CN106047839A - 用于提高真菌产β‑葡萄糖醛酸苷酶酶活的发酵培养基及方法 - Google Patents

用于提高真菌产β‑葡萄糖醛酸苷酶酶活的发酵培养基及方法 Download PDF

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CN106047839A CN201610245024.2A CN201610245024A CN106047839A CN 106047839 A CN106047839 A CN 106047839A CN 201610245024 A CN201610245024 A CN 201610245024A CN 106047839 A CN106047839 A CN 106047839A
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Abstract

本发明提供一种用于提高真菌产β‑葡萄糖醛酸苷酶酶活的发酵培养基及方法。该发酵培养基为马铃薯和水的煮沸物过滤所得滤液中加入促进剂和水所得的溶液，所述促进剂为甘草酸或其盐。利用本发明提供的发酵培养基和方法分别将产紫青霉(Penicillium purpurogenum)Li‑3、嗜松篮状菌(Talaromyces pinophilum)Li‑93、土曲霉(Aspergillus terreus)Li‑20和焦曲霉(Aspergillus ustus)Li‑62进行发酵产β‑葡萄糖醛酸苷酶的培养，发现上述各真菌发酵酶活单位与现有发酵方法所得相比提高了100‑600％，发酵时间提前了36‑60小时。因此，本发明提供的真菌产β‑葡萄糖醛酸苷酶的发酵培养基及方法具有操作简单、成本廉价、发酵酶活单位高、产酶时间短的特点。

Description

用于提高真菌产β-葡萄糖醛酸苷酶酶活的发酵培养基及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于提高真菌产β-葡萄糖醛酸苷酶酶活的发酵培养基及方法。
背景技术
β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase，EC：3.2.1.31)是一类能催化β-葡萄糖醛酸酸苷键水解的糖苷酶，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。β-葡萄糖醛酸苷酶最早被发现存在于人体和动物的各种组织和体液中，尤其在肝、脾和肾上腺中的含量较高，早期人们发现该酶与肿瘤的侵袭和转移有关，目前通过检测该酶在特定部位的水平已成为肿瘤诊断治疗的一种重要手段。此外基于该酶的水解特性，己有研究将该酶用于肿瘤酶解前体药导向治疗。很多抗肿瘤药物具毒性高，水溶性差，体内分布无靶向性等缺点，而将这些药物进行葡萄糖醛酸化修饰制成前体药物后，上述缺陷得到改善。利用该β-葡萄糖醛酸苷酶在肿瘤细胞和靶器官的高表达，使前体药物在到达作用部位后，再在该酶的作用下水解释放出原型药物并发生作用，提高药物治疗的效果，降低毒副作用。细菌来源的β-葡萄糖醛酸苷酶自发现以来已得到很好的应用。例如大肠杆菌来源的β-葡萄糖醛酸苷酶可水解底物形成荧光或有色物质，因此可利用这一特性检测饮用水或各种食品中大肠杆菌的污染。此外基于这一特性，β-葡萄糖醛酸苷酶常被作为报告基因，用于转基因生物标记和目的基因表达定位，成为相关科学研究工作的工具酶。
随着人们对天然化合物的认识和研究，进来国内外学者已利用β-葡萄糖醛酸苷酶水解甘草酸(Glycyrrhizin，GL)最外侧的β-1，2糖苷键生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸((Glycyrrhetinic acid monoglucuronide，GAMG))。GAMG的甜度是GL的5倍，是蔗糖的1000多倍，是一种低热度，高甜度的新型甜味剂。GAMG不仅和GL一样具有消炎、抗癌，抗肿瘤、抗变态、保肝护肝及增强细胞免疫调节的功效，而且由于其极性适中，易于透过细胞膜，生物利用度更高，生物安全性更好等优点被认为是甘草酸良好的替代品。甘草酸次酸(Glycyrrhetinic acid，GA)是甘草酸水解糖基与苷元连接的β-1，2糖苷键生成的不含糖基的化合物，其是甘草酸分子中主要的生物活性部分，它同样具有具有消炎、抗变态、保肝、治疗肝炎抑制肝癌、利尿、抗干扰素诱生剂及增强细胞免疫调节的功效。由于其为脂溶性，尤其适合添加到膏状等油性较强的化妆品中。研究表明甘草次酸不仅有良好的美白功能，而且结合其消炎的功能，能够起到润肤和清除氧自由基等多种功效而在化妆品领域中具有广泛应用。
目前已发现来自真菌的能转化GL的β-葡萄糖醛酸苷酶较多，例如发明专利申请201410088328.3记载的一株保藏号为CGMCC NO.5446的产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum Li-3)Li-3菌株，发明人发现的一株保藏号为CGMCC No.11765的嗜松篮状菌(Talaromyces pinophilum)Li-93菌株，文献“王小艳石河子大学硕士论文，2007”报道土曲霉(Aspergillus terreus)菌株Li-20和焦曲霉菌株(Aspergillus ustus)Li-62，它们都可以产生β-葡萄糖醛酸苷酶，可将GL转化成GAMG和/或GA，但是采用现有培养基对这些菌株进行发酵生产β-葡萄糖醛酸苷酶时存在所产酶活低，且产酶时间长等缺点从而限制了该酶的利用。
因此本领域亟需提供一种优化的菌株培养基及发酵方法，以提高发酵酶活，降低GAMG或GA的制备成本，从而使该酶能应用于实际生产中。
发明内容
基于本领域上述不足和需求，本发明提供一种提高上述真菌产β-葡萄糖醛酸苷酶酶活的发酵培养基及方法。该方法具有操作简单、低投入、高产出的优点，使β-葡萄糖醛酸苷酶发酵酶活得到大幅度提高。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种用于提高真菌产β-葡萄糖醛酸苷酶酶活的发酵产酶培养基，其包括在马铃薯和水的煮沸产物过滤所得滤液中，加入促进剂和水所得的溶液。
所述促进剂为甘草酸或其盐，它们可作为碳源被利用，在低浓度易利用碳源存在时，真菌为了利用甘草酸或其盐从而迫使自身产生大量β-葡萄糖醛酸苷酶水解甘草酸或其盐得到可利用的小分子葡萄糖醛酸或其盐。
所述马铃薯与所述溶液的质量体积比为1g：5～50mL。本发明所提供的发酵产酶培养基与现有普通培养基的区别之一是不含葡萄糖，由于真菌产β-葡萄糖醛酸苷酶时存在碳阻遏现象，容易利用的碳源大量存在时，抑制了真菌产β-葡萄糖醛酸苷酶。而常规马铃薯液体培养基中含有葡萄糖，且其马铃薯与水溶液的比例为1g：5mL，碳源过于丰富，不利于β-葡萄糖醛酸苷酶的产生，因此稀释1-10倍时，缓解了碳阻遏从而利于真菌产β-葡萄糖醛酸苷酶。
进一步地，所述促进剂在所述溶液中的浓度优选为0.5-10g/L，促进剂浓度过低时(<0.5g/L)，不易被真菌利用，浓度过高时(>10g/L)，增加了发酵产酶成本。
进一步地，所述促进剂具体为甘草酸单铵盐。甘草酸单铵盐比甘草酸的水溶解性好。
在本发明一些具体的实施例中，所述真菌选自由产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)菌株Li-3、嗜松篮状菌(Talaromyces pinophilum)菌株Li-93、土曲霉(Aspergillus terreus)菌株Li-20、焦曲霉菌株(Aspergillus ustus)Li-62构成的群组。
本发明还提供一种用于提高真菌产β-葡萄糖醛酸苷酶酶活的发酵产酶方法，该方法的步骤包括：采用所述的发酵产酶培养基对所述真菌的种子液进行发酵产酶培养。
在本发明的一些进一步的实施例中，所述步骤还包括，在发酵产酶培养之前，将所述真菌的孢子进行扩繁培养得到种子液。
在一些具体的实施例中，所扩繁培养的培养基优选为马铃薯和水的煮沸产物过滤所得滤液中加入葡萄糖和水所得的溶液；所述马铃薯与所述溶液的质量体积比为1g：5～50mL。与 常规马铃薯液体培养基(马铃薯与水溶液的比例为1g：5mL)相比，稀释了1-10倍，扩繁培养种子液时，其培养基成份需接近发酵产酶培养基，否则易导致产酶培养时的延滞期过长，增加了产酶培养时间，从而增加酶制备成本。
所述葡萄糖在所述溶液中的浓度为1-20g/L，葡萄糖浓度过低时，易导致种子液生物量过低，影响真菌产酶量；过高时，种子液培养结束后残余葡萄糖被带入发酵产酶培养过程中，使易利用碳源浓度过高，阻遏β-葡萄糖醛酸苷酶的产生。
在一些实施例中，具体地，所述发酵产酶培养的条件为：发酵温度15-35℃、振荡或搅拌速度为100-300rpm、发酵时间为24-168h。
在本发明一些具体的实施例中，所述真菌选自由产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)菌株Li-3、嗜松篮状菌(Talaromyces pinophilum)菌株Li-93、土曲霉(Aspergillus terreus)菌株Li-20、焦曲霉菌株(Aspergillus ustus)Li-62构成的群组。
本发明对上述提高产β-葡萄糖醛酸苷酶酶活的发酵培养基及对应的发酵方法进行了验证，发现发酵酶活单位与现有发酵方法所得相比提高了100-600％，发酵时间提前了36-60小时。由此可见，本发明提供的β-葡萄糖醛酸苷酶发酵方法具有操作简单、成本廉价、且发酵酶活单位高，产酶时间短的特点。
所述嗜松篮状菌(Talaromyces pinophilum)菌株Li-93的保藏信息如下：
菌种保藏名称：Li-93
保藏号：CGMCC No.11765
分类命名：嗜松篮状菌
拉丁名：Talaromyces pinophilum
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2015年11月30日
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
生物材料的来源及记载出处
本发明所用到的两株真菌：
产紫青霉(Penicillium purpurogenum)Li-3菌株记载于发明专利申请201410088328.3中，其保藏号为CGMCC No.5446；
嗜松篮状菌(Talaromyces pinophilum)Li-93菌株记载于发明人同日提交的另一篇发明专 利申请文件中，其保藏号为CGMCC No.11765，保藏信息如上所述。
土曲霉(Aspergillus terreus)菌株Li-20记载于文献：“王小艳石河子大学硕士论文，2007”
焦曲霉(Aspergillus ustus)菌株Li-62记载于文献：“王小艳石河子大学硕士论文，2007”。
本发明中催化GL仅生成GAMG的β-葡萄糖醛酸苷酶酶活定义：每分钟生成1nmolGAMG所需的酶量为一个活力单位(U)。
本发明中催化GL仅生成GA的的β-葡萄糖醛酸苷酶酶活定义：每分钟生成1nmol GA所需的酶量为一个活力单位(U)。
本发明中催化GL同时生成GAMG和GA的β-葡萄糖醛酸苷酶酶活定义：每分钟生成1nmol GA+GAMG所需的酶量为一个活力单位(U)。
实施例1、采用本发明1号发酵产酶培养基进行发酵产酶
将产紫青霉Li-3、嗜松篮状菌Li-93、土曲霉Li-20和焦曲霉Li-62分别进行发酵产酶培养，具体操作过程如下：
将产紫青霉Li-3、嗜松篮状菌Li-93、土曲霉Li-20和焦曲霉Li-62的孢子分别接于马铃薯葡萄糖液体培养基中，于30℃、200rpm的摇床上培养48h。然后以5％的接种量接入二级种子液培养基中，于30℃、200rpm的摇床上培养24h后得到上述各真菌的二级种子液。
二级种子液培养基：称取去皮马铃薯200g，加水800mL，煮沸30分钟左右，纱布过滤，加入1g葡萄糖，溶解后加水至2000mL，自然pH，121℃高温灭菌15min。
将上述各真菌的二级种子液以10％的接种量分别接入发酵产酶培养基中，于30℃、200rpm的摇床上培养48h时土曲霉Li-20达到最高酶活为13.21U/mg，培养60h时产紫青霉Li-3、嗜松篮状菌Li-93和焦曲霉Li-62达到最高酶活，分别为10.16U/mg，15.13U/mg和15.35U/mg，。
1号发酵产酶培养基制备方法：称取去皮马铃薯200g，加水800mL，煮沸30分钟左右，纱布过滤，向滤液中加入0.5g甘草酸单铵盐、溶解后加水至1000mL，自然pH，121℃高温灭菌15min。
实施例2、采用本发明2号发酵产酶培养基进行发酵产酶
将产紫青霉Li-3、嗜松篮状菌Li-93、土曲霉Li-20和焦曲霉Li-62分别进行发酵产酶培养，具体操作过程如下：
将产紫青霉Li-3、嗜松篮状菌Li-93、土曲霉Li-20和焦曲霉Li-62的孢子分别接于马铃薯葡萄糖液体培养基液培养基中，于30℃、200rpm的摇床上培养48h。然后以5％的接种量接入二级种子液培养基中，于30℃、200rpm的摇床上培养24h后得到上述各真菌的二级种子液。
二级种子液培养基：称取去皮马铃薯200g，加水800mL，煮沸30分钟左右，纱布过滤，加入5g葡萄糖，溶解后加水至2000mL，自然pH，121℃高温灭菌15min。
将上述各真菌的二级种子液以10％的接种量分别接入发酵产酶培养基中，于30℃、 200rpm的摇床上培养至36h时土曲霉Li-20达到最高酶活为16.34U/mg，培养至48h时产紫青霉Li-3、嗜松篮状菌Li-93和焦曲霉Li-62达到最高酶活，分别为14.13U/mg、19.47U/mg和20.42U/mg。
2号发酵产酶培养基制备方法：称取去皮马铃薯200g，加水800mL，煮沸30分钟左右，纱布过滤，向滤液中加入8g甘草酸单铵盐、溶解后加水至2000mL，自然pH，121℃高温灭菌15min(此培养基中马铃薯与溶液的质量体积比为：1g：10ml)。
实施例3、采用本发明3号发酵产酶培养基进行发酵产酶
将产紫青霉Li-3、嗜松篮状菌Li-93、土曲霉Li-20和焦曲霉Li-62分别进行发酵产酶培养，具体操作过程如下：
将产紫青霉Li-3、嗜松篮状菌Li-93、土曲霉Li-20和焦曲霉Li-62的孢子分别接于马铃薯葡萄糖液体培养基液培养基中，于30℃、200rpm的摇床上培养48h。然后以5％的接种量接于二级种子液培养基中，于30℃、200rpm的摇床上培养24h后得到上述各真菌的二级种子液。
二级种子液培养基制备方法：去皮马铃薯200g，加水1000mL，煮沸30分钟左右，纱布过滤，加入8g葡萄糖，溶解后加水至5000mL，自然pH，121℃高温灭菌15min。
将上述各真菌的二级种子液以10％的接种量接入发酵产酶培养基中，于30℃、200rpm的摇床上培养至36h时产紫青霉Li-3、嗜松篮状菌Li-93和土曲霉Li-20达到最高酶活，分别为16.54U/mg、23.75U/mg和15.43U/mg，培养至48h时焦曲霉Li-62达到最高酶活为18.81U/mg。
3号发酵产酶培养基的制备方法：称取去皮马铃薯200g，加水800mL，煮沸30分钟左右，纱布过滤，向滤液中加入25g甘草酸单铵盐、溶解后补足水至5000mL，自然pH，121℃高温灭菌15min。
实施例4、采用本发明4号发酵产酶培养基进行发酵产酶
将产紫青霉Li-3、嗜松篮状菌Li-93、土曲霉Li-20、和焦曲霉Li-62分别进行培养及发酵产酶，具体操作过程如下：
将上述各菌的孢子分别接于马铃薯葡萄糖液体培养基液培养基中，于30℃、200rpm的摇床上培养48h。然后以5％的接种量接于二级种子液培养基中，于30℃、200rpm的摇床上培养24h后得到上述各真菌的二级种子液。
二级种子液培养基制备方法：去皮马铃薯200g，加水1000mL，煮沸30分钟左右，纱布过滤，加入8g葡萄糖，溶解后加水至5000mL，自然pH，121℃高温灭菌15min。
将上述各真菌的二级种子液以10％的接种量接入发酵产酶培养基中，于30℃、200rpm的摇床上培养至36h时，嗜松篮状菌Li-93和土曲霉Li-20达到最高酶活，分别为19.22U/mg和14.02U/mg；培养至48h时，产紫青霉Li-3和焦曲霉Li-62达到最高酶活，分别为14.50U/mg和15.73U/mg。
发酵产酶培养基制备方法：称取去皮马铃薯200g，加水800mL，煮沸30分钟左右，纱布 过滤，向滤液中加入100g甘草酸单铵盐、溶解后补足水至10000mL，自然pH，121℃高温灭菌15mi。
实施例1-4中的甘草酸单铵盐也可以用甘草酸或其它甘草酸盐代替。
对比例1、以改良察氏培养基为发酵产酶培养基
由于真菌产β-葡萄糖醛酸苷酶时具有碳代谢阻遏现象，在葡萄糖、蔗糖等优先碳源存在的情况下，即使添加甘草酸单铵盐为诱导剂所产β-葡萄糖醛酸苷酶的酶活也极低。因此本对比例展示的是最初选择以甘草酸单铵盐为单一碳源的改良察氏培养基为发酵产酶培养基生产β-葡萄糖醛酸苷酶的方法：
将产紫青霉菌株Li-3、嗜松篮状菌株Li-93、土曲霉Li-20和焦曲霉Li-62的孢子分别接于一级种子液培养基中，于30℃、200rpm的摇床上培养72h。然后以5％的接种量接于二级种子液培养基中，于30℃、200rpm的摇床上培养24h，得到上述各真菌的二级种子液。
一级种子液和二级种子液培养基为：NaNO3 3g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，葡萄糖5g/L，自然pH。
将上述各真菌的二级种子液以10％的接种量接入发酵产酶培养基中，于30℃、200rpm的摇床上培养至60h时，土曲霉Li-20达到最高酶活为4.10U/mg；培养至72h时，嗜松篮状菌Li-93和焦曲霉Li-62达到最高酶活，分别为5.92U/mg和6.45U/mg；培养至84h时，产紫青霉Li-3达到最高酶活2.31U/mg，
发酵产酶培养基(改良察氏培养基)：甘草酸单铵盐3g/L，NaNO3 3g/L，K2HPO4 1g/L，KCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，Fe2SO4·7H2O 0.01g/L，pH 5.0
对比例2、以马铃薯葡萄糖液体培养基为发酵产酶培养基
将产紫青霉Li-3、嗜松篮状菌Li-93、土曲霉Li-20和焦曲霉Li-62的孢子分别接于马铃薯葡萄糖液体培养基中，于30℃、200rpm的摇床上培养48h。然后以10％的接种量接于发酵产酶培养基中，于30℃、200rpm的摇床上培养至84h时，土曲霉Li-20达到最高酶活为7.86U/mg，培养至96h时产紫青霉Li-3、嗜松篮状菌Li-93和焦曲霉Li-62达到最高酶活，分别为7.83U/mg，10.32U/mg和9.24U/mg。
本对比例中用到的发酵产酶培养基为本领域常用的发酵培养基：马铃薯葡萄糖液体培养基中添加5g/L的甘草酸单铵盐制成的培养基。
所述马铃薯葡萄糖液(固)体培养基制备方法如下：
称取去皮马铃薯200g，加水800mL，煮沸30分钟左右，纱布过滤，向滤液中加入20g葡萄糖、溶解后补足水至1000mL，自然pH，若制成固体培养基则向其中加入20g琼脂，121℃高温灭菌15-20min(此培养基中马铃薯与溶液的质量体积比为，1g：5ml)。
对比结果分析：
上述实施例1-4与对比例1-2的对比结果如下表1所示，可以看出本发明提供的1-4号发酵培 养基的产酶效果显著优于对比例1-2的现有培养基。尤其是，实施例3中以不含葡萄糖的马铃薯液体培养基稀释5倍加甘草酸单铵盐制成发酵产酶培养基时，产紫青霉Li-3菌株和嗜松篮状菌Li-93菌株发酵所得β-葡萄糖醛酸苷酶单位酶活分别比对比例1中以改良察氏培养基做为发酵培养基和对比例2中以马铃薯葡萄糖液体培养基加甘草酸单铵盐作为发酵产酶培养基时分别提高了616.02％和111.24％，301.18％和130.14％；实施例2中的土曲霉Li-20和焦曲霉Li-62产β-葡萄糖醛酸苷酶单位酶活分别比对比例1和对比例2中分别提高了298.54％和107.89％，216.59％和121.00％，且本发明提供的培养基和发酵方法使上述各真菌达到最高酶活的时间比后两者提前了36-60小时。
表1：本发明提供的发酵产酶培养基和现有培养基的产酶效果比较

Claims (9)

1.用于提高真菌产β-葡萄糖醛酸苷酶酶活的发酵产酶培养基，其特征在于，包括在马铃薯和水的煮沸物过滤所得滤液中，加入促进剂和水所得的溶液；
所述促进剂为甘草酸或其盐；
所述马铃薯与所述溶液的质量体积比为1g：5～50mL。
2.根据权利要求1所述的发酵产酶培养基，其特征在于，所述促进剂在所述溶液中的浓度为0.5-10g/L。
3.根据权利要求1或2所述的发酵产酶培养基，其特征在于，所述促进剂为甘草酸单铵盐。
4.根据权利要求1-3任一所述的发酵产酶培养基，其特征在于，所述真菌选自由产紫青霉(Penicillium purpurogenum)菌株Li-3、嗜松篮状菌(Talaromyces pinophilum)菌株Li-93、土曲霉(Aspergillus terreus)菌株Li-20、焦曲霉菌株(Aspergillus ustus)Li-62构成的群组。
5.用于提高真菌产β-葡萄糖醛酸苷酶酶活的发酵产酶方法，其特征在于，包括：采用权利要求1-3任一所述的发酵产酶培养基对所述真菌的种子液进行发酵产酶培养。
6.根据权利要求5所述的发酵产酶方法，其特征在于，还包括，在发酵产酶培养之前，将所述真菌的孢子进行扩繁培养得到种子液。
7.根据权利要求6所述的发酵产酶方法，其特征在于，所述扩繁培养的培养基为马铃薯和水的煮沸产物过滤所得滤液中加入葡萄糖和水所得的溶液；所述马铃薯与所述溶液的质量体积比为1g：5～50mL；所述葡萄糖在所述溶液中的浓度为1-20g/L。
8.根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于，所述发酵产酶培养的条件为：发酵温度15-35℃、振荡或搅拌速度为100-300rpm、发酵时间为24-168h。
9.根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于，所述真菌选自由产紫青霉(Penicillium purpurogenum)菌株Li-3、嗜松篮状菌(Talaromyces pinophilum)菌株Li-93、土曲霉(Aspergillus terreus)菌株Li-20、焦曲霉菌株(Aspergillus ustus)Li-62构成的群组。
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