CN102229968A - 一种利用吸水链霉菌累积生产西罗莫司的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用吸水链霉菌累积生产西罗莫司的方法，将吸水链霉菌接种到种子培养基中，30℃条件下活化培养60h，然后按接种量为6wt％将吸水链霉菌接种到发酵罐中，在发酵前期即在菌体生长阶段，发酵8h后进行指数流加葡萄糖，控制比生长速率在0.02/h-0.06/h，进行高细胞密度培养，获得较高的菌体浓度；发酵32h后进入发酵中后期，通过恒速流加前体物莽草酸和L-赖氨酸，为合成西罗莫司提供前体物，提高其发酵水平。与现有技术相比，本发明合成得到的西罗莫司最高效价可达700mg/L，比分批发酵提高约30％，这种发酵策略控制简单、西罗莫司产量较高。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产西罗莫司的方法，尤其是涉及一种利用吸水链霉菌累积生产西罗莫司的方法。
背景技术
西罗莫司(Sirolimus，SRL)，原名雷帕霉素(Rapamycin，RPM)。是由三十一元环组成的含氮三烯大环内酯类抗生素。是一种具有抗真菌、抗增殖抗肿瘤作用的新型强效免疫抑制剂。1975年，Ayerster实验室从太平洋Ester岛(Raps Nui)土壤中分离得到吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)产生的西罗莫司。西罗莫司最初确定为一种抗真菌抗生素，1977年发现其具有重要的免疫抑制作用，1989年开始把其作为用于抗器官移植排斥反应的新型高效免疫抑制剂进行研究，目前(2010年)RAPA的I、II期临床试验已结束，III期临床试验正在进行之中。1999年9月美国FDA批准其适用于在临床上的肾移植病人。在中国，西罗莫司口服液作为二类新药2002年获准进入国内临床。2005年6月福建省微生物研究所研制研发的国产西罗莫司经SFDA批准投放市场。现在西罗莫司已成功开发为新型强效的免疫抑制剂，用于器官移植抗排斥反应，用于治疗自身免疫性疾病；用于涂层支架，防止心脏血管再狭窄；作为roTOR靶向抗肿瘤药物，抑制肿瘤的生长等。西罗莫司及其的衍生物CCI-779、AP23573和RAD001正开发为靶向、低毒的抗肿瘤药物。
西罗莫司作为免疫抑制剂的机制在雷帕霉素通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，阻断T淋巴细胞活化的后期反应(增殖)，抑制细胞从G1期进入S期，阻断白细胞介素-2(IL-2)与其受体的结合，使Tc、Td细胞不能成为具有免疫因答作用的致敏性T淋巴细胞，从而发挥其免疫作用。
目前西罗莫司的生产主要是采用发酵的方法，其发酵过程有以下特点：(1)发酵过程分为菌丝生长和西罗莫司生产两个阶段。(2)发酵液粘度极高，当发酵过程供氧不足时，西罗莫司的生产将停止(徐亲民，国外医药抗生素分册，2000)。据国内外文献报道不同的碳源，氮源，以及无机盐的种类和含量与西罗莫司的生产有密切关系。Y.R.Cheng等(Y.R.Cheng et，al，MicrobioL，1995)研究了；磷酸盐及金属离子等对菌体生长和雷帕霉素产物累的作用。磷酸盐对菌体的生长和产物的形成关系密切，浓度大于10mM的磷酸盐会阻碍菌体生长并影响产物的形成。美国麻省理工学院Arnold A·Demain教授等的研究已表明：西罗莫司大环内酯是由6个乙酸和7个丙酸单位所组成，3个甲氧基来自蛋氨酸的甲基。果糖、赖氨酸可以促进西罗莫司的生物合成，(NH4)2SO4和外源蛋氨酸反而对SRL的生物合成产生负影响。2000年又发现：L一蛋氨酸减低SRL产量，但提高去甲基一SRL(副产物)产量，2004年，印度学者Vaid等即对一株链霉菌进行诱变，将植物油作为惟一碳源进行发酵，结果表明连续发酵144～192h，西罗莫司的产率可达到180～330mg/L；印度科学家(Ranbax et al，2005)从土壤中筛选了高产西罗莫司链霉菌，且副产物极少，在高通气量的糊精培养基中通过补料分批发酵产生了300～310mg/L的西罗莫司；顾骏等(顾骏等，华东理工大学学报(自然科学版)，2007)在发酵初期添加2.5g/L的异亮氨酸(Ile)，结果西罗莫司产量提高了约59％。陈希杨等(陈希扬等，化学工程，2011)研究了西罗莫司发酵的最佳种子培养时间，发现60h的种子液能够产生最高的发酵水平。系统地考察了发酵培养基中不同水平的碳氮源和各种无机盐对西罗莫司发酵水平的影响，并确定最优的培养基配方。
作为新型强效免疫抑制剂，西罗莫司具有广阔的应用前景。但是，国内外文献报道的吸水链霉菌发酵生产RPM的水平都较低，大多在100-300mg/L。国内外研究进展发现西罗莫司的发酵生产存在原始菌株产西罗莫司能力低下、发酵周期长、中间产物多、高浓度产物和底物抑制、发酵液分离提取复杂等问题，因此很难实现产业化。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种有利于提高西罗莫司产量、快速产生西罗莫司、操作简单、效价较高的利用吸水链霉菌累积生产西罗莫司的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种利用吸水链霉菌累积生产西罗莫司的方法，其特征在于，该方法包括：取ISP3斜面种子用20wt％甘油洗脱孢子形成孢子悬浊液，按2wt％接种量将孢子悬浊液接种到种子培养基中，控制温度为30℃下活化培养60h，长成得到吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)，然后按接种量为6wt％将吸水链霉菌接种到发酵罐中，发酵罐初始采用的培养基为优化后的葡萄糖-甘油双碳源液体培养基，发酵前期为葡萄糖指数流加发酵，发酵中后期为前体物补料流加，用缓冲液控制pH稳定在5.7-6.3，培养得到西罗莫司。
所述的ISP3斜面种子包括以下组分及含量：燕麦片2g/L、琼脂粉2g/L，溶剂为蒸馏水。
所述的种子培养基包括以下组分及含量：葡萄糖(C6H12O6·H2O)10.0-15.0g/L、蛋白胨3.0-6.0g/L、酵母提取物3.0-6.0g/L、酪蛋白水解物1.5-2.5g/L、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.25-0.5g/L、磷酸氢二钾(K2HPO4)1.0-1.5g/L，溶剂为蒸馏水，种子培养基的pH值为6.5-7.5。
所述的优化后的葡萄糖-甘油双碳源液体培养基包括以下组分及含量：葡萄糖15.0-20.0g/L、甘油5.0-10.0g/L、黄豆饼粉5.0-10.0g/L、酵母提取物3.0-6.0g/L、蛋白胨2.0-3.0g/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)2.5-5.0g/L、磷酸氢二钾(K2HPO4)2.5-5.0g/L、氯化钠(NaCL)4.0-5.0g/L、L-赖氨酸1.4-2.0g/L、硫酸亚铁(FeSO4)1.5-2.0g/L、硫酸镁(MgSO4·7H2O)2.0-2.5g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然。
所述的发酵前期为发酵达到32小时，期间向发酵罐中指数流加葡萄糖，所述的发酵中后期向发酵罐中恒速补加前体物，用缓冲液调节发酵罐中的发酵液pH稳定在5.7-6.3。
所述的发酵前期待发酵8h后，指数流加葡萄糖，控制比生长速率为0.02-0.06/h。
所述的补加前体物包括以下组分和补料速率：莽草酸浓度为2-4g/L，补料速度为500mg/L·天，L-赖氨酸浓度为1-2g/L，补料速度为250mg/L·天。
所述的缓冲液为浓度0.5mol/L的K2HPO4及0.5mol/L的KH2PO4构成的缓冲液。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1)发酵第一阶段通过指数流加葡萄糖控制菌体的比生长速率来达到更高的菌体密度；
2)发酵第二阶段通过补前体物莽草酸和L-赖氨酸，有利于提高西罗莫司产量；
3)发酵第二阶段通过补葡萄糖调控pH，有利于快速产生西罗莫司；
4)西罗莫司效价较高，最高可达700mg/L，接近于目前国际报道的最高值，本发明为实现西罗莫司的大规模生产提供了一种有效方法。
附图说明
图1为实施例1中产品的发酵曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
斜面ISP3培养基培养9天置于4℃冰箱保藏斜面。取斜面种子用20％甘油洗脱孢子形成孢子悬浊液，2wt％接种到种子摇瓶培养基中(g/L)：葡萄糖(C6H12O6·H2O)10.0，蛋白胨(Peptone)6.0，酵母提取物(Yeast Extract)6.0，酪蛋白水解物(casaminoacid)1.5，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.25，磷酸氢二钾(K2HPO4)1.0，pH 7.0。30℃条件下活化培养60h，按接种量6wt％接种到7L发酵罐中。发酵初期采用优化的发酵培养基(g/L)：葡萄糖(Glucose)15.0、甘油(Glycerol)10.0、黄豆饼粉(Soybean)10.0、酵母提取物(Yeast Extract)6.0、蛋白胨(Peptone)2.0、磷酸二氢钾(KH2PO4)5.0、磷酸氢二钾(K2HPO4)5.0、氯化钠(NaCL)5.0、L-赖氨酸(L-Lysine)1.4、硫酸亚铁(FeSO4)1.5、硫酸镁(MgSO4·7H2O)2.5，、pH 自然(备注：碳氮源分开灭菌，加入适量泡敌)。
28℃、转速250rmp、溶氧30％以上发酵，发酵前期，发酵8h之后，葡萄糖指数流加，控制菌体的比生长速率为0.03/h，补料发酵32h后，菌体密度到达最大，发酵中后期采用缓冲液0.5K2HPO4-0.5KH2PO4控制发酵液pH稳定在5.7-6.3范围内，补料培养基配方组成和补料速率为：莽草酸浓度为2g/L，补料速度为500mg/L·天，L-赖氨酸浓度为1g/L，补料速度为250mg/L·天，连续恒速补料96h，继续发酵到120小时放罐。
西罗莫司产量最高达到700mg/L，比分批发酵产量提高约30％，发酵曲线如图1所示。
实施例2
斜面ISP3培养基培养9天置于4℃冰箱保藏斜面。取斜面种子用20％甘油洗脱孢子形成孢子悬浊液，2wt％接种到种子摇瓶培养基中(g/L)：葡萄糖(C6H12O6·H2O)10.0，蛋白胨(Peptone)6.0，酵母提取物(Yeast Extract)6.0，酪蛋白水解物(casaminoacid)1.5，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.25，磷酸氢二钾(K2HPO4)1.0，pH 7.5。30℃条件下活化培养60h，按接种量6wt％按培养基体积计接种到7L发酵罐中。发酵初期采用优化的发酵培养基(g/L)：葡萄糖(Glucose)15.0、甘油(Glycerol)10.0、黄豆饼粉(Soybean)10.0、酵母提取物(Yeast Extract)6.0、蛋白胨(Peptone)2.0、磷酸二氢钾(KH2PO4)5.0、磷酸氢二钾(K2HPO4)5.0、氯化钠(NaCL)5.0、L-赖氨酸(L-Lysine)1.4、硫酸亚铁(FeSO4)1.5、硫酸镁(MgSO4·7H2O)2.5、pH自然(备注：碳氮源分开灭菌，加入适量泡敌)。
28℃、转速250rpm溶氧30％以上发酵，发酵前期第8h之后，葡萄糖指数流加，控制菌体的比生长速率为0.04/h，补料发酵32h后，菌体密度到达最大。发酵进入中后期，采用缓冲液0.5K2HPO4-0.5KH2PO4控制发酵液pH稳定在5.7-6.3范围内，补料培养基配方组成为和补料速率：莽草酸浓度为2g/L，补料速度为500mg/L·天，L-赖氨酸浓度为1g/L，补料速度为250mg/L·天，连续恒速补料96h，继续发酵到120h放罐。最终西罗莫司产量达到665mg/L。
实施例3
斜面ISP3培养基培养9天置于4℃冰箱保藏斜面。取斜面种子用20％甘油洗脱孢子形成孢子悬浊液，2wt％接种到种子摇瓶培养基中(g/L)：葡萄糖(C6H12O6·H2O)10.0、蛋白胨(Peptone)6.0、酵母提取物(Yeast Extract)6.0、酪蛋白水解物(casaminoacid)1.5、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.25、磷酸氢二钾(K2HPO4)1.0、pH 7.0。30℃条件下活化培养60h，按接种量6wt％接种到7L发酵罐中。发酵初期采用优化的发酵培养基(g/L)：葡萄糖(Glucose)15.0、甘油(Glycerol)10.0、黄豆饼粉(Soybean)10.0、酵母提取物(Yeast Extract)6.0、蛋白胨(Peptone)2.0、磷酸二氢钾(KH2PO4)5.0、磷酸氢二钾(K2HPO4)5.0、氯化钠(NaCL)5.0、L-赖氨酸(L-Lysine)1.4、硫酸亚铁(FeSO4)1.5、硫酸镁(MgSO4·7H2O)2.5，pH自然(备注：碳氮源分开灭菌，加入适量泡敌)。28℃、转速250rpm，溶氧30％以上发酵，发酵初期第8h之后，葡萄糖指数流加，控制菌体的比生速率为0.06/h，补料发酵32h后，菌体密度到达最大，发酵中后期采用缓冲液0.5K2HPO4-0.5KH2PO4控制发酵液pH稳定在5.7-6.3范围内，补料培养基配方组成和补料速率为：莽草酸浓度为2g/L，补料速度为500mg/L·天，L-赖氨酸浓度为1g/L，补料速度为250mg/L·天，连续恒速补料96h，继续发酵到120h放罐。最终西罗莫司产量达到645mg/L。
实施例4
一种利用吸水链霉菌累积生产西罗莫司的方法，该方法包括以下步骤：取ISP3斜面种子用20wt％甘油洗脱孢子形成孢子悬浊液，按2wt％接种量将孢子悬浊液接种到种子培养基中，控制温度为30℃下活化培养60h，长成得到吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)，然后按接种量为6wt％将吸水链霉菌接种到发酵罐中，发酵罐初始采用的培养基为优化后的葡萄糖-甘油双碳源液体培养基，发酵前期为葡萄糖指数流加发酵，发酵中后期为前体物补料流加，用缓冲液控制pH稳定在5.7-6.3，培养得到西罗莫司。
其中，所使用的ISP3斜面种子包括以下组分及含量：燕麦片2g/L、琼脂粉2g/L，溶剂为蒸馏水。种子培养基包括以下组分及含量：葡萄糖(C6H12O6·H2O)10.0g/L、蛋白胨6.0g/L、酵母提取物6.0g/L、酪蛋白水解物1.5g/L、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.25g/L、磷酸氢二钾(K2HPO4)1.0g/L，溶剂为蒸馏水，种子培养基的pH值为7.0。优化后的葡萄糖-甘油双碳源液体培养基包括以下组分及含量：葡萄糖15.0g/L、甘油10.0g/L、黄豆饼粉10.0g/L、酵母提取物6.0g/L、蛋白胨2.0g/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)5.0g/L、磷酸氢二钾(K2HPO4)5.0g/L、氯化钠(NaCL)5.0g/L、L-赖氨酸1.4g/L、硫酸亚铁(FeSO4)1.5g/L、硫酸镁(MgSO4·7H2O)2.5g/L，溶剂为蒸馏水。吸水链霉菌在发酵罐中进行发酵时，发酵前期控制为32小时，发酵前期待发酵8h后，向其中指数流加葡萄糖，控制比生长速率为0.02/h，所述的发酵中后期向发酵罐中恒速补加前体物，补加前体物包括以下组分和补料速率：莽草酸浓度为2g/L，补料速度为500mg/L·天，L-赖氨酸浓度为1g/L，补料速度为250mg/L·天。使用的缓冲液为浓度0.5mol/L的K2HPO4及0.5mol/L的KH2PO4构成的缓冲液。
实施例5
一种利用吸水链霉菌累积生产西罗莫司的方法，该方法包括以下步骤：取ISP3斜面种子用20wt％甘油洗脱孢子形成孢子悬浊液，按2wt％接种量将孢子悬浊液接种到种子培养基中，控制温度为30℃下活化培养60h，长成得到吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)，然后按接种量为6wt％将吸水链霉菌接种到发酵罐中，发酵罐初始采用的培养基为优化后的葡萄糖-甘油双碳源液体培养基，发酵前期为葡萄糖指数流加发酵，发酵中后期为前体物补料流加，用缓冲液控制pH稳定在5.7-6.3，培养得到西罗莫司。
其中，所使用的ISP3斜面种子包括以下组分及含量：燕麦片2g/L、琼脂粉2g/L，溶剂为蒸馏水。种子培养基包括以下组分及含量：葡萄糖(C6H12O6·H2O)15.0g/L、蛋白胨3.0g/L、酵母提取物3.0g/L、酪蛋白水解物2.5g/L、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g/L、磷酸氢二钾(K2HPO4)1.5g/L，溶剂为蒸馏水，种子培养基的pH值为6.5。
所述的优化后的葡萄糖-甘油双碳源液体培养基包括以下组分及含量：葡萄糖20.0g/L、甘油5.0g/L、黄豆饼粉5.0g/L、酵母提取物3.0g/L、蛋白胨3.0g/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)2.5g/L、磷酸氢二钾(K2HPO4)2.5g/L、氯化钠(NaCL)4.0g/L、L-赖氨酸2.0g/L、硫酸亚铁(FeSO4)2.0g/L、硫酸镁(MgSO4·7H2O)2.0g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然。吸水链霉菌在发酵罐中进行发酵时，发酵前期控制为32小时，发酵前期待发酵8h后，向其中指数流加葡萄糖，控制比生长速率为0.06/h，所述的发酵中后期向发酵罐中恒速补加前体物，补加前体物包括以下组分和补料速率：莽草酸浓度为4g/L，补料速度为500mg/L·天，L-赖氨酸浓度为2g/L，补料速度为250mg/L·天。使用的缓冲液为浓度0.5mol/L的K2HPO4及0.5mol/L的KH2PO4构成的缓冲液。
Claims (8)
1.一种利用吸水链霉菌累积生产西罗莫司的方法，其特征在于，该方法包括：取ISP3斜面种子用20wt％甘油洗脱孢子形成孢子悬浊液，按2wt％接种量将孢子悬浊液接种到种子培养基中，控制温度为30℃下活化培养60h，长成得到吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)，然后按接种量为6wt％将吸水链霉菌接种到发酵罐中，发酵罐初始采用的培养基为优化后的葡萄糖-甘油双碳源液体培养基，发酵前期为葡萄糖指数流加发酵，发酵中后期为前体物补料流加，用缓冲液控制pH稳定在5.7-6.3，培养得到西罗莫司。
2.根据权利要求1所述的一种利用吸水链霉菌累积生产西罗莫司的方法，其特征在于，所述的ISP3斜面种子包括以下组分及含量：燕麦片2g/L、琼脂粉2g/L，溶剂为蒸馏水。
3.根据权利要求1所述的一种利用吸水链霉菌累积生产西罗莫司的方法，其特征在于，所述的种子培养基包括以下组分及含量：葡萄糖(C6H12O6·H2O)10.0-15.0g/L、蛋白胨3.0-6.0g/L、酵母提取物3.0-6.0g/L、酪蛋白水解物1.5-2.5g/L、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.25-0.5g/L、磷酸氢二钾(K2HPO4)1.0-1.5g/L，溶剂为蒸馏水，种子培养基的pH值为6.5-7.5。
4.根据权利要求1所述的一种利用吸水链霉菌累积生产西罗莫司的方法，其特征在于，所述的优化后的葡萄糖-甘油双碳源液体培养基包括以下组分及含量：葡萄糖15.0-20.0g/L、甘油5.0-10.0g/L、黄豆饼粉5.0-10.0g/L、酵母提取物3.0-6.0g/L、蛋白胨2.0-3.0g/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)2.5-5.0g/L、磷酸氢二钾(K2HPO4)2.5-5.0g/L、氯化钠(NaCL)4.0-5.0g/L、L-赖氨酸1.4-2.0g/L、硫酸亚铁(FeSO4)1.5-2.0g/L、硫酸镁(MgSO4·7H2O)2.0-2.5g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然。
5.根据权利要求1所述的一种利用吸水链霉菌累积生产西罗莫司的方法，其特征在于，所述的发酵前期为发酵达到32小时，期间向发酵罐中指数流加葡萄糖，所述的发酵中后期向发酵罐中恒速补加前体物，用缓冲液调节发酵罐中的发酵液pH稳定在5.7-6.3。
6.根据权利要求5所述的一种利用吸水链霉菌累积生产西罗莫司的方法，其特征在于，所述的发酵前期待发酵8h后，指数流加葡萄糖，控制比生长速率为0.02-0.06/h。
7.根据权利要求5所述的一种利用吸水链霉菌累积生产西罗莫司的方法，其特征在于，所述的补加前体物包括以下组分和补料速率：莽草酸浓度为2-4g/L，补料速度为500mg/L·天，L-赖氨酸浓度为1-2g/L，补料速度为250mg/L·天。
8.根据权利要求1所述的一种利用吸水链霉菌累积生产西罗莫司的方法，其特征在于，所述的缓冲液为浓度0.5mol/L的K2HPO4及0.5mol/L的KH2PO4构成的缓冲液。
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2011
- 2011-06-07 CN CN201110151374XA patent/CN102229968A/zh active Pending
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