CN104987316B - 一种海洋真菌来源的聚酮类化合物及其治疗ii型糖尿病的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物化合物领域，具体公开了一种海洋真菌来源的聚酮类化合物及其制备方法和应用。所述聚酮类化合物的结构式如式（Ⅰ）所示。该化合物能显著抑制α‑葡萄糖苷酶的活性，其IC50值为9.05 ± 0.60 μM。酶动力学研究表明该化合物是典型的非竞争性抑制剂。因此，该化合物可用于制备α‑葡萄糖苷酶抑制剂药物，用于防治II型糖尿病。

Description

一种海洋真菌来源的聚酮类化合物及其治疗II型糖尿病的 应用
技术领域
本发明涉及药物化合物领域，具体涉及海洋真菌来源的药物化合物，更具体地，涉及一种海洋真菌来源的聚酮类化合物及其治疗II型糖尿病的应用。
背景技术
医药科学的发展和人类自我健康意识的增强，使人类在战胜疾病及维护自身健康方面有了极大的提高，但是对艾滋病、乙肝、肿瘤、老年痴呆和糖尿病等广泛、严重威胁人类健康的重大疾病，至今仍然缺乏根治的特效药物。海洋真菌由于其生长环境具有高压、高盐、缺氧等特殊性，为了适应这种不同于陆地的生境，形成了独特的代谢途径，进而为结构新颖、生理活性显著的各类次级代谢产物的产生提供了可能。目前，从包括海洋真菌在内的海洋微生物中寻找新的药源已成为国际国内研究的热点。
糖尿病是一种由于胰岛素分泌或作用缺陷而导致的慢性疾病。随着经济的进步，城市化进程的深入以及人类生活方式的改变，糖尿病将会成为一个巨大且越来越突出的问题。据国际糖尿病联盟最新评估显示，目前全球有3.82亿人患有糖尿病，至2035年患病人数将增加到5.92亿。所有国家-无论贫穷或富有，都正在经受糖尿病流行的影响。因此，针对该类重大疾病寻找和研发出新的，高效的，具有广谱性的药物具有必要性、紧迫性，并将产生巨大的社会效益。
α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类以延缓肠道碳水化合物吸收而达到治疗糖尿病的口服降糖药，其作用原理是：竞争性抑制位于小肠的各种α-葡萄糖苷酶，使分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，改善餐后血糖的高峰。研究证实，α-葡萄糖苷酶抑制剂可以防治餐后高血糖症和缓解高胰岛素血症，同时可以提高糖耐量。临床上，α-葡萄糖苷酶抑制剂用于治疗II型糖尿病。
发明内容
本发明的目的在于针对目前II型糖尿病治疗药物存在的缺陷，提供一种海洋真菌来源的聚酮类化合物。
本发明的另一个目的是提供一种海洋真菌来源的聚酮类化合物的制备方法。
本发明的在一个目的是提供一种海洋真菌来源的聚酮类化合物在制备治疗II型糖尿病药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种海洋真菌来源的聚酮类化合物，其结构式如式(Ⅰ)所示：
本发明的聚酮化合物是从海洋真菌曲霉Aspergillus sp.16-5B的发酵液中分离获得的；海洋真菌曲霉Aspergillus sp.16-5B于2015年4月6日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2015204。
优选地，所述聚酮类化合物的制备方法包括如下步骤：
S1.将海洋真菌曲霉Aspergillus sp.16-5B接入种子培养基，摇床培养，得到种子培养液；
S2.将种子培养液接入发酵培养基中，静置培养；
S3.将发酵产物过滤得到菌体，菌体用甲醇浸泡，减压浓缩，得到浸膏，再经层析分离，得到聚酮类化合物。
作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤S1所述种子培养基的组分为：葡萄糖35～40g，蛋白胨4～5g，酵母膏4～5g，海盐4～5g，水2L。步骤S1所述摇床培养是26～28℃下，摇床转速150～200rpm，培养时间为60～72h。
作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤S2所述发酵培养基的组分为硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾1g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。步骤S2所述静置培养的时间为28～30天，静置培养的温度为25～28℃。
作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤S3所述发酵物过滤得发酵液和菌体，菌体用体积为1：1的甲醇浸泡提取三次，提取液在低于50℃下浓缩至1L，浓缩液用体积比为1：1的乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液在低于50℃下减压浓缩得浸膏6.9g。该浸膏经硅胶柱层析进行分离，分别用0％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，100％的乙酸乙酯-石油醚梯度淋洗，其中40％乙酸乙酯-石油醚洗脱部分经葡聚糖Sephadex LH-20凝胶柱，用纯甲醇为洗脱剂进行洗脱，经多次重结晶得到该化合物(5.8mg)。
本发明分离得到的聚酮类化合物对α-葡萄糖苷酶具有显著地抑制作用，因此，可用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂。
因为α-葡萄糖苷酶是一类能够从含有α-葡萄糖苷键底物的非还原端催化水解α-葡萄糖基的酶，广泛分布于生物体中，参与食物消化、糖蛋白的生物合成，多糖及糖复合物的合成与分解代谢等许多生物过程，所以本发明分离得到的聚酮化合物可用于制备防治II型糖尿病药物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明从海南岛东寨港红树林国家自然保护区红树植物Sonneratia apetala的叶中分离获得一株真菌Aspergillus sp.16-5B，并从该菌株的发酵液中首次分离获得一种聚酮类化合物，本发明所述的聚酮类化合物来源于海洋真菌，从真菌提取分离的方法简单，成本低廉；而且，聚酮类化合物对α-葡萄糖苷酶具有显著抑制活性，应用前景广阔。
附图说明
图1为聚酮类化合物的α-葡萄糖苷酶抑制作用的双倒数酶动力学曲线。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
本发明的化合物，可以从海洋真菌Aspergillus sp.16-5B的发酵液中分离得到。海洋真菌Aspergillus sp.16-5B是从海南岛东寨港红树林国家自然保护区红树植物Sonneratia apetala的叶中分离得到。海洋真菌曲霉Aspergillus sp.16-5B菌株已于2015年4月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC M 2015204。
聚酮化合物的分离方法如下：
S1.种子培养：
S11.配制种子培养基：葡萄糖40g,蛋白胨4g，酵母膏4g，海盐5g，自来水2000mL，平均分装于8个500mL锥形瓶，121℃灭25分钟。
S12.种子的培养：将海洋真菌Aspergillus sp.16-5B的菌株接入种子培养基，在28℃的温度下，置摇床上以150rpm的转速，培养60小时得种子培养液。
S2.发酵培养：
S21.配制发酵培养基：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾1g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，121℃灭25分钟。
S22.发酵培养：
无菌操作下将种子液5mL接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于25℃静置培养30天。
S3.提取分离：
将步骤S2所得的发酵物离心获得菌体，菌体用体积比为1：1的甲醇浸泡提取三次，提取液在低于50℃下浓缩至1L，浓缩液用体积比为1：1的乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液在低于50℃下减压浓缩得浸膏12.6g。该浸膏经硅胶柱层析进行分离，分别用0％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，100％的乙酸乙酯-石油醚梯度淋洗，其中40％乙酸乙酯-石油醚洗脱部分，经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析，用体积比为1:1的甲醇-氯仿为洗脱剂进行洗脱，经多次重结晶得到式(Ⅰ)所示聚酮类化合物(5.8mg)。
实施例2
对实施例1中的化合物进行结构分析测试，得到以下理化性质数据：
白色粉末，熔点121.1-121.6℃(温度计未校正)，EI-MS(m/z)：372[M]+；HR-EI-MS(m/z)：372.1209[M]+(理论值372.1204)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ11.27(s,1H),6.58(dd,J＝15.8,6.7Hz,1H),6.28(dd,J＝15.8,1.4Hz,1H),6.16(s,1H),6.08(d,J＝1.8Hz,1H),6.03(d,J＝1.8Hz,1H),5.11(dd,J＝10.5,6.1Hz,1H),3.07(dd,J＝16.6,5.5Hz,1H),2.70(dd,J＝16.6,10.5Hz,1H),2.39(s,3H),1.83(d,J＝6.7Hz,3H),1.56(s,3H).
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ181.9,170.3,164.9,161.6,161.0,144.2,144.1,138.7,134.2,119.0,112.2,107.8,104.8,101.2,87.3,69.6,24.4,18.9,16.4
根据以上数据，得知聚酮类化合物的结构式如式(Ⅰ)所示：
实施例3
对实施例1中的化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制实验：
采用对硝基苯酚-α-葡萄糖苷(pNPG)为底物，在0.01M磷酸缓冲液(pH7.0)中进行。pNPG被α-葡萄糖苷酶酶解为对硝基苯酚，用紫外-可见分光光度计在400nm波长处测量其吸光度的变化而计算酶的活性。样品和阳性对照(阿卡波糖)均配成DMSO溶液(均为10μmol/mL)，酶和底物用0.01M磷酸缓冲液配成适宜浓度溶液，1mL初始反应体系内含0.1unit酶，60μL底物，20μL DMSO。取适量酶液，加入空白DMSO溶液或样品的DMSO溶液，混匀，37℃下，恒温20分钟，加入底物，混匀，立即在400nm波长处检测1min内体系的吸光度的变化值。用如下公式来计算酶活性：抑制率(％)＝[(B–S)/B]×100％，其中B为加空白DMSO时的吸光度变化值，S为样品的吸光度变化值。测定5个浓度的样品，绘制剂量—抑制率曲线，得出其IC50值。每个样品重复测定三次，结果用平均值±标准偏差表示。
结果测得该化合物对α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，其IC50为9.05±0.60μM。此外，3组抑制浓度下的抑制双倒数曲线显示，反应速度Vmax随抑制剂浓度增大而变小，而在不同抑制剂浓度下，α-葡萄糖苷酶的米氏常数(Km)保持不变，双倒数曲线交于横坐标上，是典型的非竞争性抑制动力学曲线(见图1)。

Claims (10)

1.一种海洋真菌来源的聚酮类化合物，其特征在于，其结构式如式（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）。
2.权利要求1所述聚酮类化合物的制备方法，其特征在于，聚酮化合物是从海洋真菌曲霉Aspergillus sp. 16-5B 的发酵液中分离获得的；海洋真菌曲霉Aspergillus sp. 16-5B 于2015年4月6日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2015204。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，聚酮化合物的制备方法包括如下步骤：
S1.将海洋真菌曲霉Aspergillus sp. 16-5B接入种子培养基，摇床培养，得到种子培养液；
S2.将种子培养液接入发酵培养基中，静置培养；
S3.将发酵产物过滤得到菌体，菌体用甲醇浸泡，减压浓缩，得到浸膏，再经层析分离，得到聚酮类化合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养基的组分为：葡萄糖35~40g，蛋白胨4~5g，酵母膏4~5g，海盐4~5g，水2L。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的组分为：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g， 氯化钾 1g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述摇床培养条件为：26~28℃下，摇床转速150~200rpm，培养时间为60~72h。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述静置培养的时间为28~30天，静置培养的温度为25~28℃。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S3所述菌体用体积为1：1的甲醇浸泡提取三次，提取液在低于50℃下浓缩至1L，浓缩液用体积比为1：1的乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液在低于50℃下减压浓缩得浸膏；该浸膏经硅胶柱层析进行分离，分别用0%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，100%的乙酸乙酯-石油醚梯度淋洗，其中40%乙酸乙酯-石油醚洗脱部分经葡聚糖Sephadex LH-20凝胶柱，用纯甲醇为洗脱剂进行洗脱，经多次重结晶得到聚酮类化合物。
9.权利要求 1 所述聚酮类化合物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
10.根据权利要求 9所述聚酮类化合物的应用，其特征在于，所述α-葡萄糖苷酶抑制剂用于防治II型糖尿病。
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