CN103145740A

CN103145740A - 一种亚砜生物碱类化合物及其制备方法与应用

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Publication number: CN103145740A
Application number: CN2013100642615A
Authority: CN
Inventors: 赵心清; 矫文策; 白凤武
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2013-02-28
Filing date: 2013-02-28
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2033-02-28
Also published as: CN103145740B

Abstract

一种亚砜生物碱类化合物及其制备与应用，属于微生物技术领域。这种亚砜生物碱类化合物是将海洋链霉菌接种到胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中，28-30℃，180-200rpm培养48-72h，以10%接种量接种到发酵培养基中，28-30℃，180-200rpm培养432-456h，发酵液经分离纯化法得到。该化合物对多种细菌尤其是金黄色葡萄球菌具有显著的抑制作用，同时对人乳腺癌细胞MCF-7，人肝癌细胞SMMC-7721，人急性骨髓性白血病细胞U937以及小细胞肺癌细胞NCI-H1688具有一定的抗肿瘤活性，具有较好的抗癌新药及抗菌新药开发前景。

Description

一种亚砜生物碱类化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种亚砜生物碱类化合物及其制备与应用，属于微生物技术领域。

背景技术

随着抗生素在临床上的普遍应用, 临床上耐药性病原菌不断出现以及近年来出现的SARS、禽流感和超级细菌”，迫切需要开发新的抗生素类药物。放线菌生产的活性物质很多具有医药和植物保护方面的用途,已广泛用作抗细菌、抗真菌和抗肿瘤药物。现在已发现的数万种微生物来源的生物活性物质中,约有70%是由放线菌所合成的。然而，随着陆地放线菌的过度开发，发现新颖生物活性化合物的几率逐年降低。海洋微生物生活在高压、高盐、寡营养等特殊环境中, 形成了独特的生长和代谢方式, 与陆地微生物相比更有可能产生结构新颖、功能独特的次级代谢物, 具有巨大的开发潜力。

海洋链霉菌（Streptomyces xinghaiensis NRRL B24674^T）是本实验室于2006年分离自大连星海湾水下20米海泥样品中，经过16S rRNA，形态和生理生化实验确定为一株新的海洋链霉菌。前期研究表明，海洋链霉菌发酵液粗提物对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，铜绿假单胞菌具有不同程度的抑制作用。

亚砜类化合物由于具有广谱的生物活性，如杀虫活性、抗菌活性、抗肿瘤活性、除草剂活性等，受到国内外学者的普遍关注，但天然亚砜类化合物报道很少，已有的报道常常来自于陆地植物中，如分离自牙甘蓝（Brussels sprouts）中的S-methyl-cysteine sulfoxid和西西里蜜蒜（Allium siculums）中的S-alk(en)yl-L-cysteine sulfoxide, S-n-butyl-cysteine sulfoxide。在海洋无脊椎动物中，如海绵(Pseudoceratina purpurea)和海鞘 (Polycitor sp.)中也分离得到少量的亚砜类化合物，如psammaplin N, eudistomin K,lehualides J, varacins B 和 varacins D, eudistomidin E 和aplisulfamines等。到目前为止，还没有亚砜类化合物从海洋微生物中发现得到。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有药用价值的新化合物及其制备方法和该化合物在抗菌及抗肿瘤治疗中的应用。

本发明采用的技术方案是：一种亚砜生物碱类化合物的分子结构式I为：

在I式中：R₁为

所述的亚砜生物碱类化合物的制备方法：将海洋链霉菌接种到胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中，28-30℃，180-200rpm培养48-72h，以10%接种量接种到发酵培养基中，28-30℃，180-200rpm培养432-456h，发酵液经分离纯化法得到亚砜生物碱类化合物。

所述分离纯化法如下：将6升发酵液6000 r/min离心10 min，得到发酵液上清液与菌丝体；上清液以1:2的比例与乙酸乙酯混合，反复萃取三次，并使用旋转蒸发仪蒸干，得到的上清液乙酸乙酯提取物；菌丝体使用等体积比甲醇/丙酮破壁浸提12h后，6000 r/min离心10 min后取上清液，得到甲醇/丙酮菌丝体提取物，使用旋转蒸发仪除去甲醇/丙酮，并用乙酸乙酯萃取，得到菌丝体乙酸乙酯提取物，将上清液与菌丝体的乙酸乙酯提取物合并后得到发酵液粗提物；将发酵液粗提物过硅胶柱，干法上柱，以乙酸乙酯-二氯甲烷和甲醇-乙酸乙酯进行梯度洗脱，在洗脱前首先用二氯甲烷平衡，然后按照如下洗脱梯度，用100毫升的不同梯度洗脱液进行洗脱，洗脱梯度分别为纯二氯甲烷，二氯甲烷：乙酸乙酯=2:1、二氯甲烷：乙酸乙酯=1:1、二氯甲烷：乙酸乙酯=1:2，纯乙酸乙酯，乙酸乙酯：甲醇=2:1、乙酸乙酯：甲醇=1:1、乙酸乙酯：甲醇=1:2，纯甲醇，以上洗脱梯度均为体积比；得到9个组分，以金黄色葡萄球菌为指示菌进行活性检测，结果显示组分5具有拮抗金黄色葡萄球菌的活性；以C18反相柱对组分5进行分离，分别用浓度为30%、60%、80%和100%的甲醇进行洗脱，结果显示80%的甲醇洗脱液具有拮抗金黄色葡萄球菌的活性；对该组分进行高效液相色谱检测，并在半制备型HPLC进行制备，得到所述亚砜生物碱类化合物。

所述胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基的组分如下：酪蛋白胨17 g、大豆蛋白胨3 g、葡萄糖2.5 g、NaCl 5 g、K₂HPO4 2.5g，蒸馏水定容至1000 ml，pH 7.0±0.2；发酵培养基组成如下：可溶性淀粉20.0 g、大豆粉 25 g、葡萄糖 10 g、酵母粉 4 g、牛肉膏1 g、蛋白胨 2 g、NaCl 2 g、K₂HPO₄ 0.5 g、CaCO₃ 5 g，蒸馏水定容至1000 ml，pH 7.2。

用于制备抑制金黄色葡萄球菌的抗菌制剂，或用于制备治疗肺癌、肝癌、白血病的抗肿瘤药物。

本发明的有益效果主要体现在：这种亚砜生物碱类化合物是将海洋链霉菌接种到胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中，28-30℃，180-200rpm培养48-72h，以10%接种量接种到发酵培养基中，28-30℃，180-200rpm培养432-456h，发酵液经分离纯化法得到。该化合物对多种细菌尤其是金黄色葡萄球菌具有显著的抑制作用，同时对人乳腺癌细胞MCF-7，人肝癌细胞SMMC-7721，人急性骨髓性白血病细胞U937以及小细胞肺癌细胞NCI-H1688具有一定的抗肿瘤活性，具有较好的抗癌新药及抗菌新药开发前景。

附图说明

图1为星海新碱在甲醇溶液中的紫外吸收谱图；

图2为星海新碱的红外光谱谱图；

图3为星海新碱的ESI-MS质谱谱图；

图4为星海新碱核磁氢谱¹H-NMR谱图；

图5为星海新碱核磁碳谱¹³C-NMR谱图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例进一步说明本发明。

实施例1

将海洋链霉菌接种到胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中，28℃，200rpm培养48h，得到海洋链霉菌种子培养液；种子液以10%接种量接种到装有150ml发酵培养基的500ml三角瓶中，共50瓶，28℃，200rpm培养432h，得到7L海洋链霉菌发酵液。将发酵液6000 r/min离心10 min，得到发酵液上清液与菌丝体。上清液以1:2的比例与乙酸乙酯混合，反复萃取三次，并使用旋转蒸发仪蒸干，得到的上清液乙酸乙酯提取物；菌丝体使用甲醇/丙酮（1:1，v:v）破壁浸提12h后，6000 r/min离心10 min后取上清液，得到甲醇/丙酮菌丝体提取物，使用旋转蒸发仪除去甲醇/丙酮，并用乙酸乙酯萃取，得到菌丝体乙酸乙酯提取物，将上清液与菌丝体的乙酸乙酯提取物合并后得到发酵液粗提物。将发酵液粗提物过硅胶柱，干法上柱，以乙酸乙酯-二氯甲烷 (0–100%)和甲醇-乙酸乙酯 (0–100%) 进行梯度洗脱，得到9个组分。以金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为指示菌进行活性检测，结果显示组分5具有拮抗金黄色葡萄球菌的活性。以C18反相柱对组分5进行分离，分别用30%, 60%, 80%和100%的甲醇进行洗脱，结果显示80%的甲醇洗脱液具有拮抗金黄色葡萄球菌的活性。对该组分进行高效液相色谱进行检测，并在半制备型高效液相色谱进行制备，得到所述的亚砜生物碱类化合物6毫克。

该化合物相关参数如下:

外观：褐色粘性油状物；

比旋光度：10.8（1mg/ml，甲醇溶液）；

分子量：724.35；

分子式：C₅₀H₄₈N₂OS；

紫外最大吸收波长：232.5nm（甲醇溶液，见图1）；

IR图谱：见图2；

MS图谱：见图3；

NMR图谱：1H-NMR见图4，13C-NMR见图5。

根据上述特征，可断定该化合物为一种新的亚砜生物碱类化合物，将它命名为星海新碱，该化合物系首次从海洋微生物中发现的新型含亚砜基团的生物碱类活性物质。

实施例2

用接种环挑取平板中金黄色葡萄球菌单菌落，接种于4ml的LB培养基中，37℃，200rpm培养4-6小时，使其终浓度为约含1~2×10⁸CFU/ml；取无菌试管13支，排成一排，除第1管加入1.6ml LB培养基外，其余每管加入LB培养基1ml，在第1管加入星海新碱1280 μg/ml 0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×10⁵CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml。将接种好的稀释管塞好塞子，置37℃培养箱中培养16~20小时。观察不长金黄色葡萄球菌（试管内澄清）的试管浓度即为星海新碱的最小抑菌浓度，实际检测得知星海新碱对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.5μg/ml。

上述的星海新碱可用于制备抑制金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，铜绿假单胞菌的抗菌制剂，对金黄色葡萄球菌，包括临床上分离得到的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的生长具有抑制作用，同时对大肠杆菌，枯草芽孢杆菌以及铜绿假单胞菌也有一定的抑制作用，但是对白色念珠菌的抑制作用较差。本发明提供的亚砜生物碱化合物对测试菌的抑制作用见表1。

表1 星海新碱最小抑菌浓度

“−”：未测试。

上述的星海新碱可用于制备抗肿瘤药物，用于治疗肺癌、或肝癌、或白血病的抗肿瘤药物。对人乳腺癌细胞MCF-7，人肝癌细胞SMMC-7721，人急性骨髓性白血病细胞U937以及小细胞肺癌细胞NCI-H1688具有一定的生长抑制作用。星海新碱对人肿瘤细胞的生长抑制作用见表2。

表2：亚砜生物碱化合物的体外抗肿瘤活性

Claims

1.一种亚砜生物碱类化合物，其特征是：所述化合物的分子结构式I为：

在I式中：R₁为

2.根据权利要求1所述的亚砜生物碱类化合物的制备方法，其特征是：将海洋链霉菌接种到胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中，28-30℃，180-200rpm培养48-72h，以10%接种量接种到发酵培养基中，28-30℃，180-200rpm培养432-456h，发酵液经分离纯化法得到亚砜生物碱类化合物。

3.根据权利要求2所述的亚砜生物碱类化合物的制备方法，其特征是：所述分离纯化法如下：将6升发酵液6000 r/min离心10 min，得到发酵液上清液与菌丝体；上清液以1:2的比例与乙酸乙酯混合，反复萃取三次，并使用旋转蒸发仪蒸干，得到的上清液乙酸乙酯提取物；菌丝体使用等体积比甲醇/丙酮破壁浸提12h后，6000 r/min离心10 min后取上清液，得到甲醇/丙酮菌丝体提取物，使用旋转蒸发仪除去甲醇/丙酮，并用乙酸乙酯萃取，得到菌丝体乙酸乙酯提取物，将上清液与菌丝体的乙酸乙酯提取物合并后得到发酵液粗提物；将发酵液粗提物过硅胶柱，干法上柱，以乙酸乙酯-二氯甲烷和甲醇-乙酸乙酯进行梯度洗脱，在洗脱前首先用二氯甲烷平衡，然后按照如下洗脱梯度，用100毫升的不同梯度洗脱液进行洗脱，洗脱梯度分别为纯二氯甲烷，二氯甲烷：乙酸乙酯=2:1、二氯甲烷：乙酸乙酯=1:1、二氯甲烷：乙酸乙酯=1:2，纯乙酸乙酯，乙酸乙酯：甲醇=2:1、乙酸乙酯：甲醇=1:1、乙酸乙酯：甲醇=1:2，纯甲醇，以上洗脱梯度均为体积比；得到9个组分，以金黄色葡萄球菌为指示菌进行活性检测，结果显示组分5具有拮抗金黄色葡萄球菌的活性；以C18反相柱对组分5进行分离，分别用浓度为30%、60%、80%和100%的甲醇进行洗脱，结果显示80%的甲醇洗脱液具有拮抗金黄色葡萄球菌的活性；对该组分进行高效液相色谱检测，并在半制备型HPLC进行制备，得到所述亚砜生物碱类化合物。

4.根据权利要求2所述的亚砜生物碱类化合物的制备方法，其特征是：所述胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基的组分如下：酪蛋白胨17 g、大豆蛋白胨3 g、葡萄糖2.5 g、NaCl 5 g、K₂HPO4 2.5g，蒸馏水定容至1000 ml，pH 7.0±0.2；发酵培养基组成如下：可溶性淀粉 20.0 g、大豆粉 25 g、葡萄糖 10 g、酵母粉 4 g、牛肉膏 1g、蛋白胨 2 g、NaCl 2 g、K₂HPO₄ 0.5 g、CaCO₃ 5 g，蒸馏水定容至1000 ml，pH 7.2。

5.根据权利要求1所述的亚砜生物碱类化合物的应用，其特征是：用于制备抑制金黄色葡萄球菌的抗菌制剂，或用于制备治疗肺癌、肝癌、白血病的抗肿瘤药物。