CN108165590B - 一种烟曲霉发酵产烟曲霉素的培养基及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种烟曲霉发酵产烟曲霉素的种子培养基及其发酵培养基，同时公开了一种烟曲霉发酵产烟曲霉素的方法，包括以下步骤：步骤一、将所述的烟曲霉接种于所述种子培养基进行菌种的活化，培养基pH值自然；步骤二、将活化的菌种制备单孢子菌悬液接种于所述发酵培养基，所述发酵培养基pH值自然，进行发酵培养，收集发酵液中的烟曲霉素。本发明针对影响烟曲霉素的碳源进行了筛选，意外发现使用甘油作为碳源可以避免胶霉毒素等副产物的产生，无需后续进行分离纯化，降低了生产成本，便于工厂大规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵工程的技术领域，尤其涉及一种烟曲霉发酵产烟曲霉素的培养基及培养方法。
背景技术
烟曲霉素是烟曲霉(Aspergillus fumigatus)发酵产生的一种重要的次级代谢产物。蜜蜂微孢子虫病是全球性疾病，它是由蜜蜂孢子虫寄生在蜜蜂肠上皮细胞所引起的寄生病，受到微孢子虫侵染的蜜蜂抵抗力变弱，常常引起蜜蜂感染多种病害如，马氏管变形虫病、慢性麻痹病、螺旋体病和白垩病等，一旦发生给养蜂人带来不可估量的经济损失。烟曲霉素是美国和加拿大等国家唯一承认并用于蜜蜂微孢子虫病防治的药物，使用烟曲霉素防治蜜蜂微孢子虫病，它虽不杀死蜜蜂微孢子虫，但能有效遏制微孢子虫的繁殖蔓延，从而整体上降低了蜂群的感染率，增加蜜蜂及幼虫的数量，减少蜂农的损失，提高效益。
烟曲霉素作为一种新兴的血管抑制剂，在人类医学上被用作抗癌抗肿瘤药物。烟曲霉素抑制血管再生的机制与烟曲霉素生物活性有关的甲硫氨酸氨基肽酶Ⅱ(Met AP-2)有关，其作用机理是:烟曲霉素及其类似物通过环己烷上的环氧化结构共价地绑定到真核细胞内的 Met AP-2 上的活性部位(组氨酸 His231)，导致酶结构被破坏，细胞内某些必要的蛋白修饰功能丧失，从而影响靶标生物体内的代谢过程。同时研究还发现以烟曲霉素作为基本骨架合成的烟曲霉醇等，不仅降低了烟曲霉素的毒性，同时也保留了烟曲霉素生物活性。合成的烟曲霉衍生物（TNP-470，PPI-2458，CKD-723)已用于治疗人类癌症的临床试验。烟曲霉素及其衍生物TNP-470和CKD-723的使用能减少患者体重、食量和脂肪量，从而有作为减肥药物的开发潜力。在药物开发上具有很高的潜在价值。
关于烟曲霉代谢生成烟曲霉素的培养方法，国内外很少有相关的报道。发酵生产存着易发酵、难获得，发酵过程不稳定等特点，使得烟曲霉素的开发利用一直都难以进行。公开号为CN106591389A的中国发明申请，公开了一种利用烟曲霉菌生产烟曲霉素的方法，包括如下步骤：将所述烟曲霉菌接种于GMM固体培养基进行菌种活化，所述GMM培养基pH值为5-7；将活化后的菌种孢子制备孢子悬液后接种于CYA固体培养基、CXMA固体培养基或LMM液体培养基，所述CYA固体培养基、所述CXMA固体培养基pH值自然，所述LMM液体培养基pH值调节为5-7，在25℃至37℃条件下培养；收集培养的烟曲霉菌提取烟曲霉素及烟曲霉素衍生物。该发明针对影响烟曲霉生长及烟曲霉素的碳氮源以及微量元素进行了筛选，并对相应的微量元素浓度进行优化，获得了相对较高的烟曲霉素产量。但是该发明不足之处是，如其说明书附图1，在最高峰fumagillin右侧还有明显的杂峰，说明有其他副产物的产生，后续还需对其分离纯化，增加了工艺难度。
有鉴于此，本发明人研究和设计了一种烟曲霉发酵产烟曲霉素的培养基及培养方法，本案由此产生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种烟曲霉发酵产烟曲霉素的培养基及培养方法。
为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：
一种烟曲霉发酵产烟曲霉素的种子培养基，每升所述种子培养基中包括以下质量体积比的组分：甘油22.0~50.0g/L，MgSO4·7H2O 0.1~0.5g/L，NaCl 10.0~20.0g/L，KH2PO40.1~0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.013g/L，CuSO4·5H2O 0.004g/L，CaCO3 1~5g/L，蛋白胨 10~30g/L，琼脂15~20g/L，余量为水。
一种烟曲霉发酵产烟曲霉素的发酵培养基，每升所述种子培养基中包括以下质量体积比的组分：甘油20~50 g/L，酵母提取粉1~10 g/L，MgSO4·7H2O 1~10 g/L，KCl 1~10 g/L，K2HPO4 5~30 g/L，FeSO4·7H2O 0.013 g/L，玉米粉1~20 g/L，余量为水。
一种烟曲霉发酵产烟曲霉素的方法，包括以下步骤：
步骤一、将所述的烟曲霉接种于所述种子培养基进行菌种的活化，培养基pH值自然；
步骤二、将活化的菌种制备单孢子菌悬液接种于所述发酵培养基，所述发酵培养基pH值自然，进行发酵培养，收集发酵液中的烟曲霉素。
作为实施例的优选方式，所述步骤一中，菌种的活化条件为：温度25~35℃，培养周期6~10天。
作为实施例的优选方式，所述步骤二中，采用摇瓶发酵的方式进行发酵，所述摇瓶发酵条件为：培养温度25~40℃，摇床转速80~200 rpm，玻璃珠0~20颗，接种量体积百分比0.5%~5%，玉米粉质量体积比1~20 g/L，装液量50mL/250 mL。
作为实施例的优选方式，所述摇瓶发酵的发酵培养温度为30℃，摇床转速180rpm；所述玻璃珠为直径6 mm，添加量为10颗；接种量体积百分比1%；整个发酵培养过程做遮光处理。
作为实施例的优选方式，所述步骤二中，采用5 L发酵罐的方式进行发酵，所述5 L罐发酵条件为：温度25~35℃，转速600~1000 rpm，氧气通量1~3 L/min，接种量体积百分比1.0~5.0%、玉米粉质量体积比1~20 g/L，pH值6~7。
作为实施例的优选方式，所述5L发酵罐的发酵培养温度为25~30℃，转速700~800rpm；发酵罐通气量为1~3 L/min；发酵罐接种量为2~4%。
采用本发明提供的培养方法和培养基配方，使得烟曲霉素的产量达到了90~150mg/L，本发明人在针对影响烟曲霉素的碳源进行筛选的过程中，意外发现使用甘油作为碳源可以避免胶霉毒素等副产物的产生，使得产物无需分离纯化，使得烟曲霉素防治蜜蜂微孢子虫病，烟曲霉素型新药物的开发有望实现，对烟曲霉素的规模化生产具有重要的意义。
附图说明
图1为本发明的使用甘油作为碳源的高效液相色谱图；
图2为本发明的使用葡萄糖作为碳源的高效液相色谱图；
图3为本发明的使用可溶性淀粉作为碳源的高效液相色谱图；
图4为本发明的使用蔗糖作为碳源的高效液相色谱图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明具体实施方式进行更加详尽的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及各方面的优点。然而，以下描述的具体实施例和实施方式仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。以下实施例中所述的方法和试验所用的试剂、材料，如无特殊声明，均为常规方法和实验室常见试剂。
实施例1
一种烟曲霉发酵产烟曲霉素的种子培养基，每升所述种子培养基中包括以下质量体积比的组分：甘油22.0~50.0g/L，MgSO4·7H2O 0.1~0.5g/L，NaCl 10.0~20.0g/L，KH2PO40.1~0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.013g/L，CuSO4·5H2O 0.004g/L，CaCO3 1~5g/L，蛋白胨 10~30g/L，琼脂15~20g/L，余量为水。
一种烟曲霉发酵产烟曲霉素的发酵培养基，每升所述种子培养基中包括以下质量体积比的组分：甘油20~50 g/L，酵母提取粉1~10 g/L，MgSO4·7H2O 1~10 g/L，KCl 1~10 g/L，K2HPO4 5~30 g/L，FeSO4·7H2O 0.013 g/L，玉米粉1~20 g/L，余量为水。其中：甘油，作为碳源；酵母提取粉，作为有机氮源；玉米粉，作为生长因子。
实施例2
一种烟曲霉发酵产烟曲霉素的方法，包括以下步骤：
步骤一、将所述的烟曲霉接种于所述种子培养基进行菌种的活化，培养基pH值自然；菌种的活化条件为：温度25~35℃，培养周期6~10天；
步骤二、将活化的菌种制备单孢子菌悬液接种于所述发酵培养基，所述发酵培养基pH值自然，进行发酵培养，收集发酵液中的烟曲霉素。采用摇瓶发酵的方式进行发酵，所述摇瓶发酵的发酵培养温度为30℃，摇床转速180 rpm；所述玻璃珠为直径6 mm，添加量为10颗；接种量体积百分比1%，玉米粉质量体积比1~20 g/L，装液量50mL/250 mL；整个发酵培养过程做遮光处理。
实施例3
一种烟曲霉发酵产烟曲霉素的方法，包括以下步骤：
步骤一、将所述的烟曲霉接种于所述种子培养基进行菌种的活化，培养基pH值自然；菌种的活化条件为：温度30℃，培养周期8天；
步骤二、将活化的菌种制备单孢子菌悬液接种于所述发酵培养基，所述发酵培养基pH值自然，进行发酵培养，收集发酵液中的烟曲霉素。采用5 L发酵罐的方式进行发酵，所述5 L罐发酵条件为：温度30℃，转速800rpm，氧气通量2 L/min，接种量体积百分比1%、玉米粉质量体积比1.7 g/L，pH值6.2。
采用甘油作为碳源，5 L发酵罐发酵培养烟曲霉素含量为90-150mg/L，如图1所示，通过高效液相色谱分析，检测器A为350nm，可以发现烟曲霉素峰值单一，不含其它副产物。
对比例1
一种烟曲霉发酵产烟曲霉素的方法，包括以下步骤：
步骤一、将所述的烟曲霉接种于如下所述种子培养基进行菌种的活化，培养基pH值自然；菌种的活化条件为：温度30℃，培养周期8天；
步骤二、将活化的菌种制备单孢子菌悬液接种于如下所述发酵培养基，所述发酵培养基pH值自然，进行发酵培养，收集发酵液中的烟曲霉素。采用5 L发酵罐的方式进行发酵，所述5 L罐发酵条件为：温度30℃，转速800rpm，氧气通量2 L/min，接种量体积百分比1%、玉米粉质量体积比1.7 g/L，pH值6.2。
所述种子培养基，每升所述种子培养基中包括以下质量体积比的组分：葡萄糖22.0~50.0g/L，MgSO4·7H2O 0.1~0.5g/L，NaCl 10.0~20.0g/L，KH2PO4 0.1~0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.013g/L，CuSO4·5H2O 0.004g/L，CaCO3 1~5g/L，蛋白胨 10~30g/L，琼脂15~20g/L，余量为水。
所述发酵培养基，每升所述种子培养基中包括以下质量体积比的组分：葡萄糖20~50 g/L，酵母提取粉1~10 g/L，MgSO4·7H2O 1~10 g/L，KCl 1~10 g/L，K2HPO4 5~30 g/L，FeSO4·7H2O 0.013 g/L，玉米粉1~20 g/L，余量为水。
采用葡萄糖作为碳源，5 L发酵罐发酵培养烟曲霉素含量为55-80 mg/L，如图2所示，通过高效液相色谱分析，检测器A为350nm，可以发现烟曲霉素峰附近还有其它峰，说明其含其它副产物。
对比例2
一种烟曲霉发酵产烟曲霉素的方法，包括以下步骤：
步骤一、将所述的烟曲霉接种于如下所述种子培养基进行菌种的活化，培养基pH值自然；菌种的活化条件为：温度30℃，培养周期8天；
步骤二、将活化的菌种制备单孢子菌悬液接种于如下所述发酵培养基，所述发酵培养基pH值自然，进行发酵培养，收集发酵液中的烟曲霉素。采用5 L发酵罐的方式进行发酵，所述5 L罐发酵条件为：温度30℃，转速800rpm，氧气通量2 L/min，接种量体积百分比1%、玉米粉质量体积比1.7 g/L，pH值6.2。
所述种子培养基，每升所述种子培养基中包括以下质量体积比的组分：可溶性淀粉22.0~50.0g/L，MgSO4·7H2O 0.1~0.5g/L，NaCl 10.0~20.0g/L，KH2PO4 0.1~0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.013g/L，CuSO4·5H2O 0.004g/L，CaCO3 1~5g/L，蛋白胨 10~30g/L，琼脂15~20g/L，余量为水。
所述发酵培养基，每升所述种子培养基中包括以下质量体积比的组分：可溶性淀粉20~50 g/L，酵母提取粉1~10 g/L，MgSO4·7H2O 1~10 g/L，KCl 1~10 g/L，K2HPO4 5~30g/L，FeSO4·7H2O 0.013 g/L，玉米粉1~20 g/L，余量为水。
采用可溶性淀粉作为碳源，5 L发酵罐发酵培养烟曲霉素含量为70-110 mg/L，如图3所示，通过高效液相色谱分析，检测器A为350nm，可以发现烟曲霉素峰附近还有其它峰，说明其含其它副产物。
对比例3
一种烟曲霉发酵产烟曲霉素的方法，包括以下步骤：
步骤一、将所述的烟曲霉接种于如下所述种子培养基进行菌种的活化，培养基pH值自然；菌种的活化条件为：温度30℃，培养周期8天；
步骤二、将活化的菌种制备单孢子菌悬液接种于如下所述发酵培养基，所述发酵培养基pH值自然，进行发酵培养，收集发酵液中的烟曲霉素。采用5 L发酵罐的方式进行发酵，所述5 L罐发酵条件为：温度30℃，转速800rpm，氧气通量2 L/min，接种量体积百分比1%、玉米粉质量体积比1.7 g/L，pH值6.2。
所述种子培养基，每升所述种子培养基中包括以下质量体积比的组分：蔗糖22.0~50.0g/L，MgSO4·7H2O 0.1~0.5g/L，NaCl 10.0~20.0g/L，KH2PO4 0.1~0.5g/L，FeSO4·7H2O0.013g/L，CuSO4·5H2O 0.004g/L，CaCO3 1~5g/L，蛋白胨 10~30g/L，琼脂15~20g/L，余量为水。
所述发酵培养基，每升所述种子培养基中包括以下质量体积比的组分：蔗糖20~50g/L，酵母提取粉1~10 g/L，MgSO4·7H2O 1~10 g/L，KCl 1~10 g/L，K2HPO4 5~30 g/L，FeSO4·7H2O 0.013 g/L，玉米粉1~20 g/L，余量为水。
采用蔗糖作为碳源，5 L发酵罐发酵培养烟曲霉素含量为58-90 mg/L，如图4所示，通过高效液相色谱分析，检测器A为350nm，可以发现烟曲霉素峰附近还有其它峰，说明其含其它副产物。
通过以上实施例及对比例可知，使用甘油作为碳源的培养基，可以减少副产物的产生，进而后续无需额外分离纯化，大大减少了生产成本，且产率高。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (8)
1.一种烟曲霉发酵产烟曲霉素的种子培养基，其特征在于：每升所述种子培养基中包括以下质量体积比的组分：甘油22.0~50.0g/L，MgSO4·7H2O 0.1~0.5g/L，NaCl 10.0~20.0g/L，KH2PO4 0.1~0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.013g/L，CuSO4·5H2O 0.004g/L，CaCO3 1~5g/L，蛋白胨 10~30g/L，琼脂15~20g/L，余量为水。
2.一种烟曲霉发酵产烟曲霉素的发酵培养基，其特征在于：每升所述发酵培养基中包括以下质量体积比的组分：甘油20~50 g/L，酵母提取粉1~10 g/L，MgSO4·7H2O 1~10 g/L，KCl 1~10 g/L，K2HPO4 5~30 g/L，FeSO4·7H2O 0.013 g/L，玉米粉1~20 g/L，余量为水。
3.一种烟曲霉发酵产烟曲霉素的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、将所述的烟曲霉接种于如权利要求1所述的种子培养基进行菌种的活化，培养基pH值自然；
步骤二、将活化的菌种制备单孢子菌悬液接种于如权利要求2所述的发酵培养基，所述发酵培养基pH值自然，进行发酵培养，收集发酵液中的烟曲霉素。
4.如权利要求3所述的一种烟曲霉发酵产烟曲霉素的方法，其特征在于：所述步骤一中，菌种的活化条件为：温度25~35℃，培养周期6~10天。
5.如权利要求3所述的一种烟曲霉发酵产烟曲霉素的方法，其特征在于：所述步骤二中，采用摇瓶发酵的方式进行发酵，所述摇瓶发酵条件为：培养温度25~40℃，摇床转速80~200 rpm，玻璃珠0~20颗，接种量体积百分比0.5%~5%，玉米粉质量体积比1~20 g/L，装液量50mL/250 mL。
6.如权利要求5所述的一种烟曲霉发酵产烟曲霉素的方法，其特征在于：所述摇瓶发酵的发酵培养温度为30℃，摇床转速180 rpm；所述玻璃珠为直径6 mm，添加量为10颗；接种量体积百分比1%；整个发酵培养过程做遮光处理。
7.如权利要求3所述的一种烟曲霉发酵产烟曲霉素的方法，其特征在于：所述步骤二中，采用5 L发酵罐的方式进行发酵，所述5 L发酵罐条件为：温度25~35℃，转速600~1000rpm，氧气通量1~3 L/min，接种量体积百分比1.0~5.0%、玉米粉质量体积比1~20 g/L，pH值6~7。
8.如权利要求7所述的一种烟曲霉发酵产烟曲霉素的方法，其特征在于：所述5L发酵罐的发酵培养温度为25~30℃，转速700~800 rpm；发酵罐通气量为1~3 L/min；发酵罐接种量为2~4%。
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