CN104311526B - 海洋真菌来源的联萘类衍生物及其制备方法与在抗结核中的应用 - Google Patents

海洋真菌来源的联萘类衍生物及其制备方法与在抗结核中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一类海洋真菌来源的联萘类衍生物及其制备方法和在抗结核中的应用。本发明联萘类化合物的结构式如式(I)所示。该化合物具有显著抑制结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶(mPTPB)的活性，其IC50值分别为4.24±0.41μM和4.32±0.60μM，该类化合物可用于新型抗结核药物的制备，应用前景广阔。

Description

海洋真菌来源的联萘类衍生物及其制备方法与在抗结核中的应用
技术领域
本发明涉及药物化合物领域，具体涉及一类源于海洋真菌的联萘类化合物及其制备方法，以及它们在作为抗结核药物中的应用。
背景技术
人类面临的众多问题中疾病的威胁尤为严重，上世纪开发的来源于真菌次生代谢产物的青霉素在对抗疾病、维护健康方面起了极为重要的作用。真菌的代谢产物具有抗菌、抗肿瘤、免疫调节、酶抑制等多种其它药用价值。海洋真菌由于其生长环境具有高压、高盐、缺氧等特殊性，为了适应这种不同于陆地的生境，形成了独特的代谢途径，进而为结构新颖、生理活性显著的各类次级代谢产物的产生提供了可能。目前，从包括海洋真菌在内的海洋微生物中寻找新的药源已成为国际国内研究的热点。
结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)是结核病的病原体，经呼吸道传播，主要感染肺部，其次在脑膜、颈淋巴和腹膜等也可能引起继发感染。感染后，结核结节干酪样坏死，形成空洞，临床上症状主要为：慢性低热、乏力、咳嗽、咯血等。对结核病机理的研究和针对特异靶点进行的抗结核新药的研制，不仅仅是一个科学问题，还是关系人类身体健康和经济发展速度的重大社会问题。由结核分枝杆菌分泌的酪氨酸磷酸酶(mPTPB)是结核分枝杆菌的重要毒力因子，是造成肺结核的重要原因。mPTPB被结核分枝杆菌分泌后进入巨噬细胞中，阻止宿主免疫系统的启动，调节杆菌在宿主中的存活。抑制结核杆菌分泌的mPTPB，可以阻止结核杆菌对宿主免疫产生抑制作用，有助于宿主对结核杆菌产生免疫，从而达到治疗结核病的目的。
本发明从一株海洋真菌中分离得到一类联萘类化合物，该化合物具有显著抑制结核杆菌酪氨酸磷酸酶(mPTPB)活性，在制备新型抗结核药物中具有良好的市场前景。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术的不足，提供一类源于海洋真菌的新的联萘类衍生物。
本发明的另一个目的是提供上述新的联萘衍生物的制备方法。
本发明的进一步目的是提供上述联萘衍生物在制备抗结核药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：
一类联萘类衍生物其结构式如(I)所示：
本发明联萘类衍生物的制备方法包括如下步骤：
(1)将海洋真菌曲霉Aspergillussp.HNY16-5C的菌株从斜面培养基中接入种子培养基，摇床培养，得到种子培养液(所述海洋真菌曲霉Aspergillussp.HNY16-5C的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏号为CCTCCM2012358，保藏日期为2012年9月19日)；
(2)将种子培养液接入发酵培养基中，静置培养；
(3)将发酵产物过滤得到菌体，菌体用甲醇浸泡，减压浓缩，得到浸膏，再经层析分离，得到联萘类衍生物1。
作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤(1)所述种子培养基的组分为：葡萄糖40g，蛋白胨4g，酵母膏4g，海盐5g，水2L。
作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤(2)所述发酵培养基的组分为：葡萄糖2000g，蛋白胨200g，酵母膏200g，海盐250g，水100L。
作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤(1)所述摇床培养条件为：转速200rpm，温度28℃，培养时间72h。
作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤(2)所述静置培养温度为25℃，培养时间为28天。
作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤(3)所述浸膏用硅胶柱层析进行分离，分离用5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、100％的乙酸乙酯/石油醚梯度淋洗。
作为一种优选方案，上述制备方法中，所述20％和30％乙酸乙酯--石油醚洗脱部分经过葡聚糖凝胶SephadexLH-20层析，洗脱剂为甲醇：氯仿＝1：1(体积比)，再多次重结晶，分别得到化合物1和2。
本发明联萘类化合物1和2对结核杆菌酪氨酸磷酸酶(mPTPB)有抑制作用，可用于制备抗结核药物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的联萘类化合物1和2来源于海洋真菌，从真菌提取分离的方法简单，成本低廉；联萘类化合物1和2对结核杆菌酪氨酸磷酸酶(mPTPB)有显著抑制活性，应用前景广阔。
具体实施方式
以下结合实施实例进一步解释本发明，但实施实例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1
本发明的化合物，可以从海洋真菌曲霉Aspergillussp.HNY16-5C的菌体中分离得到。海洋真菌曲霉Aspergillussp.HNY16-5C是从海南海口海域红树植物无瓣海桑S.apetala的叶子中分离得到。具体步骤如下：
1.种子培养：
(1)配制种子培养基：葡萄糖40g,蛋白胨4g，酵母膏4g，海盐5g，自来水2000mL，平均分装于8个500mL锥形瓶，121℃灭30分钟。
(2)种子的培养：将海洋真菌曲霉Aspergillussp.HNY16-5C的菌株接入种子培养基，在28℃的温度下，置摇床上以200rpm的转速，培养72小时得种子培养液。
2.发酵培养：
(1)配制发酵培养基：葡萄糖2000g，蛋白胨200g，酵母膏200g，海盐250g，自来水100L，121℃灭30分钟。
(2)发酵培养：
无菌操作将种子液5mL接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于25℃静置培养28天。
3.提取分离：
发酵物过滤得菌体，菌体用甲醇浸泡，浸泡液在低于50℃下减压浓缩得浸膏18.5g。该浸膏经硅胶柱层析进行分离，分别用5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，100％的乙酸乙酯-石油醚梯度淋洗，其中20％和30％乙酸乙酯--石油醚洗脱部分经SephadexLH-20凝胶柱，用甲醇--氯仿(1：1)为洗脱剂，反复层析和重结晶后分别得到化合物1和2。
实施例2
对实施例1中的化合物进行结构分析测试，得到以下理化性质数据：
化合物1：褐色粉末，熔点213-214℃(温度计未校正)，EI-MS(m/z)：364[M]+。
化合物2：褐色粉末，熔点213-214℃(温度计未校正)，EI-MS(m/z)：380[M]+。
化合物1和2的NMR数据见表1。
表1化合物1和2的NMR数据(125MHz/400MHz，TMS，ppm)
实施例3
对实施例1中的化合物1进行结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶(mPTPB)抑制实验：
采用对硝基苯基磷酸(pNPP)为底物，在50mM的3,3-二甲基戊二酸缓冲液(25℃，pH7.0)中进行。pNPP被mPTPB酶解为对硝基苯酚，用紫外—可见分光光度计在405nm波长处测量其吸光度的变化而计算酶的活性。反应初始体系200μL，其中包含5μL的酶、2.5mM的底物pNPP、不同浓度的抑制剂。反应开始5min后，立即加入50μL的NaOH(浓度为5mol/L)终止反应，然后转移200μL至96孔板中，测定405nm波长处的吸光值。
用如下公式来计算酶活性：抑制率(％)＝[(A0–A)/A0]×100％，其中A0空白对照的吸光度变化值，A为样品的吸光度变化值。测定5个浓度的样品，绘制剂量--抑制率曲线，得出其IC50值。每个样品重复测定三次，结果用平均值±标准偏差表示。
结果测得化合物1对结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶(mPTPB)具有抑制作用，其IC50分别为4.24±0.41μM和4.32±0.60μM。

Claims (7)

1.一类联萘类化合物的制备方法，联萘类化合物的结构式如式(Ⅰ)所示：
制备方法包括如下步骤：
(1)将海洋真菌曲霉(Aspergillussp.HNY16-5C)的菌株接入种子培养基，摇床培养，得到种子培养液；海洋真菌曲霉的保藏单位简称是CCTCC，保藏编号是NO:M2012358；
(2)将种子培养液接入发酵培养基中，静置培养；
(3)将发酵产物过滤得到菌体，菌体经过浸泡、减压浓缩，得到浸膏，再经层析分离，得到联萘类化合物。
2.根据权利要求1所述联萘类化合物的制备方法，其特征在于步骤(1)中，所述种子培养基的组分为：葡萄糖40g，蛋白胨4g，酵母膏4g，海盐5g，水2L。
3.根据权利要求1所述联萘类化合物的制备方法，其特征在于步骤(1)中，所述摇床培养是28℃下，摇床转速200rpm，培养时间为72h。
4.根据权利要求1所述联萘类化合物的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述发酵培养基的组分为：葡萄糖2000g，蛋白胨200g，酵母膏200g，海盐250g，水100L。
5.根据权利要求1所述联萘类化合物的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述静置培养的时间为28天，静置培养的温度为25℃。
6.根据权利要求1所述联萘类化合物的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述菌体用甲醇浸泡；所述浸膏用硅胶柱层析进行分离，分别用5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、100％的乙酸乙酯-石油醚梯度淋洗。
7.根据权利要求6所述联萘类化合物的制备方法，其特征在于所述20％和30％乙酸乙酯-石油醚洗脱部分经过葡聚糖凝胶SephadexLH-20层析，洗脱剂为甲醇：氯仿＝1：1体积比，再多次重结晶分别得到化合物1和2。
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