CN101280283B - 一种他克莫司的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体公开了一种培养吸水链霉菌(ACCC No.40417)的种子培养基和发酵培养基，以及新的他克莫司的生产方法。通过微生物发酵培养，调控发酵过程中溶氧的大小和底物的流加速率，来提高他克莫司的产量。最终他克莫司的终产量达到380mg/L，整个发酵过程操作简单，发酵液中发酵产物他克莫司的浓度高，通用性强，易推广，可以进行工业化生产。

Description

一种他克莫司的生产方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种大环内酯类强效免疫抑制剂他克莫司的生产方法。
背景技术
近十多年来，我国器官移植发展迅速，已跃居亚洲首位，世界第二。用于器官移植后减少排异反应的免疫抑制剂类药物也呈现快速的增长，普遍用于预防抑制排斥的免疫抑制剂是环孢菌素，但是其使用常常伴随着副作用。开发新型免疫抑制剂变得尤为需要，目前一种新型的免疫抑制剂他克莫司使用正日渐广泛。
他克莫司(Tacrolimus)又名FK-506，是由日本藤泽制药公司于1984年从土壤放线菌中提取的一种大环内酯类抗生素，具有较强的免疫抑制特性。其预防各种器官移植所出现的排斥反应的效果优于环孢菌素。他克莫司能减少肝肾移植受体的急、慢性排斥反应。用本品的患者，细菌和病毒感染率也较环孢素治疗者低，尤其是该药品有较强的亲肝性，对肝移植的功效比环孢素高100倍，因而大大降低了临床使用剂量，可降低原治疗费用1/3～1/2。FK-506和环孢菌素合用具有明显的协同作用，效果更好。他克莫司不仅可用于防止免疫反应的发生，还可用于治疗已发生的免疫反应及自身免疫性疾病，对防止器官移植的免疫反应和自身免疫性疾病的治疗具有重要意义。
目前有关他克莫司生产方法的报道不多，主要有美国专利US.4,894,366，US.4929611，US5,116,756，US5,264,355，US.5,496,727和US5,624,842。这些专利报道了用不同的链霉菌株生产他克莫司，产量不是很高，US5,116,756专利中提到的streptomycessp.MA6858和US5,624,842中提到的streptomyces tsukubaensis的他克莫司生产菌株，生产他克莫司的产量都很低，其发酵液中他克莫司的浓度最高只有37.8mg/L，导致工业化生产以后产品的成本很高，给患者造成沉重的负担。
CN1876822公开了一种用链霉菌(Streptomyces sp1908)CGMCC No.1288发酵生产他克莫司的方法，发明人利用其筛选的斜面培养基、种子培养基、发酵培养基培养后，获得了发酵单位为158mg/L的发酵液。
发明内容
本发明的目的在于提供一种培养吸水链霉菌(ACCC No.40417)的种子培养基和发酵培养基，同时提供了一种他克莫司新的生产方法，克服了他克莫司现有的生产技术的不足，提高了他克莫司的产量，从而为工业化生产提供了一种新的生产工艺。
本发明通过大量实验研究发现，培养吸水链霉菌的种子培养基的最优方案为可溶性淀粉2.5g/L；酵母粉1.5g/L；甘油2.5g/L；玉米浆干粉2.5g/L；花生粕2.5g/L；，K2HPO42.1g/L；MnCl20.0015g/L；ZnSO40.002g/L。培养吸水链霉菌的发酵培养基的最优方案为可溶性淀粉2.0g/L；酵母粉1.2g/L；甘油1.0g/L；玉米浆干粉2.5g/L；硫酸铵2.2g/L，K2HPO42.1g/L；MnCL20.002g/L；ZnSO40.001g/L。
他克莫司生产发酵过程中，主要分为两个阶段，前期(70小时)为菌体生长阶段，后期为他克莫司的表达阶段，不同阶段需氧量不同，所以需要在发酵生产过程中不断调节转速来控制溶氧，只有溶氧量控制在合适的范围内，才能保证菌体的大量生长，产物的大量合成。
另一方面，在发酵后期，菌体生长停止，目的产物开始合成，发酵中后期(120小时)，底物消耗殆尽，开始流加底物，控制底物的流加速率，保持发酵液中葡萄糖的浓度保持在3g/L左右，当发酵液中葡萄糖的浓度过低时，增加底物的流加速率，当发酵液中葡萄糖的浓度过高时，降低底物的流加速率甚至停止流加。
基于上述因素，本发明优选了最佳的他克莫司的生产方法，即在发酵培养吸水链霉菌(ACCC No.40417)菌株过程中，发酵温度控制在30℃，调节空气流量为0.5vvm，发酵罐转速为200rpm，在发酵4个小时后开始记录pH、溶氧及葡萄糖的浓度，在发酵12小时溶氧迅速降低，由初始的100％降到70％，提高转速20转，每间隔6个小时提高转速20转，直到发酵结束。发酵后期120小时之后，当葡萄糖的浓度低于2g/L时，开始流加底物，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物的流加速度，使葡萄糖的浓度控制在2g/L～3g/L之间直至发酵144h结束。
本发明为了提高他克莫司的发酵产量，在优化他克莫司培养基的同时，改进发酵工艺，发酵12h后，通过不断的提高转速来增加溶氧，发酵中后期，以底物在发酵液中的浓度变化为依据，控制底物的流加速率，这样减少了底物的反馈抑制，同时增加了终产物他克莫司的产量，使他克莫司的终产量达到380mg/L，整个发酵过程操作简单，发酵液中发酵产物他克莫司的浓度高，通用性强，易推广，工业化生产的成本小。
具体实施方式
实施例1、2为培养基的筛选方案，实施例3-6为发酵工艺的筛选方案。
实例1发酵培养基的筛选
分别配制摇瓶发酵培养基A，B，C，其中培养基组成如下：
A：可溶性淀粉2.0g/L；酵母粉1.2g/L；甘油1.0g/L；玉米浆干粉2.5g/L；硫酸铵2.2g/L，K2HPO42.1g/L；MnCL20.002g/L；ZnSO40.001g/L；pH 7.4；
B：可溶性淀粉2.0g/L；花生粉1.2g/L；甘油1.0g/L；玉米浆干粉2.5g/L；硫酸铵2.2g/L，K2HPO42.1g/L；MnCL20.002g/L；ZnSO40.001g/L；pH 7.4；
C：可溶性淀粉2.0g/L；酵母粉1.2g/L；葡萄糖1.0g/L；玉米浆干粉2.5g/L；硫酸铵2.2g/L，K2HPO42.1g/L；MnCL20.002g/L；ZnSO40.001g/L；pH 7.4；
将配制好的培养基20mL倒入500mL三角瓶内，于高压灭菌锅中120℃灭菌15分钟，冷却后接入吸水链霉菌(ACCC No.40417)，30℃培养6天，培养结束后，用高效液相色谱法测得每毫升发酵液中的他克莫司的浓度，结果见表1
表1三种发酵培养基的产物浓度
  摇瓶发酵培养基   产物浓度(mg/L)
  A   325
  B   265
  C   317
实例2种子培养基的筛选
分别配制种子培养基A，B，C，其中培养基组成如下：
A：可溶性淀粉2.5g/L；酵母粉1.5g/L；甘油2.5g/L；玉米浆干粉2.5g/L；花生粕2.5g/L；，K2HPO42.1g/L；MnCL20.0015g/L；ZnSO40.002g/L；pH 7.4；
B：可溶性淀粉2.5g/L；花生粉1.2g/L；甘油1.0g/L；玉米浆干粉2.5g/L；花生粕2.5g/L；K2HPO42.1g/L；MnCL20.0015g/L；ZnSO40.002g/L；pH 7.4；
C：可溶性淀粉2.0g/L；酵母粉1.2g/L；甘油2.5g/L；玉米浆干粉2.5g/L；K2HPO42.1g/L；MnCL20.0015g/L；ZnSO40.002g/L；pH 7.4；
将配制好的培养基20mL倒入500mL三角瓶内，于高压灭菌中120℃灭菌15分钟，冷却后接入吸水链霉菌(ACCC No.40417)，30℃培养3天。培养结束后，转接到实例1的培养基A中，30℃培养6天，用高效液相色谱法测得每毫升发酵液中的他克莫司的浓度，结果见表2。
表2三种种子培养基的产物浓度
  种子培养基   摇瓶产物浓度(mg/L)
  A   380
  B   365
  C   351
通过摇瓶试验，确定了最佳的种子和发酵培养基，种子培养基的最佳组成是可溶性淀粉2.5g/L；酵母粉1.5g/L；甘油2.5g/L；玉米浆干粉2.5g/L；花生粕2.5g/L；，K2HPO42.1g/L；MnCL20.0015g/L；ZnSO40.002g/L。发酵培养基的最佳组成是可溶性淀粉2.0g/L；酵母粉1.2g/L；甘油1.0g/L；玉米浆干粉2.5g/L；硫酸铵2.2g/L，K2HPO42.1g/L；MnCL20.002g/L；ZnSO40.001g/L。
实例3
菌种：吸水链霉菌(ACCC No.40417)
发酵方式：70L发酵罐，批次发酵
发酵过程：70L发酵罐，装液量50L，发酵温度控制在30℃，调节空气流量为0.5vvm，发酵罐转速为350rpm，在发酵4个小时后开始记录pH，溶氧和葡萄糖的浓度，并于发酵120小时后测定发酵产物他克莫司的浓度至发酵144h结束。
发酵结果：发酵结束后，测的他克莫司的浓度为250mg/L，底物葡萄糖的浓度为8g/L。pH由初始的7.4降为6.5，溶氧由初始的100％降至20％.
实例4
菌种：吸水链霉菌(ACCC No.40417)
发酵方式：70L发酵罐，批次流加发酵，在其他条件相同时，提高转速调节溶氧进行发酵试验。
发酵过程：70L发酵罐，装液量50L，发酵温度控制在30℃，调节空气流量为0.5vvm，发酵罐转速为200rpm，在发酵4个小时后开始记录pH，溶氧和葡萄糖的浓度，在发酵12小时溶氧迅速降低，由初始的100％降到70％，提高转速20转，每间隔6个小时提高转速20转，直到发酵结束。并于发酵120小时后测定发酵产物他克莫司的浓度至发酵144h结束。
发酵结果：发酵结束后，测得他克莫司的浓度为300mg/L，底物葡萄糖的浓度为6g/L。pH由初始的7.4降为6.5，溶氧由初始的100％降至60％。
实例5
菌种：吸水链霉菌(ACCC No.40417)
发酵方式：70L发酵罐，批次流加发酵，在其他条件相同时，通过测定葡萄糖的浓度流加底物进行发酵试验。
发酵过程：70L发酵罐，装液量50L，发酵温度控制在30℃，调节空气流量为0.5vvm，发酵罐转速为300rpm，在发酵4个小时后开始记录pH，溶氧和葡萄糖的浓度，并于发酵120小时后测定他克莫司的浓度，当葡萄糖的浓度低于2g/L时，开始流加底物，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物的流加速度，使葡萄糖的浓度控制在2g/L～3g/L之间直至发酵144h结束。
发酵结果：发酵结束后，测得他克莫司的浓度为350mg/L，底物葡萄糖的浓度为4g/L。pH由初始的7.4降为6.5，溶氧由初始的100％降至30％.
实例6
菌种：吸水链霉菌(ACCC No.40417)
发酵方式：70L发酵罐，批次发酵。在其他条件相同时，通过不断提高转速调节溶氧和通过测定葡萄糖的浓度流加底物进行发酵试验。
发酵过程：70L发酵罐，装液量50L，发酵温度控制在30℃，调节空气流量为0.5vvm，发酵罐转速为200rpm，在发酵4个小时后开始记录pH，溶氧和葡萄糖的浓度，在发酵12小时溶氧迅速降低，由初始的100％降到70％，提高转速20转，每间隔6个小时提高转速20转，直到发酵结束。发酵后期120小时之后，当葡萄糖的浓度低于2g/L时，开始流加底物，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物的流加速度，使葡萄糖的浓度控制在2g/L～3g/L之间直至发酵144h结束。
发酵结果：发酵结束后，测的他克莫司的浓度为380mg/L，底物葡萄糖的浓度为1g/L。pH由初始的7.4降为6.5，溶氧由初始的100％降至60％。

Claims (1)

1.一种发酵生产他克莫司的方法，包括种子培养和发酵培养，其特征在于：在发酵培养吸水链霉菌ACCC No.40417菌株过程中，调节空气流量为0.5vvm，发酵罐转速为200rpm，在发酵4个小时后开始记录pH、溶氧和葡萄糖的浓度，在发酵12小时后提高转速20转，之后每间隔6小时提高转速20转，直到发酵结束；发酵后期120小时之后，当葡萄糖的浓度低于2g/L时，开始流加底物，使葡萄糖的浓度控制在2g/L-3g/L之间直至发酵144h结束；
所述种子培养使用的种子培养基由可溶性淀粉2.5 g/L、酵母粉1.5g/L、甘油2.5g/L、玉米浆干粉2.5g/L、花生粕2.5g/L、K2HPO42.1g/L、MnCl20.0015g/L和ZnSO40.002 g/L组成；所述发酵培养的发酵培养基由可溶性淀粉2.0g/L、酵母粉1.2g/L、甘油1.0g/L、玉米浆干粉2.5g/L、硫酸铵2.2g/L、K2HPO42.1g/L、MnCl20.002g/L和ZnSO40.001g/L组成；
所述种子培养和发酵培养的温度控制在30℃。
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