CN105352902A - 一种快速测定蝉花样品中多球壳菌素含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明意在提出一种新的针对蝉花中多球壳菌素含量的快速检测方法，虽然利用高效液相色谱(HPLC)可以较准确地检测出样品中多球壳菌素的含量，但是由于蝉花样品中多球壳菌素含量较低，譬如多糖、肽、氨基酸等其它一些复杂成分均会对其HPLC的检测造成较大干扰，故在进行HPLC前还需对蝉花提取液中的多球壳菌素进行分离纯化处理，从而导致整个实验步骤繁琐、耗时周期长，并且实验所需的仪器设备也较昂贵。我们已将所需的酵母生长标准曲线制作出供检测多球壳菌素所用。

Description

一种快速测定蝉花样品中多球壳菌素含量的方法
技术领域
虽然利用高效液相色谱(HPLC)可以较准确地检测出样品中多球壳菌素的含量，但是由于蝉花样品中多球壳菌素含量较低，譬如多糖、肽、氨基酸等其它一些复杂成分均会对其HPLC的检测造成较大干扰，故在进行HPLC前还需对蝉花提取液中的多球壳菌素进行分离纯化处理，从而导致整个实验步骤繁琐、耗时周期长，并且实验所需的仪器设备也较昂贵，上述这些因素都不利于检测蝉花中多球壳菌素技术的推广，最终也限制了更大地开发、利用蝉花市场价值的空间。
背景技术
蝉花(Cordycepscicadae)，又名蝉蛹草、蝉茸、冠蝉、胡蝉等，属虫生真菌，是我国传统的名贵中药材。它是由土中蝉的幼虫被虫草菌感染、寄生后死亡，真菌汲取幼虫尸体的营养从而形成的虫草菌丝体，当虫体内的菌丝体逐渐繁殖直至突破虫体长出类似花朵的“芽”，构成具有动、植物两种形态特征的虫体与菌丝复合体。由于蝉花在提高人体免疫力、抗疲劳、保肾、改善睡眠、抗肿瘤、保肝、抗辐射和明目等诸多方面均具有良好的效果，蝉花的药用价值和保健功效引起了人们的极大关注，当前市场上以蝉花为主要原料的药品及保健品也越来越多，多球壳菌素(Myriocin，ISP-1)作为蝉花中的重要活性成分，其含量的高低对于蝉花制品功效的发挥至关重要。同时蝉花中多球壳菌素的含量也可作为评判蝉花质量的标准。目前现有的检测蝉花中多球壳菌素的方法手段比较单一，主要是利用高效液相色谱(HPLC)对样品中的多球壳菌素含量进行检测。
发明内容
一种快速测定蝉花样品中多球壳菌素含量的方法，包括以下部分：
1、实验准备
(1)制备酵母YPD固体培养基
分别准确称取1g酵母提取物(yeastextract)、2g蛋白胨(peptone)、1.5g琼脂(agar)于250ml锥形瓶，加入90ml蒸馏水，用锡箔纸封口然后置于高压灭菌锅进行灭菌处理(121℃，20min)，待灭菌完成后再加入10ml已灭菌的20％D-葡萄糖(D-glucose)，最后趁热导入培养皿中，每个培养皿中20ml培养基，干燥后置于4℃冰箱待备用。
(2)制备酵母平板菌落
取BY4741(基因型：MATa；his3Δ1；leu2Δ0；met15Δ0；ura3Δ0)酵母的甘油菌2μl于1ml灭菌去离子水中并混合，然后取100μl混合液于900μl灭菌去离子水中并混合，吸取50μl的最终混合液涂布在(1)制备的YPD平板上，置于30℃培养箱中1～2天，待平板上的酵母单菌落长出。(适宜稀释倍数需参照甘油菌浓度)。
(3)制备酵母SDC液体培养基
按照下表的组分准确称取所需物质并加去离子水定容至1000ml，搅拌均匀后调pH至6.0，最后使用0.22μm的滤膜进行抽滤灭菌。
(4)制备多球壳菌素对照品溶液
配制多球壳菌素对照品母液：精确称取1mg多球壳菌素对照品并溶于1ml95％乙醇，振荡均匀使药品完全溶解。
配制多球壳菌素工作液：按照下表所示梯度浓度稀释母液
(5)制备蝉花样品提取液
提取方法可以选择超声提取法、加热回流提取法、浸泡提取法等多种方法，此次选择浸泡提取法，即准确称取2g蝉花纯粉样品于50ml锥形瓶，加入20ml95％乙醇，摇荡混匀并置于空气恒温摇床中48h(200rpm，30℃)。然后将料液离心(8000rpm，5min)，转移所得上清液即为蝉花样品浸泡提取液。
(6)制备植物鞘氨醇(PHS)母液
精确称取0.0016g植物鞘氨醇粉末于1.5mlEP管，加95％乙醇定容至1ml，溶解完全后即得5mM的PHS母液。
2、实验步骤
1.从长有BY4741菌落的YPD平板上挑取5个单克隆于盛有2mlSDC培养基的灭菌锥形瓶，将瓶口用锡箔纸包裹以防染菌，在200rpm，30℃的条件下过夜培养至饱和；
2.测饱和菌液的OD595nm值，并取一定体积的菌液于300mlSDC培养基，使起始OD595nm值为0.005，然后将之分到33个50ml灭菌三角瓶中，每瓶含9ml菌液，每11瓶为一次实验，共进行3次重复，并且每瓶分别加入下列药物，第一组：1ml95％乙醇(阴性对照组)；第二组：1ml梯度浓度的多球壳菌素对照品溶液(阳性对照组)；第三组：1ml样品浸泡提取液(实验样品测量组)；第四组：1ml样品浸泡提取液+10μl5mMPHS母液(实验样品验证组)；第五组：1ml3.5μg/ml多球壳菌素(拟合曲线测量组)；第六组：1ml3.5μg/ml多球壳菌素+10μl5mMPHS母液(拟合曲线验证组)；具体加药操作如下表所示：
3.将这些瓶子置于30℃空气摇床，200rpm培养。
4.在培养18h、24h、30h后利用分光光度计或酶标仪分别测每瓶菌液的OD595nm值，分别记录下来后用Excel、SPSS或Origin等统计软件进行数据分析(如表1、表2)。
3、实验结果、分析
因为多球壳菌素具有强免疫活性，可以通过抑制丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)活性发挥生物活性。而丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)作为胞内合成鞘酯的第一步酶，控制着胞内鞘酯水平，鞘酯水平关联胞内众多生理过程，其含量下降会抑制细胞生长。所以在酵母细胞生长时添加不同浓度的多球壳菌素会使细胞生长速度受到不同程度的阻滞。从表2数据可以印证上述理论，同时再额外添加植物鞘氨醇(鞘酯合成原料，SPT下游产物)可以完全恢复由于多球壳菌素对鞘酯合成抑制作用导致细胞生长速度减慢的趋势，从而证明实验中酵母细胞生长速度的减慢是由于添加多球壳菌素造成的。以OD值为横轴，多球壳菌素浓度为纵轴，选取阴性、阳性对照组检测出的OD平均值为坐标点分别按照药物不同处理时间进行曲线拟合，结果如图1所示。分别将拟合曲线验证组测得的OD值和实验样品测量组的OD值代入标准曲线方程计算多球壳菌素浓度并与准确浓度对比，如表3。表3中发现，通过拟合曲线方程计算出来的多球壳菌素理论浓度值与实际值均存在一定的差异，但是可以发现随着拟合曲线的拟合优度R^2与1不断接近，以及加药处理时间的延长，理论与实际差值在不断缩小，最终精度到达10ng/ml，实验结果比较理想。
该方法较原始方法(HPLC法)的优势在于简便、快速、高效，只需对原始样品进行简单粗提取，免去了复杂的分离纯化过程；而且可同时测定多个样品，数据结果输出快；整个实验所需器材及试剂均较便宜，这些优点都便于该法的推广、利用。
表1
表2
表3
附图说明
附图1为以芽殖酵母为实验材料绘制出的在加药后一定时间内多球壳菌素浓度与OD值关系的生长曲线，供快速测量多球壳菌素含量所用：以OD值为横轴，多球壳菌素浓度(ng/ml)为纵轴，选取阴性、阳性对照组检测出的OD平均值为坐标点分别按照药物不同处理时间(18h、24h、30h)进行曲线拟合，结果如图1所示，图中各点表现为相应时间节点内菌落平均OD值与多球壳菌素浓度的对应关系，图右下侧列出了绘制拟合曲线所计算出的函数关系式以及R2值以供参考。

Claims (2)

1.制备蝉花样品浸泡提取液的最佳料液比：蝉花(g)：95%乙醇(ml)（w/v）=1：10。
2.制作标准曲线时，多球壳菌素对照品浓度梯度的选择——0、100、200、300、400、500、600ng/ml以及检测OD值时间点的选择——18h、24h、30h；额外加入植物鞘氨醇的浓度——5μM。
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