CN1974560B - 化合物3-甲基-6-(2-甲基丁基)哌嗪-2,5-二酮及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一个从中国东海枯草芽孢杆菌中分离获得的新的抗真菌和抗革兰氏阴性菌天然产物——3-甲基-6-(2-甲基丁基)哌嗪-2，5-二酮。该化合物对稻瘟霉和大肠杆菌均有较强的抑制作用。采用海水培养基发酵培养芽孢杆菌F121112菌株，发酵液经正相硅胶柱层析、Sephadex HL-20、RP C18HPLC分离结合活性跟踪手段，可以制得本化合物。本发明为研究开发新型抗细菌和抗真菌药物提供了一种先导化合物，具有作为抗细菌和抗真菌药物的潜在用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种新天然产物——3-甲基-6-(2-甲基丁基)哌嗪-2，5-二酮的制备方法和在制备抗真菌和细菌药物中的应用。
背景技术
全球生物的种类约50万种，其中80％来自于海洋，因此，海洋是个巨大的生物资源宝库。鉴于陆地资源日趋匮乏，开发利用海洋资源已成为全球关注的前沿科学问题。在海洋资源中，海洋生物资源最为重要，是尚未充分开发利用的资源宝库，其中又以海洋药用生物资源的开发为热点。海洋特殊生态环境中的生物资源已成为拓展天然药用资源的新空间。到目前为止，已经发现15,000多种海洋天然产物，其中两百多种已申请专利。
海洋细菌是一类生活在海洋中的对海水盐度有特殊需求或适应的细菌，由于其生长环境十分特殊，导致其次生代谢产物结构种类多样，生理活性很强。据已研究的结果，其次生代谢产物具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗心血管疾病以及抗衰老等多方面的作用。通过各种药理模型筛选，可以分离提取到具有不同生理活性的新型先导化合物，进一步用于新药开发。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新天然产物——3-甲基-6-(2-甲基丁基)哌嗪-2，5-二酮(代号为9K22)的制备方法和在制备抗真菌和细菌药物中的应用。
本发明所用的菌种是从中国东海海泥样品中分离获得的芽孢杆菌F121112菌株(Bacillus subtilis strain F121112)，该菌株是从东海海域离岸30海哩的海泥样品中分离得到的，海泥样品分离时采用过5种分离培养基，该菌株采用的分离培养基是：蛋白胨4g，牛肉膏4g，酵母膏5g，葡萄糖5g，人工海水1000ml(同其发酵培养基)，pH6.5。具体的方法是：称取5g海泥样品，加入45ml无菌人工海水，激烈振荡1min至混合均匀，静置30min后取上清采用无限稀释划平板的方法，25℃恒温培养，得到单菌落。现保存于第二军医大学生物化学与分子生物学教研室菌种库，及位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M206059。该菌株在二倍海水盐浓度时生长良好，合适的生长盐浓度范围为0.15％-5.0％；发酵液对稻瘟霉孢子有强烈的抑制生长作用，其抑制孢子萌发的最大稀释倍数为128倍。
本发明中从芽孢杆菌F121112菌株中分离获得一个活性新天然产物9K22，命名为3-甲基-6-(2-甲基丁基)哌嗪-2，5-二酮。结构式如下：
化合物9K22的分子结构依据13C-NMR谱、1H-NMR谱、DEPT谱、ESI-MS、EI-MS等数据得以确定。该化合物的ESI-MS正离子质谱显示m/z 199[M+1]峰，负离子质谱显示m/z 197[M-1]峰，表明分子量为198。EI-MS显示m/z 198的分子离子峰。13C谱、DEPT谱1H谱显示分子中含有3个CH3，2个CH2，3个CH及2个＞C＝O，1H谱显示有活泼氢存在。由分子量和碳氢谱数据可知分子式为C10H18N2O2。9K22的13C谱和1H谱数据见下表。
表9K22的13C谱和1H谱数据(CDCl3)
本发明中化合物的制备方法如下：
(1)将F121112菌株从试管斜面上接种到装有发酵培养基的1000ml三角瓶中进行种子培养，每个三角瓶装200ml培养基，25℃摇床恒温培养，转速120r/min。培养一周后将种子培养液接种到2000ml的三角瓶中进行扩大培养，每瓶装400ml发酵培养基，按5％接种量接种，同上培养条件培养10～14d。发酵培养基成分：蛋白胨4g，牛肉膏4g，酵母膏5g，葡萄糖5g，人工海水(或陈海水)1000ml，pH 6.5。人工海水配方：NaCl 25.0g，Na2SO4.4.0g，KCl 0.7g，NaHCO30.20g，KBr 0.10g，H3BO30.03g，NaF 0.003g，53mL1.0mol/LMgCl2溶液，10mL1.0mol/l CaCl2溶液，0.90ml 0.1mol/L SrO2溶液，蒸馏水1000ml，pH调为6.5。
(2)将完成发酵培养过程的菌液经过滤，除去菌体后收集发酵液上清。将发酵液上清用乙酸乙酯等体积萃取，重复3次，合并萃取液用旋转蒸发仪蒸干溶剂，将浸膏用正相硅胶柱层析(烟台黄务硅胶开发试验厂200-300目柱层硅胶)，流动相为氯仿-甲醇(30∶1)。采用稻瘟霉法活性跟踪手段，跟踪活性洗脱蜂。(3)将所得活性洗脱相蒸干后通过Sephadex HL-20除去色素后，HPLC进一步纯化，使用LiChrospher 250-10RPC18反相柱(10×250mm)进行粗分段，流动相为55％甲醇和45％水，流速4.0ml/min，218nm检测，收集tR在4.0～7.1min的洗脱峰，浓缩后使用Agilent C18反相柱(4.6mm×250mm)，流动相为45％甲醇和55％水，流速1.0ml/min，218nm检测，收集tR为12.53min的洗脱峰制备出化合物9K22。
我们测定了化合物9K22对稻瘟霉的抑制活性。结果显示，化合物9K22抗大肠杆菌的MIC值为15μg/ml，抑制稻瘟霉生长的最大稀释倍数为64，对稻瘟霉和大肠杆菌均有较强的抑制作用，表明本发明化合物9K22为研究开发新型抗细菌和抗真菌药物提供了一种先导化合物，具有作为抗细菌和抗真菌药物的潜在用途。
芽孢杆菌F121112菌株(Bacillus subtilis strain F121112)，我们已于2006年6月26日保藏于位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M206059。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1F121112海洋菌株的发酵培养
a.F121112海洋菌株的发酵培养基如下：蛋白胨4.0g，牛肉膏4.0g，酵母膏5.0g，葡萄糖5.0g，人工海水(或陈海水)1000ml，pH 6.5。人工海水配方：NaCl 25.0g，Na2SO44.0g，KCl 0.7g，NaHCO30.20g，KBr 0.10g，H3BO30.03g，NaF 0.003g，53mLl.0mol/L MgCl2溶液，10mL1.0mol/l CaCl2溶液，0.90ml 0.1mol/L SrO2溶液，蒸馏水1000ml，pH调为6.5。
b.发酵培养过程：将F121112菌株从试管斜面上接种到装有发酵培养基的5只1000ml三角瓶中进行种子培养，每个三角瓶装200ml培养基，25℃摇床恒温培养，转速120r/min。培养一周后将种子培养液接种到50只2000ml的三角瓶中进行扩大培养，每瓶装400ml发酵培养基，按5％接种量接种，同上培养条件培养10～14d。
实施例2活性化合物的分离提取
a.将完成发酵培养过程的菌液经过滤，除去菌体后收集发酵液上清。将发酵液上清用乙酸乙酯等体积萃取，重复3次，合并萃取液用旋转蒸发仪蒸干溶剂，将浸膏用正相硅胶柱层析(烟台黄务硅胶开发试验厂200-300目柱层硅胶)，流动相为氯仿-甲醇(30∶1)。采用稻瘟霉法活性跟踪手段，跟踪活性洗脱峰。
b.将所得活性洗脱相蒸干后通过Sephadex HL-20除去色素后，HPLC进一步纯化，使用LiChrospher 250-10RP C18反相柱(10×250mm)进行粗分段，流动相为55％甲醇和45％水，流速4.0ml/min，218nm检测，收集tR在4.0～7.1min的洗脱峰，浓缩后使用Agilent C18反相柱(4.6mm×250mm)，流动相为45％甲醇和55％水，流速1.0ml/min，218nm检测，收集tR为12.53min的洗脱蜂制备出化合物9K22。
实施例3活性化合物9K22的活性测定结果
采用琼脂稀释法(叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程(第二版).南京：东南大学出版社，1997：553-564)测定对大肠杆菌的MIC值。采用稻瘟霉活性测定法(Hisayoshi K，，Michio N，Takeshi Y.et al.J Antibiotics，1996，49(9)：873-878.)测定化合物9K22对稻瘟霉的抑制活性。结果显示，化合物9K22抗大肠杆菌的MIC值为15μg/ml，抑制稻瘟霉生长的最大稀释倍数为64。
本发明活性化合物3-甲基-6-(2-甲基丁基)哌嗪-2，5-二酮对稻瘟霉和大肠杆菌均有较强的抑制作用，具有作为抗细菌和抗真菌药物的潜在用途。
Claims (3)
1.一种化合物3-甲基-6-(2-甲基丁基)哌嗪-2，5-二酮，其化学结构式如下：
2.权利要求1所述的化合物3-甲基-6-(2-甲基丁基)哌嗪-2，5-二酮的制备方法，依次由以下步骤组成：
a.将芽孢杆菌F121112菌株(Bacillus subtilis strain F121112；CCTCC NO：M206059)从试管斜面上接种到发酵培养基进行种子培养，25℃摇床恒温培养，转速120r/min；培养一周后将种子培养液接种进行扩大培养，在发酵培养基上，按5％接种量接种，同上培养条件培养10～14天；
b.将完成发酵培养过程的菌液经过滤，除去菌体后收集发酵液上清；将发酵液上清用乙酸乙酯等体积萃取，重复3次，合并萃取液用旋转蒸发仪蒸干溶剂，将浸膏用正相硅胶柱层析，流动相为30∶1的氯仿-甲醇，采用稻瘟霉法活性跟踪手段，跟踪活性洗脱峰；
c.将所得活性洗脱相蒸干后通过Sephadex HL-20除去色素后，HPLC进一步纯化，使用10×250mm的LiChrospher 250-10RP C18反相柱进行粗分段，流动相为55％甲醇和45％水，流速4.0ml/min，218nm检测，收集tR在4.0～7.1min的洗脱峰，浓缩后使用4.6mm×250mm的Agilent C18反相柱，流动相为45％甲醇和55％水，流速1.0ml/min，218nm检测，收集tR为12.53min的洗脱峰即为本发明的化合物3-甲基-6-(2-甲基丁基)哌嗪-2，5-二酮。
3.根据权利要求2所述的化合物3-甲基-6-(2-甲基丁基)哌嗪-2，5-二酮的制备方法，其特征在于所述的发酵培养基成分为：
蛋白胨4g，牛肉膏4g，酵母膏5g，葡萄糖5g，人工海水或陈海水1000ml，pH 6.5；
其中人工海水配方：NaCl 25.0g，Na2SO44.0g，KCl 0.7g，NaHCO30.20g，KBr 0.10g，H3BO30.03g，NaF 0.003g，53mL1.0mol/L MgCl2溶液，10mL1.0mol/l CaCl2溶液，0.90ml 0.1mol/L SrO2溶液，蒸馏水1000ml，pH调为6.5。4.权利要求1所述的化合物3-甲基-6-(2-甲基丁基)哌嗪-2，5-二酮在制备抗细菌和抗真菌药物中的应用。
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| 张炜等.微紫青霉中的化学成分研究.中国药物化学杂志12 4.2002,12(4),208-209页,尤其是第208页第1栏第1段、摘要. * |
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