CN105002251A - 一种芝麻抗菌肽制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于天然植物成分提取技术领域，涉及一种芝麻抗菌肽制备方法；先将干品芝麻粕先后加入乙酸乙酯和食用乙醇并分别加热搅拌并过滤，收集最后的滤渣晾干或烘干后加入氢氧化钠溶液加热搅拌再过滤，然后将滤渣重复上述步骤后提取，用盐酸水溶液调整提取液的PH值，后静置并收集固体物得芝麻蛋白固体，再将芝麻蛋白固体配成水溶液后分别加入中性蛋白酶和胃蛋白酶进行酶解，得到酶解液后离心取上清液，最后将上清液用聚醚砜分离膜进行过滤分离和膜分离，收集透过液后进行喷雾干燥，得到芝麻抗菌肽，其工艺路线设计合理，工艺条件简单易控，制备操作安全可靠，产品出率高，质量好，应用范围广，使用环境友好。

Description

一种芝麻抗菌肽制备方法

技术领域：

本发明属于天然植物成分提取技术领域，涉及一种芝麻抗菌肽制备方法，特别是一种以芝麻粕为原料经过科学工艺提取抗菌肽的技术方案。

背景技术：

抗菌肽的别名为宿主防御肽，是由基因编码的，存在于所有生物有机体中的一类先天免疫分子，是广泛存在于细菌、植物、软体动物、两栖动物、鱼类、鸟类和哺乳动物体内的一类小分子多肽,由20～60个氨基酸残基组成,具有广谱杀菌作用。与传统抗生素相比，抗菌肽具有明显的优点：一是不仅能杀灭细菌、真菌和病毒，而且对癌细胞也有一定的杀伤力；二是有很多的作用靶点，更有利于发挥效应；三是半衰期很短，且耐药性很强；四是可独立发挥作用，也可与其他因子一起协同作用。因此，抗菌肽作为一类抗菌能力强、抗菌谱广、种类多、可供选择的范围广的活性肽，在食品添加剂、生物饲料添加剂、医药等领域都有极其广阔的发展前景。

目前抗菌肽的生产制备方法和途径主要有三种:一是提取分离自然界生物体中本身所固有的各种天然抗菌肽类；二是通过水解蛋白质获得具有抗菌功能的活性肽，主要有酸水解法、碱水解法和酶水解法以及微生物发酵法；三是合成法制备生物活性肽，包括化学合成法、酶合成法和重组DNA技术合成法。由于抗菌肽在生物体内含量极微，从生物体内提取抗菌肽产量低、费时长、工艺复杂、费用昂贵，无法实现大规模生产；化学合成法是将带有氨基保护基的氨基酸的羧基端固定在水不溶性载体上，脱去该氨基酸上的氨基保护基，同下一个氨基酸的活化羧基缩合形成酰胺键，从而延长肽链形成多肽，但这类方法耗时大、副反应多且合成试剂毒性大，制约了产品的进一步应用；随着近几年生物技术的发展，重组DNA技术合成法取得了一定的成就，但通过基因工程的方法获得抗菌肽目前处于瓶颈状态，而人工合成抗菌肽成本高，且效果不及天然的抗菌肽，在临床上的应用受到限制；酸碱法水解蛋白存在产生有毒物质、化学污染等缺点。在现有技术的提取方法中，酶水解法和微生物发酵法由于水解温和且没有有机溶剂及有毒的化学品的残留已成为制备抗菌肽的最有应用前景的方法，这两种方法的原理均是采用蛋白酶将蛋白水解小分子的肽，酶水解法是在蛋白中直接加入商业用酶进行水解，微生物发酵法是利用微生物发酵生成的酶进行蛋白质的水解；虽然较酶水解法而言，发酵法可利用微生物发酵直接生产抗菌肽，减少了蛋白酶的纯化和制备过程，具有生产周期短、生产成本低的优势，但由于安全性问题，被FDA批准可用于食品开发的蛋白酶生产菌种是有限的，主要有米曲霉、黑曲霉、枯草芽孢杆菌等，在一定程度上限制了它的快速发展和应用；因此，酶水解法是目前制备抗菌肽最受推崇的方法。

芝麻(Sesamum indicm L.)属胡麻科胡麻属,是一种重要的油料种子作物，芝麻主要生长在热带地区，以及在北纬40°N和40°S之间的温带地区。在亚洲和非洲已种植了几个世纪。据统计，全世界芝麻产量是400万吨，其中亚洲占250万吨，非洲占13万吨，分别占全球总产量的60％和33％。芝麻在我国也被广泛种植,是我国四大油料作物之一，除直接食用外,芝麻大部分都用来榨油，榨油后副产物芝麻渣或饼粕中的蛋白质含量为38％～50％，是生物活性肽的良好来源；而芝麻饼粕主要当做饲料和肥料使用，我国每年约有50万吨的芝麻粕没有得到很好的利用，极大浪费了这一蛋白资源。因此，国内外多位学者对酶法制备芝麻活性肽进行了研究，如董英、KAKALI等用碱性蛋白酶或木瓜蛋白酶水解芝麻粕蛋白得到的芝麻肽具有抗氧化活性，日本科学家从芝麻蛋白的酶解产物中发现了降血压肽，并制成“芝麻多肽KM－20”产品正式上市销售，而关于芝麻抗菌肽的研究，国内外未见报道。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计一种芝麻抗菌肽制备方法，以芝麻饼粕蛋白为原料,选取双酶复合分步酶解技术水解芝麻饼粕蛋白,再经膜分离技术纯化制备芝麻抗菌肽，为芝麻饼粕的深加工开辟新途径，填补芝麻抑菌肽制备技术空白，不但使芝麻这一植物资源得到充分的综合利用，而且为人类提供更好的功能性食品和药品，创造良好的经济效益和社会效益。为了实现上述发明目的，本方法的具体工艺步骤包括：

(1)脱余脂：将榨取油脂后的干品芝麻粕以固液比为1:3的重量比例加入乙酸乙酯，在控温30～40℃条件下加热搅拌30～40mim后过滤，再在滤渣中以固液比1：2的重量比例加入重量百分比浓度为95％食用乙醇并在30～40℃控温条件下，继续加热搅拌30～40mim后过滤，收集滤渣即为脱余脂的芝麻粕，晾干或30～40℃下烘干备用；

(2)提取芝麻蛋白：将步骤(1)的滤渣干品中以固液比1：5的重量比例加入10^-5mol/L氢氧化钠溶液，在30～40℃下加热搅拌50～60mim进行提取后过滤，将滤渣重复上述步骤再进行提取两次，将三次提取液合并；用重量百分比浓度为0.01％的盐酸水溶液将提取液的pH调整到4.5，静置10小时后过滤，收集固体物并控温为40℃，压力为-0.07～-0.09Mpa真空度条件下干燥为固体，即为芝麻蛋白固体；

(3)分步复合酶解：将步骤(2)中的芝麻蛋白固体配成50g/L的水溶液，再加入13000～14000U/g蛋白的中性蛋白酶，在温度为60～70℃条件下酶解2h；随后用重量百分比浓度为0.01％的盐酸水溶液调整溶液的pH为4，再加入6000～7000U/g蛋白的胃蛋白酶，在55～60℃下酶解2h，然后将溶液的温度升高到85～95℃保持5min得到酶解液，离心取上清液；；

(4)膜分离：将步骤(3)的酶解上清液采用截留相对分子量1000Da的聚醚砜分离膜进行过滤分离，温度控制在30～40℃，压力控制为0.30～0.35MPa，流速为150～300ml/min，膜面积为50cm²，收集截留液；再将截留液采用截留相对分子量为2000Da的聚醚砜分离膜进行膜分离，控制压力为0.20～0.25MPa，流速控制在200～400ml/min，控制温度在30～40℃，收集透过液；

(5)喷雾干燥：将步骤(4)中膜分离的透过液，设定进口温度为130～150℃，出风温度为80～90℃，空压机压力为0.2～0.3Mpa，在常规设计中进行喷雾干燥，得到芝麻抗菌肽。

本发明制备的芝麻抗菌肽产品的抗菌肽含量大于98％；应用于食品和动物饲料的产品加工之添加原料；在肉制品加工过程中添加总重量为0.1～0.5％的剂量的抗菌肽,不仅能够控制细菌的生长,保持良好的风味和色泽,还能够降低其中亚硝酸盐的含量,减少产生危害人们健康的亚硝胺。

本发明与现有技术相比，其工艺路线设计合理，工艺条件简单易控，制备操作安全可靠，产品出率高，质量好，应用范围广，使用环境友好。

附图说明：

图1为本发明的具体实施工艺流程示意框图。

图2为本发明产品抑制金黄色葡萄球菌实验结果示意图，其中，1为pH 7缓冲溶液；2为5g/L芝麻蛋白对照溶液；3为复合酶对照溶液；4、5为10g/L芝麻肽测试溶液；6、7为25g/L芝麻肽测试溶液。

具体实施方式：

下面通过实施例并结合附图作进一步说明。

实施例1：芝麻抑菌肽制备

(1)脱余脂：将榨取油脂后的干品芝麻粕1000g加入3000g乙酸乙酯，在控温30～40℃条件下加热搅拌30～40mim后过滤，再在滤渣中加入重量百分比浓度为95％食用乙醇2000g，并在30～40℃控温条件下，继续加热搅拌30～40mim后过滤，收集滤渣即为脱余脂的芝麻粕，晾干或30～40℃下烘干备用，称取其重量为978.5g；

(2)提取芝麻蛋白：将步骤(1)的滤渣干品中以固液比1：5的重量比例加入10^-5mol/L氢氧化钠溶液，在30～40℃下加热搅拌50～60mim进行提取后过滤，将滤渣重复上述步骤再进行提取两次，将三次提取液合并；用重量百分比浓度为0.01％的盐酸溶液将提取液的pH调整到4.5，静置10小时后过滤，收集固体物并控温为40℃，压力为-0.07～-0.09Mpa真空度条件下干燥为固体，即为芝麻蛋白固体，称重为359.0g，测定其蛋白含量为85.18％；

(3)分步复合酶解：将步骤(2)中的芝麻蛋白固体配成50g/L的水溶液共7.18L，按照13500U/g蛋白的比例加入中性蛋白酶(酶活为4.9×10⁴U/g)99g，在温度为60～70℃条件下酶解2h；随后用重量百分比浓度为0.01％的盐酸溶液调整溶液的pH为4，按照6500U/g蛋白的比例再加入胃蛋白酶(酶活为1.3×10⁴U/g)179.5g，在55～60℃下酶解2h，然后将溶液的温度升高到85～95℃保持5min得到酶解液，离心取上清液；

(4)膜分离：将步骤(3)的酶解上清液采用截留相对分子量1000Da的聚醚砜分离膜进行过滤分离，温度控制在30～40℃，压力控制为0.30～0.35MPa，流速为150～300ml/min，膜面积为50cm²，收集截留液；再将截留液采用截留相对分子量为2000Da的聚醚砜分离膜进行膜分离，控制压力为0.20～0.25MPa，流速控制在200～400ml/min，控制温度在30～40℃，收集透过液；

(5)喷雾干燥：将步骤(4)中膜分离的透过液，设定进口温度为130～150℃，出风温度为80～90℃，空压机压力为0.2～0.3Mpa，在常规设计中进行喷雾干燥，得到芝麻抗菌肽，称取重量为119.2g，计算产品得率为11.92％。

实施例2：芝麻抗菌肽含量的测定

采用15％的三氯醋酸溶液将样品中大分子蛋白完全沉淀，同时小分子肽保留在该溶液中，除去蛋白沉淀，上清液按照GB/T5009.5-2003规定的方法测定总氮含量；其具体操作步骤如下：

1.样品处理：

精密称取1.000g左右样品，加15％的三氯乙酸并定容至50ml，充分摇匀，静置30mim，过滤，取上清液备用；

2.总氮含量的测定：

(1)消化

取5ml上清液，移入干燥的100ml定氮瓶中,加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20毫升硫酸，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上，置于通风的电炉上加热；待样品全部炭化，泡沫全都停止后，加大火力，使保持瓶内液体微沸，直到消化液由淡黄色变成透明淡蓝绿色后，然后再继续加热0.5小时；取下来冷却，小心加入20mL水；放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量蒸馏水润洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，定容备用取与处理样品相同量的硫酸、硫酸钾、硫酸铜按同一方法做试剂空白试验；

(2)蒸馏

首先将蒸馏器用蒸汽洗涤，然后进行消化样品和空白的蒸馏，向接收瓶内加入10.0mL硼酸溶液及1滴～2滴指示液，并使冷凝管的下端插入液面下，根据试样中氮含量，准确吸取2.0mL样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以5mL水洗涤小玻杯并使之流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞；将10ml 40％氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加入约3mL蒸馏水，同样缓缓放入反应室，留少量水在漏斗内作水封以防漏气，夹紧螺旋夹，开始蒸馏；蒸馏至吸收液的颜色由紫红色变为鲜绿色开始计时，继续蒸馏3-5分钟后，将冷凝管的下端移出锥形瓶的液面，再蒸馏1min以后，用少量蒸馏水冲洗冷凝管尖端，使冷凝管上不沾有任何反应液，停止蒸馏；

(3)滴定

馏出液立刻用盐酸标准滴定溶液滴定至终点，甲基红—溴甲酚绿指示剂，颜色由酒红色变成绿色，pH 5.1；记录盐酸的用量，同时吸取10.0ml试剂空白消化液作空白实验；

3.计算公式：

$X=\frac{(V_1-V_2)\×C\×0.0140}{M}\×N\×F\×100$

其中：

X——试样中蛋白质的含量，单位为g/100g；

V₁——样品消耗盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升(mL)；

V₂——试剂空白消耗盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升(mL)；

c——硫酸标准滴定溶液浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；

M——试样的质量，单位为克(g)；

F——氮换算为蛋白质的系数6.25；

N——稀释倍数；

4.测定结果：

空白组消耗的盐酸标准液为0.28mL，通过计算,得到芝麻肽含量为98.14％，测定数据见下表：

测定次数	1	2	3	平均值
					消耗盐酸的量(mL)	13.50	13.53	13.49	13.51
蛋白质含量(％)	98.09	98.31	98.01	98.14

实施例3：芝麻抑菌肽抑制金黄色葡萄球菌的活性测定

1.金黄色葡萄球菌菌种活化方法

制备营养琼脂斜面，在无菌环境中接种金黄色葡萄球菌，放入37℃培养箱培养18-24h，取出待用；

2.菌悬液的制备方法

在无菌环境下，挑取一环活化好的金黄色葡萄球菌，置于1ml经高压灭菌的生理盐水中，混匀，待用；

3.培养基平板制备

用无菌棉签蘸取上述菌悬液，在琼脂培养基平板上密集划线接种。盖好平皿，放置5min，待平板表面水分吸收后，用直径5mm无菌金属打孔器在平皿内打孔，除去洞内琼脂，备用；

4.样品测试溶液的配制

A pH 7缓冲溶液：取磷酸二氢钾0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液29.1ml，用水稀释至100ml，待用。；

B 25g/L芝麻肽测试溶液：准确称取2.5g芝麻肽，用pH7的缓冲溶液定容至100mL，待用；

C 10g/L芝麻肽测试溶液：准确称取1.0g芝麻肽，用pH7的缓冲溶液定容至100mL，待用；

D 50g/L芝麻蛋白对照溶液：准确称取5g芝麻蛋白，用pH7的缓冲溶液定容至100mL，待用；

E 复合酶对照溶液：在100mL pH 7缓冲溶液，加入中性蛋白酶(酶活为4.9×10⁴U/g)1.38g,在温度为60～70℃条件下酶解2h；随后用重量百分比浓度为0.01％的盐酸溶液调整溶液的pH为4，再加入胃蛋白酶(酶活为1.3×10⁴U/g)2.50g，在55～60℃下酶解2h，然后将溶液的温度升高到85～95℃保持5min，待用；

5.芝麻肽抑制金黄色葡萄球菌活性测定方法

将上述A～E测试溶液高压灭菌后，分别注满平板中的七个孔中；其中A、D、E样品各注入一孔，B和C分别各注入两孔做平行样品；随后将平板，放入37℃培养箱培养24h；取出平板，观察抑菌现象，测量抑菌圈直径大小；

6.芝麻肽抑制金黄色葡萄球菌活性测定结果

培养24h后的琼脂培养基的图片见附图2，从图中可以看出，做为对照实验的1、2、3均无抑菌现象，而4、5、6、7有抑菌现象；其中4、5为10g/L芝麻肽溶液，测量其抑菌圈直径平均值为11.5mm；6、7为25g/L芝麻肽测试溶液，测量其抑菌圈直径平均值为18.5mm；由此说明芝麻肽具有抑制金黄色葡萄球菌作用。

Claims (2)

1.一种芝麻抗菌肽制备方法，其特征在于具体工艺步骤包括：

(1)脱余脂：将榨取油脂后的干品芝麻粕以固液比为1:3的重量比例加入乙酸乙酯，在控温30～40℃条件下加热搅拌30～40mim后过滤，再在滤渣中以固液比1：2的重量比例加入重量百分比浓度为95％食用乙醇并在30～40℃控温条件下，继续加热搅拌30～40mim后过滤，收集滤渣即为脱余脂的芝麻粕，晾干或30～40℃下烘干备用；

(2)提取芝麻蛋白：将步骤(1)的滤渣干品中以固液比1：5的重量比例加入10^-5mol/L氢氧化钠溶液，在30～40℃下加热搅拌50～60mim进行提取后过滤，将滤渣重复上述步骤再进行提取两次，将三次提取液合并；用重量百分比浓度为0.01％的盐酸水溶液将提取液的pH调整到4.5，静置10小时后过滤，收集固体物并控温为40℃，压力为-0.07～-0.09Mpa真空度条件下干燥为固体，即为芝麻蛋白固体；

(3)分步复合酶解：将步骤(2)中的芝麻蛋白固体配成50g/L的水溶液，再加入13000～14000U/g蛋白的中性蛋白酶，在温度为60～70℃条件下酶解2h；随后用重量百分比浓度为0.01％的盐酸水溶液调整溶液的pH为4，再加入6000～7000U/g蛋白的胃蛋白酶，在55～60℃下酶解2h，然后将溶液的温度升高到85～95℃保持5min得到酶解液，离心取上清液；；

(4)膜分离：将步骤(3)的酶解上清液采用截留相对分子量1000Da的聚醚砜分离膜进行过滤分离，温度控制在30～40℃，压力控制为0.30～0.35MPa，流速为150～300ml/min，膜面积为50cm²，收集截留液；再将截留液采用截留相对分子量为2000Da的聚醚砜分离膜进行膜分离，控制压力为0.20～0.25MPa，流速控制在200～400ml/min，控制温度在30～40℃，收集透过液；

(5)喷雾干燥：将步骤(4)中膜分离的透过液，设定进口温度为130～150℃，出风温度为80～90℃，空压机压力为0.2～0.3Mpa，在常规设计中进行喷雾干燥，得到芝麻抗菌肽。

2.根据权利要求1所述的芝麻抗菌肽的制备方法，其特征在于制备的芝麻抗菌肽产品的抗菌肽含量大于98％；应用于食品和动物饲料的产品加工之添加原料；在肉制品加工过程中添加总重量为0.1～0.5％的剂量的抗菌肽，能够控制细菌的生长，保持风味和色泽，降低亚硝酸盐的含量，减少产生危害人们健康的亚硝胺。