了菌体活力。该补料方法成本低，工艺简单易于推广且易于在大规模生产上使用。
附图说明
图1所示为达托霉素的结构式；
图2所示为使用本发明具体实施方式的补料方法进行达托霉素发酵的发酵菌丝形态图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明的一种提高达托霉素发酵产量的补料方法，包括以下步骤：向发酵液中以等速率梯度的方式流加癸酸-油酸甲酯溶液，癸酸和油酸甲酯的体积比1∶1，流加开始的时间为菌丝形态开始分化并转入代谢期。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：由于癸酸-油酸甲酯对菌体具有一定毒性，在发酵过程中，保持菌丝正常生长代谢和前体补加量之间的平衡尤为重要，本发明提供的补料方法，根据玫瑰孢链霉菌的生长代谢规律和菌丝对癸酸-油酸甲酯的耐受程度，建立了发酵过程中宏观和微观的判断标准，防止菌丝对癸酸-油酸甲酯不耐受，导致菌丝自溶或代谢异常。依据宏观(溶氧≥30％，菌浓30-35％且基本稳定)和微观(菌丝网状、局部膨胀、变粗，空胞增多，有少量断裂，见附图2,)判断标准，本发明提供了一种提高达托霉素发酵产量的补料方法，提出等速率梯度流加补料法，通过在菌丝形态开始分化并转入代谢期的发酵液中，以等速率梯度的方式流加体积比1∶1的癸酸-油酸甲酯，显著提高了达托霉素的发酵单位，可达4000mg/L。
进一步的，流加开始的时间为发酵开始后的第18-22h。
从上述描述可知，最佳补料时期为菌丝生长处于对数生长期中后期，即为发酵开始后的第18-22h。
进一步的，流加癸酸-油酸甲酯溶液的初始速率为0.05mL/(h·L)。
进一步的，流加癸酸-油酸甲酯溶液的速率以0.05mL/(h·L)梯度增加。
进一步的，流加癸酸-油酸甲酯溶液的速率每隔6h增加一次，速率增至0.45mL/(h·L)后保持速率不变，直至发酵结束。
从上述描述可知，在发酵中后期(约160h左右)菌体部分衰老死亡，对癸酸的利用率下降，但是癸酸-油酸甲酯本质是表面活性剂，对发酵液后期的泡沫有较好的抑制作用，此时流加速率保持最大(0.45mL/(h·L))不降低，有助于提高达托霉素的发酵单位。
进一步的，上述的提高达托霉素发酵产量的补料方法，具体包括以下步骤：将玫瑰孢链霉菌接种至种子培养基中培养，得到母液；将母液接种至一级培养基中培养，得到一级培养液；将一级培养液接种至二级培养基中培养，得到二级培养液；将二级培养液接种至发酵培养基中培养，当发酵至菌丝形态开始分化并转入代谢期，开始向发酵液中以等速率梯度的方式流加癸酸-油酸甲酯溶液，癸酸和油酸甲酯的体积比1∶1。
从上述描述可知，目前达托霉素发酵多数将母液或一级培养液直接加入发酵罐进行发酵，通过优化级数，可有效增强菌体活力，有助于提高达托霉素的发酵单位。
实施例1：
一种提高达托霉素发酵产量的补料方法，具体包括以下步骤：
将玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)接种至种子培养基中培养得到母液；将母液接种至一级培养基中培养得到一级培养液；将一级培养液接种至二级培养基中培养得到二级培养液；将二级培养液接种至发酵培养基中培养，当发酵至20±2h菌丝形态开始分化并转入代谢期，开始流加癸酸∶油酸甲酯(体积比1∶1)，初始速率为0.05mL/(h·L)，每隔6h，流加速率以0.05mL/(h·L)梯度增加，共9个梯度，增至0.45mL/(h·L)维持流加速率不变，直至发酵结束。
实施例2：
一种提高达托霉素发酵产量的补料方法，具体包括以下步骤：
步骤1、将玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)接种至种子培养基中，接种量为1‰，培养周期为26±2h，pH 6.5±0.5，得到母液，此时菌丝成大球、核心致密，外围菌丝较长；
种子培养基，包括胰蛋白大豆肉汤30g/L、糊精35g/L；
步骤2、母液接种至一级培养基中，接种量为3‰，培养周期24±2h，pH 7.2±0.5，得到一级培养液，此时菌丝成网状、细长、舒展有分枝；
一级培养基，包括黄豆饼粉30g/L、糊精70g/L、糖蜜7.2g/L、葡萄糖10.7g/L、六水合硫酸亚铁铵0.9g/L和有机硅消泡剂0.9g/L；
步骤3、一级培养液接种至二级培养基中，接种量为12％，培养周期18±2h，pH7.5±0.5，得到二级培养液，此时菌丝成大球且分布均匀，外围菌丝细长、舒展；
二级培养基，包括黄豆饼粉30g/L、糊精70g/L、糖蜜7.2g/L、葡萄糖10.7g/L、六水合硫酸亚铁铵0.9g/L和有机硅消泡剂0.9g/L；
步骤4、二级培养液接种至发酵培养基中，接种量为20％，发酵至20h菌丝形态开始分化并转入代谢期，开始流加癸酸∶油酸甲酯(体积比1∶1)，初始速率为0.05mL/(h·L)，每隔6h，流加速率以0.05mL/(h·L)梯度增加，共9个梯度，增至0.45mL/(h·L)维持流加速率不变，直至发酵结束；
发酵培养基，包括酵母粉12.5g/L、黄豆饼粉5g/L、糊精72g/L、糖蜜7.2g/L、葡萄糖10.7g/L、六水合硫酸亚铁铵0.43g/L和有机硅消泡剂1.5g/L。
实施例3：
使用实施例2的方式得到二级培养液，同时接种至3个发酵罐中，进行3批达托霉素的同时发酵，发酵过程中的发酵单位见表1所示、
表1
对比例1：
使用实施例2的方式得到二级培养液，同时接种至10个发酵罐中，共5批达托霉素的同时发酵，其中，每个批次分别有一个发酵罐采用恒速的方式流加补料，一个发酵罐采用等速率梯度的方式流加补料。恒速的速率为0.26mL/(h·L)，此速率是在30±2h开始流加的速率(太早菌丝不耐受，影响发酵正常运行)。恒速的方式流加时，0.05-0.26mL/(h·L)的速率都有尝试，0.26mL/(h·L)是通过实验比较得到的最优速率，流加直至发酵结束。等速率梯度的初始速率为0.05mL/(h·L)，每隔6h，流加速率以0.05mL/(h·L)梯度增加，共9个梯度，增至0.45mL/(h·L)维持流加速率不变，直至发酵结束。结果见表2所示，
表2
从表1和表2可以看出，相较于传统的恒速流加补料，本申请提供的以等速率梯度的方式进行流加补料的补料方法能够显著提高了达托霉素的发酵单位，可达4000mg/L。
综上所述，本发明提供的补料方法，通过在菌丝形态开始分化并转入代谢期的发酵液中，以初始速率为0.05mL/(h·L)，而后每隔6h流加速率以0.05mL/(h·L)梯度增加的等速率梯度的方式流加体积比1∶1的癸酸-油酸甲酯，增至0.45mL/(h·L)后维持流加速率不变，直至发酵结束的补料方式，显著提高了达托霉素的发酵单位，可达4000mg/L，远高于目前技术能够达到的2500mg/L。通过补料方式的改变，增强了菌体活力。该补料方法成本低，工艺简单易于推广且易于在大规模生产上使用。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (3)
1.一种提高达托霉素发酵产量的补料方法，其特征在于，包括以下步骤：向玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus）的发酵液中以等速率梯度的方式流加癸酸-油酸甲酯溶液，癸酸和油酸甲酯的体积比1∶1，流加开始的时间为菌丝形态开始分化并转入代谢期；
其中，流加癸酸-油酸甲酯溶液的初始速率为0.05mL/(h•L)；
其中，流加癸酸-油酸甲酯溶液的速率以0.05 mL/(h•L)梯度增加；
其中，流加癸酸-油酸甲酯溶液的速率每隔6h增加一次，速率增至0.45mL/(h•L)后保持速率不变，直至发酵结束。
2.根据权利要求1所述的提高达托霉素发酵产量的补料方法，其特征在于，流加开始的时间为发酵开始后的第18-22h。
3.根据权利要求1所述的提高达托霉素发酵产量的补料方法，其特征在于，包括以下步骤：将玫瑰孢链霉菌接种至种子培养基中培养，得到母液；将母液接种至一级培养基中培养，得到一级培养液；将一级培养液接种至二级培养基中培养，得到二级培养液；将二级培养液接种至发酵培养基中培养，当发酵至菌丝形态开始分化并转入代谢期，开始向发酵液中以等速率梯度的方式流加癸酸-油酸甲酯溶液，癸酸和油酸甲酯的体积比1∶1。
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