CN112159826B

CN112159826B - 一种提高他克莫司产量的方法

Info

Publication number: CN112159826B
Application number: CN202010960749.6A
Authority: CN
Inventors: 付媛丽; 石慧; 蒋园佳; 金志敏
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang Hongsheng Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2020-09-14
Filing date: 2020-09-14
Publication date: 2022-05-24
Anticipated expiration: 2040-09-14
Also published as: CN112159826A

Abstract

本发明公开了一种高他克莫司产量的方法，所述方法为：将筑波链霉菌接种至含化感物质发酵培养基中，20‑30℃、200‑300r/min发酵培养，获得含他克莫司发酵液，将发酵液分离纯化，获得他克莫司；所述化感物质为补骨脂素、黄樟素；本发明利用植物化感物质对微生物的影响，在本发明的实验条件下，发酵产量提高至1980μg/mL，与现有方法比较，显著提高他克莫司产量，进而提高经济效益，并且操作简单。

Description

一种提高他克莫司产量的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种提高他克莫司产量的方法。

(二)背景技术

他克莫司(Tacrolimus)又名FK506，是从链霉菌属(streptomyces tsukubaensis)中分离出的发酵产物，其化学结构属23元大环内酯类抗生素。近年来，作为肝、肾移植的一线用药，已在日本、美国等14个国家上市。临床实验表明，其在心、肺、肠、骨髓等移植中应用有很好的疗效。同时FK506在治疗特应性皮炎(AD)、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性眼病等自身免疫性疾病中也发挥着积极的作用。

鉴于化学合成他克莫司的效率低、成本高的缺点，因此考虑采用微生物发酵法制备。邱观荣等采用单因素试验和正交试验研究发酵培养基组成，优化产他克莫司的发酵条件，优化后的发酵水平较原生产工艺提高60％以上。(邱观荣,张祝兰,严凌斌,等.Streptomyces Sp.FIM-16-06产他克莫司摇瓶发酵条件的优化[J].工业微生物,2019,49(1):8-13.))袁晖等研究核糖体工程育种方法结合紫外诱导处理产他克莫司链霉菌SIIA-9818，得到的突变株发酵单位显著提高，组分无明显变化，传代稳定，其发酵单位达到为918μg/mL。(袁晖，张新宜，王欣荣.抗性突变他克莫司高产菌株的选育[J].微生物学杂志,2014,34(5):81-86.)王会会等利用常压室温等离子体诱变技术得到他克莫司高产菌株，高产菌株在优化后的发酵条件下发酵单位达至997μg/mL。(王会会,秦丽娜,刘雨,等.常压室温等离子体诱变选育他克莫司高产菌株及发酵条件优化[J].中国抗生素杂志,2018,43(12):1488-1492.)

植物化感物质与微生物之间有着影响关系，能够改变微生物区系与活性，甚至对微生物群落和微生物多样性产生影响。如澳洲坚果根系分泌的黄酮类物作用质等还可促进真菌孢子的萌发、菌丝的生长和游动孢子的积聚。

本发明选择补骨脂素和黄樟素这两种化感物质，提高筑波链霉菌产他克莫司能力。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种提高他克莫司产量的方法，以补骨脂素和黄樟素两种化感物质混合加入发酵培养基，有效地提高筑波链霉菌合成他克莫司的单位产量，具有重要的应用价值，解决了发酵效率低的问题。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种提高他克莫司产量的方法，所述方法为：将筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)FCZ0311接种至含化感物质的发酵培养基中，20-30℃、200-300r/min(优选28℃、250r/min)发酵培养，获得含他克莫司发酵液，将发酵液分离纯化，获得他克莫司；所述化感物质为补骨脂素、黄樟素中的一种或两种的混合；所述发酵培养基组成：玉米淀粉42g/L，麦芽糖20g/L，果糖15g/L，葡萄糖28g/L，酵母粉16g/L，玉米浆6g/L，黄豆粉16g/L，CaCO₃ 6g/L，溶剂为无菌水，pH7.2。

进一步，所述一种化感物质加入量为0.1-1.0mg/mL，优选为0.3-0.6mg/mL。

进一步，所述化感物质优选为补骨脂素与黄樟素以质量比1:0.1-6的混合，优选1：1。

进一步，所述补骨脂素与黄樟素均以母液形式加入，所述母液按如下方法配制：用蒸馏水和吐温40以体积比10：1混合后作为溶剂，配置1mg/mL补骨脂素溶液或黄樟素溶液，并分别用0.8mol/L氢氧化钠水溶液调至中性(pH7.0)后，无菌过滤，取滤液，即为补骨脂素母液或黄樟素母液，保存在8℃条件下备用。

本发明所述补骨脂素和黄樟素结构式如下：

进一步，所述筑波链霉菌在发酵前，先进行斜面和种子扩大培养，具体为：将筑波链霉菌接种至斜面培养基，30℃培养8天，然后将新鲜的斜面孢子接种于种子培养基中，28℃、250r/min摇床培养24h后，按体积浓度5％接种量转接至发酵培养基；斜面培养基组成：玉米淀粉25g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.6g/L，MgSO₄·7H₂O 0.6，NaCl 0.06g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.6g/L，FeSO₄·7H₂O 0.2g/L，MnC1₂·7H₂O 0.2g/L，CaCO₃ 2g/L，琼脂20g/L，溶剂为无菌水，pH 7.0；种子培养基组成：玉米淀粉25g/L，葡萄糖15g/L，酵母粉15g/L，麦芽粉6g/L，蛋白胨6g/L，CaCO ₃ 2g/L，溶剂为无菌水，pH 7.2。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明利用植物化感物质对微生物的影响，将补骨脂素和黄樟素用于发酵产他克莫司，显著提高他克莫司产量，在发明条件下，发酵单位提高达至1980μg/mL，进而提高经济效益，并且操作简单。

(四)附图说明

图1为实施例1他克莫司高效液相色谱图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

应理解，这些实施例是本发明优选出的实施方案，仅用于具体说明。根据以上论述和这些实施例，本领域技术人员可确定本发明的必要特征，在不偏离于本发明的宗旨和技术范围内，可对本发明进行各种变化和修改，以使其适应各种用途和条件。

另外，各实施例中的“mg”为重量单位“毫克”；min为时间单位“分钟”；“mL”为体积单位“毫升”；“mg/mL”为浓度单位“毫克每毫升”；“r/min”为转速每分钟所旋转的圈；“μL”为体积单位微升。

实施例1

1、菌株孢子悬液

筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)FCZ0311购自上海一研生物科技有限公司。将筑波链霉菌FCZ0311接种至斜面培养基，30℃培养8天，获得斜面菌体；用无菌水洗脱斜面，将洗脱液移入组织研磨器中，充分研磨，用无菌漏斗将研磨过的孢子悬液过滤至EP管中待用，用蒸馏水调整菌体细胞浓度为10⁷～10⁸CFU/mL，即为孢子悬液。

斜面培养基组成：玉米淀粉25g/L，K₂HPO₄.3H₂O 0.6g/L，MgSO₄·7H₂O 0.6g/L，NaCl0.06g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.6g/L，FeSO₄·7H₂O 0.2g/L，MnC1₂·7H₂O 0.2g/L，CaCO₃ 2g/L，琼脂20g/L，溶剂为无菌水，pH 7.0。

2、补骨脂素母液：用蒸馏水和吐温40以体积比10：1混合后作为溶剂，配置1mg/mL补骨脂素溶液，并用0.8mol/L氢氧化钠水溶液调至中性(pH7.0)后，无菌过滤，取滤液，即为补骨脂素母液，保存在8℃条件下备用。

黄樟素母液：用蒸馏水和吐温40以体积比10：1混合后作为溶剂，配置1mg/mL黄樟素溶液，并用0.8mol/L氢氧化钠水溶液调至中性(pH7.0)后，无菌过滤，取滤液，即为黄樟素母液，保存在8℃条件下备用。

3、他克莫司的制备

表1中实施例1：将步骤1孢子悬液接种至斜面培养基(同步骤1)，30℃培养8天，然后将新鲜的斜面孢子接种于种子培养基中，28℃、250r/min摇床培养24h后，按体积浓度5％接种量转接至装有0.1mg/mL补骨脂素(以补骨脂素母液形式加入)的50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，28℃、250r/min发酵培养6天，取发酵液进行他克莫司产量测定。

种子培养基组成：玉米淀粉25g/L，葡萄糖15g/L，酵母粉15g/L，麦芽粉6g/L，蛋白胨6g/L，CaCO ₃ 2g/L，溶剂为无菌水，pH 7.2。

发酵培养基组成：玉米淀粉42g/L，麦芽糖20g/L，果糖15g/L，葡萄糖28g/L，酵母粉16g/L，玉米浆6g/L，黄豆粉16g/L，CaCO₃ 6g/L，溶剂为无菌水，pH 7.2。

空白组：以发酵培养基不添加补骨脂素和黄樟素为空白组，其发酵产量为190μg/mL。

对照组1：在发酵培养基加入异香豆素(表2)，其他同实施例1。

对照组2：在发酵培养基加入异黄樟素(表2)，其他同实施例1。

对照组3：异黄樟素和异香豆素同时加入发酵培养基(表2)，两种物质是同时按质量比例1:1加入，其他操作同实施例1。

表1中实施例2-15向发酵培养基中加入不同体积母液，使其终浓度如表1所示，其他操作同实施例1。

高效液相色谱检测条件：用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；ZORABAX SB-C8 3.0mm×150mm，3.5μm为色谱柱；以0.5％聚氧乙烯月桂醇醚的磷酸二氢钾溶液(取磷酸二氢钾6.8g，加0.5％聚氧乙烯月桂醇醚溶液1000ml使溶解，用10％磷酸调节P^H值至3.0)-乙腈(50:50)为流动相；柱温50℃；检测波长210nm；，流速1.2mL/min。

他克莫司产量测定：取发酵液作为样品，加入三倍体积的乙腈，置100ml量瓶中，再加上述0.5％聚氧乙烯月桂醇醚的磷酸二氢钾溶液至刻度，充分振荡、静置、离心，再精密取上清液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；结果见图1；以他克莫司标准品25mg置100ml量瓶中，加入乙腈50ml，超声助溶，使他可莫司溶解，再加入0.5％聚氧乙烯月桂醇醚的磷酸二氢钾溶液至刻度，采用样品检测条件测峰面积。根据样品峰面积/标准液峰面积×标准液浓度×样品稀释倍数计算他克莫司产量。

表1不同浓度补骨脂素或黄樟素对他克莫司产量的影响

表2不同浓度异香豆素或异黄樟素对他克莫司产量的影响

由表1和表2知，补骨脂素或者黄樟素加入发酵培养基，筑链霉菌产他克莫司能力增加。补骨脂素联合黄樟素加入发酵培养基，发酵产量最高达至1980μg/mL，说明这两种物质联合使用，效果更佳。而异香豆素和异黄樟素导致筑链霉菌产他克莫司能力减少。

以上所述仅为本发明的较佳实例，并不用以限制本发明，凡在本发明的原则之上所作的任何修改、替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种提高他克莫司产量的方法，其特征在于所述方法为：将筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)FCZ0311接种至含化感物质的发酵培养基中，20-30℃、200-300r/min发酵培养，获得含他克莫司发酵液，将发酵液分离纯化，获得他克莫司；所述化感物质为补骨脂素或黄樟素中的一种或两种以质量比1:0.1-6的混合；所述的补骨脂素、黄樟素或补骨脂素与黄樟素以质量比1:0.1-6的混合的加入量以发酵培养基体积计均为0.1-1.0mg/mL；所述发酵培养基组成：玉米淀粉42g/L，麦芽糖20g/L，果糖15g/L，葡萄糖28g/L，酵母粉16g/L，玉米浆6g/L，黄豆粉16g/L，CaCO₃ 6g/L，溶剂为无菌水，pH 7.2。

2.如权利要求1所述提高他克莫司产量的方法，其特征在于所述补骨脂素与黄樟素均以母液形式加入，所述母液按如下方法配制：用蒸馏水和吐温40以体积比10：1混合后作为溶剂，配置1mg/mL补骨脂素悬浮液或黄樟素悬浮液，并分别用0.8mol/L氢氧化钠水溶液调至中性后，无菌过滤，取滤液，即为补骨脂素母液或黄樟素母液。

3.如权利要求1所述提高他克莫司产量的方法，其特征在于所述筑波链霉菌FCZ0311在发酵前，先进行斜面和种子扩大培养：将筑波链霉菌FCZ0311接种至斜面培养基，30℃培养8天，然后将新鲜的斜面孢子接种于种子培养基中，28℃、250r/min摇床培养24h后，按体积浓度5％接种量转接至发酵培养基；斜面培养基组成：玉米淀粉25g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.6g/L，MgSO₄·7H₂O 0.6，NaCl 0.06g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.6g/L，FeSO₄·7H₂O0.2g/L，MnC1₂·7H₂O0.2g/L，CaCO₃ 2g/L，琼脂20g/L，溶剂为无菌水，pH 7.0；种子培养基组成：玉米淀粉25g/L，葡萄糖15g/L，酵母粉15g/L，麦芽粉6g/L，蛋白胨6g/L，CaCO₃ 2g/L，溶剂为无菌水，pH 7.2。