CN102453015B - 一种Azaphilone类衍生物及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及式A所示的Azaphilone类衍生物及其制备和应用。具体是将团青霉Penicillium commune QSD-17(以下简称QSD-17)经液体培养基发酵培养30天，发酵产物经提取、分离获得。本发明涉及的三个Azaphilone类衍生物能够有效抑制多种细菌的生长，可用作制备抗细菌的药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术，具体的说是一种由团青霉Penicillium commune分离的Azaphilone类衍生物及其制备和应用。
背景技术
微生物是生物制药的重要来源，从微生物中寻找活性代谢产物是获得新的抗菌药物的一个重要途径。自从弗莱明发明了青霉素(penicillin)以来，从微生物中发现了很多结构新颖而且活性显著的化合物，很多已经成为药物或在临床研究当中。Azaphilone类衍生物具有很好的抗菌活性(Shu-Wei Yang etal.，J.Antibiot.，2006，59，720-723)
发明内容
本发明目的在于，提供一种Azaphi lone类衍生物及其制备和应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
Azaphilone类衍生物如式A中1、2、3所示，
Azaphilone类衍生物的制备方法，按如下步骤：
1)将团青霉(Penicillium commune)于PDA培养基以20-35℃培养4-7天作为菌种，待用；
2)将步骤1)所得菌种接种于PDB培养基中，以20-35℃静置发酵培养30-35天；发酵产物过滤得发酵液和菌丝体两部分；发酵液用乙酸乙酯萃取，然后将乙酸乙酯蒸干得提取物I；菌丝体用过量的甲醇浸泡，然后将甲醇蒸干后得菌丝体提取物II；合并上述提取物I和提取物II得总提取物，待用；
3)将步骤2)中所得总提取物用氯仿-甲醇溶解，然后用硅胶柱进行色谱分离，分离时依次采用梯度为体积1∶0至0∶1的石油醚-乙酸乙酯和梯度为20∶1至1∶1的氯仿-甲醇洗脱液洗脱；
4)收集步骤3)中梯度为3∶1至1∶1的石油醚-乙酸乙酯的洗脱组分，将洗脱下的组分采用梯度为3∶1至0∶1的石油醚-乙酸乙酯进行硅胶柱层析，收集梯度为1∶1的石油醚-乙酸乙酯的洗脱组分，洗脱下的组分再采用梯度为0∶1至1∶0的甲醇-水进行C-18反相柱层析，收集梯度为1∶1至2∶3的洗脱组分，将洗脱组分采用体积比为57∶43的甲醇-水进行半制备HPLC制备柱洗脱，即得到如式A所示的1、2、3衍生物合物。
所述PDA培养基成分为：陈海水配制的20％的马铃薯浸出液1000mL，葡萄糖20g，琼脂20g，PH6.5-7.0；所述PDB液体培养基的组成为：陈海水配制的20％的马铃薯浸出液1000mL，葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母膏3g，PH6.5-7.0。
Azaphilone类衍生物的应用：所述式A所示的衍生物具有抑制细菌的作用。所述式A所示的衍生物具有抑制革兰氏阳性菌的作用。
本发明所具有的优点：
1.本发明所涉及的Azaphilone类衍生物(化合物1-3，如结构式A所示)可以作为具有抗细菌作用的新药物成分或先导化合物；
2.本发明所涉及的Azaphilone类衍生物可以利用微生物进行发酵生产，具有操作工艺简单，生产周期短、产品成本低的特点；
3.本发明利用微生物发酵法制备抗真菌化合物对环境无污染。
4.本发明所涉及的Azaphilore类衍生物能够有效抑制多种细菌的生长，采用MIC法抗菌实验发现，它们分别对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌MRSA(Methicillin resistant Staphylococcus aureus)表现出了较强活性，表明该三个化合物可用作制备抗细菌的药物。
具体实施方式
通过下面给出的具体实施例可进一步了解本发明，但它不是对本发明的限定。
实施例1
Azaphilone类衍生物如式A所示：
式A化合物的制备：
1)将团青霉Penicillium commune QSD-17培养于PDA(potato dextroseagar)培养基中，将培养基配制成平板，然后将保种管斜面上的菌株挑入平板，28℃培养4-7天，作为下一步培养的菌种，待用；所述PDA培养基组成为：陈海水配制的20％的马铃薯浸出液1000mL，葡萄糖20g，琼脂20g，PH6.5-7.0。陈海水配制的20％的马铃薯浸出液为每200g马铃薯加入1000mL海水；陈海水为自然海水经沉降、过滤而得。
2)将菌种平板上的QSD-17菌株切成约1cm2大小的方块放入PDB液体培养基的无菌三角瓶中，28℃培养30天，总共培养100瓶。发酵完成后，发酵产物用纱布过滤得发酵液和菌丝体两部分；发酵液用乙酸乙酯萃取三次，然后将乙酸乙酯蒸干得提取物I；菌丝体剪碎后用过量的甲醇浸泡2-3次，然后将甲醇蒸干后得提取物II。合并上述提取物I和提取物I I得总提取物；所述PDB液体培养基的组成为：陈海水配制的20％的马铃薯浸出液1000mL，葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母膏3g，PH6.5-7.0。所述真菌QSD-17为团青霉Penicillium communeQSD-17；陈海水配制的20％的马铃薯浸出液为每200g马铃薯加入1000mL海水；陈海水为自然海水经沉降、过滤而得。
3)将上述所得总提取物用体积比为1∶1的氯仿-甲醇溶解提取物，溶解物用硅胶柱(300-400目)进行色谱分离，硅胶柱分离时依次经梯度体积比1∶0至0∶1的石油醚-乙酸乙酯洗脱在经梯度为20∶1至1∶1的氯仿-甲醇洗脱；
4)收集步骤3)中以石油醚-乙酸乙酯体积比3∶1至1∶1梯度的洗脱组分，进一步经洗脱液为3∶1至0∶1石油醚-乙酸乙酯的硅胶柱层析(300-400目)，收集洗脱液体积比1∶1梯度的洗脱组分，洗脱组分再经洗脱液梯度为0∶1至1∶0的甲醇-水进行C-18反相柱层析，收集洗脱液体积比为1∶1至2∶3梯度的洗脱组分，进一步经半制备HPLC制备层析(本实施例采用Dionex P680HPLC System，由Dionex P680泵、ASI-100自动进样器和UVD340U二极管阵列检测器组成，色谱柱为大连依利特公司生产(填料为SinoChrom ODS-BP，10μm，8mm×200mm)，采用体积比57∶43甲醇-水为洗脱体系，流速为：4mL/min，洗脱液经减压浓缩制备得三个黄色粉末状Azaphilone类衍生物(如A所示)，其保留时间分别为：化合物1：21分10秒、化合物2：35分5秒、化合物3：27分10秒。式A所示化合物的实验数据：化合物1，
IR(KBr)Vmax：3413，2935，2858，1716，1647，1527，1458，1412，1267，1057，1007，945，860，756cm1。ESI-MS：m/z 439[M+Na]+，m/z 855[2M+Na]+；化合物2，
IR(KBr)Vmax：3382，2974，2931，2861，1643，1523，1450，1307，1257，1200，1165，1107，845，756，cm1。ESI-MS：m/z 409[M+Na]+，m/z795[2M+Na]+；
化合物3，
IR(KBr)Vmax：3398，2927，2858，1720，1651，1527，1454，1408，1369，1273，1165，1072，949，756，582cm1。ESI-MS：m/z 439[M+Na]+，m/z 855[2M+Na]+。
式A所示三个Azaphilone衍生物的NMR数据如表1和2所示。
表1式A所示化合物1-3的13C-NMR数据(125MHz，in CDCl3)
表2式A所示化合物1-3的1H-NMR数据(500MHz，in CDCl3)
实施例2：用微量肉汤法检测式A所示的三个化合物抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA(Methicillin resistant Staphylococcus aureus)，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis和荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens的活性。
1.培养基：抗细菌实验采用NCCLS推荐使用Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基，pH7.2-7.4。
2.MIC板制备：无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔10μl，第12孔不加药作为阴性对照，真空干燥后密封，-20℃以下保存备用。
3.接种物制备：将用生长法或直接菌悬液法制备的浓度相当于0.5麦氏比浊标准的指示菌悬液，经MH肉汤1∶1000稀释后，向每孔中加100μl，密封后置35℃普通空气孵箱中，孵育16-20h，目测或酶标仪600nm测吸光度判断结果。此时，第1孔至第11孔药物浓度分别为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5μg/ml。
4.结果判断：以在小孔内完全抑制指示菌生长的最低药物浓度为MIC。当阴性对照孔内指示菌明显生长时试验才有意义。
实验结果如表3所示。实验结果表明，式A中化合物1对枯草芽孢杆菌B.subtilis的MIC为16μg/ml，对荧光假单胞菌P.fluorescens的MIC为32μg/ml；化合物2对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌MRSA(Methicillinresistant Staphylococcus aureus)的MIC为32μg/ml，对荧光假单胞菌P.fluorescens的MIC为16μg/ml；化合物3对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌MRSA(Methicillin resistant Staphylococcus aureus)的MIC为16μg/ml，对枯草芽孢杆菌B.subtilis的MIC为32μg/ml，对荧光假单胞菌P.fluorescens的MIC为64μg/ml。说明式A所示化合物具有较强的抗细菌的活性，可用于制备抗细菌的药物。
表3式A所示化合物的抗菌活性实验结果(最小抑菌浓度MIC单位：μg/ml)
“-”：表明无明显抗菌活性，即初筛无抑菌圈，或初筛虽有微弱抑菌圈，但复筛MIC＞512μg/mL。
Claims (3)
1.一种Azaphilone类衍生物，其特征在于：Azaphilone类衍生物如式A中1、2、3所示，
2.一种权利要求1所述的Azaphilone类衍生物的制备方法，其特征在于按如下步骤：
1)将团青霉(Penicillium commune)于PDA培养基以20-35℃培养4-7天作为菌种，待用；
2)将步骤1)所得菌种接种于PDB培养基中，以20-35℃静置发酵培养30-35天；发酵产物过滤得发酵液和菌丝体两部分；发酵液用乙酸乙酯萃取，然后将乙酸乙酯蒸干得提取物I；菌丝体用过量的甲醇浸泡，然后将甲醇蒸干后得菌丝体提取物II；合并上述提取物I和提取物II得总提取物，待用；
所述PDB液体培养基的组成为：陈海水配制的20％的马铃薯浸出液1000mL，葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母膏3g， pH6.5-7.0；
3)将步骤2)中所得总提取物用氯仿-甲醇溶解，然后用硅胶柱进行色谱分离，分离时依次采用梯度为体积1∶0至0∶1的石油醚-乙酸乙酯和梯度为20∶1至1∶1的氯仿-甲醇洗脱液洗脱；
4)收集步骤3)中梯度为3∶1至1∶1的石油醚-乙酸乙酯的洗脱组分，将洗脱下的组分采用梯度为3∶1至0∶1的石油醚-乙酸乙酯进行硅胶柱层析，收集梯度为1∶1的石油醚-乙酸乙酯的洗脱组分，洗脱下的组分再采用梯度为0∶1至1∶0的甲醇-水进行C-18反相柱层析，收集梯度为1∶1至2∶3的洗脱组分，将洗脱组分采用体积比为57∶43的甲醇-水进行半制备HPLC制备柱洗脱，即得到如式A所示的1、2、3衍生物。
3.按权利要求2所述的Azaphilone类衍生物的制备方法，其特征在于：所述PDA培养基成分为：陈海水配制的20％的马铃薯浸出液1000mL，葡萄糖20g，琼脂20g，pH6.5-7.0。
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