CN101845021A - 喹唑啉酮类生物碱及其制备方法和用途 - Google Patents
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本发明涉及喹唑啉酮类生物碱及其制备方法和用途。本发明用从海南儋州白马井近海的海泥样品中分离得到的细菌——蜡样芽胞杆菌041381(Bacillus cereus 041381，菌种保藏编号CCTCC M 203030)生产出结构新颖的上述类型的化合物，并通过化学合成方法制备了此类化合物。经实验证实，该类化合物具有抗白色念珠菌的活性，其最小抑制浓度MIC为1.3-10.2μM，可作为白色念珠菌的抑制剂。
Description
技术领域：
本发明涉及喹唑啉酮类生物碱及其制备方法和用途。本发明用从海南儋州白马井近海的海泥样品中分离得到的蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)041381生产出结构新颖的上述类型化合物，并通过化学合成方法制备了此类化合物。经实验证实，该类化合物具有抗白色念珠菌的活性，其最小抑制浓度MIC为1.3-10.2μM，可作为白色念珠菌的抑制剂。
背景技术：
白色念珠菌隶属酵母菌目、酵母菌科、假丝酵母属，广泛地存在于人体的皮肤表面、小肠、空腔以及湿润部位。白色念珠菌是一种条件致病菌，当人体的抵抗力降低时，可以诱发多种感染疾病，如鹅口疮等，危害着人类的生命安全，是真菌感染的首要病原菌(Edwards JE Jr.Management of severe candidal infections：integration and review of current guidelines for treatment and prevention.Curr.Clin.Top.Infect.Dis.2001，21：135-147；Klepser ME，Lewis RE，Pfaller MA.Therapy of Candida infections：susceptibility testing，resistance，and therapeutic options.Ann.Pharmacother.1998，32：1353-1361；Reyes G.，Ghannoum MA.Antifungalsusceptibility testing of yeasts：uses and limitations.Drug Resist.Updates，2000，3：14-19)。随着广谱抗生素的普遍应用，器官移植中免疫抑制治疗的广泛开展，以及艾滋病等免疫缺陷患者的增多，白色念珠菌感染率在近几年迅速增加，深部念珠菌感染已经成为重症患者死亡的重要原因(White TC，Marr KA.Clinical，cellular，and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance.Clin.Microbiol.Rev.1998，11：382-402；Law D，Moore CB，Wardle HM，Ganguli LA，Keaney MG，Denning DW.High prevalence of antifungalresistance in Candida spp.from patients with AIDS.J Antimicrob chemother，1994，34(5)：659-668)。目前针对白色念珠菌感染的药物主要有酮康唑、克霉唑或氟康唑等(Kowalsky SF，Dixon DM.Fluconazole：a newantifungal agent.Clin Pharm.1991，10：179-94；Palacin C，Tarrago C，Agut J，Guglietta，A.In vitro activity ofsertaconazole，fluconazole，ketoconazole，fenticonazole，clotrimazole and itraconazole against pathogenic vaginalyeast isolates.Methods Find Exp Clin Pharmacol，2001，23：61-64)。但是随着药物的滥用，白色念珠菌对这些药物产生了抗药性和耐药性，成为临床治疗的一大难题，急需寻找结构新颖、作用高效的抗白色念珠菌感染药物。本发明人从广西山口、防城、北海红树林样品分离的498株海洋细菌中，发现了一株能够产生抗白色念珠菌活性物质的蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)041381，且活性物质为生物碱类化合物。从其液体发酵物中，分离并鉴定了这类生物碱为结构新颖的喹唑啉酮类生物碱。活性测试表明，此类喹唑啉酮类生物碱具有较强的白色念珠菌抑制活性，最小抑制浓度MIC为1.3-10.2μM，可作为白色念珠菌抑制剂用于由白色念珠菌感染所导致的疾病的治疗，还可作为抑制白色念珠菌的低分子生物探针用于生命科学研究。目前尚未见对该化合物的化学结构及抗白色念珠菌活性的报道，因此市场上也尚未见有与此有关的药物。
发明内容：
本发明旨在提供一类结构独特的具有抗白色念珠菌活性的喹唑啉酮类生物碱。
本发明的目的还在于提供这类新化合物的制备方法及其在制备白色念珠菌抑制剂中的用途。
本发明首次从蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)041381发酵物中发现了一类抗白色念珠菌活性的喹唑啉酮类生物碱，如式I、II所示：
其结构特征是：化合物的基本骨架为在2-位上带有3-庚基取代片段的喹唑啉酮生物碱，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6为氢、烃基、氨基、烷氧基、羟基、酰基、酰氧基、酰氨基或芳香基团，1，2-位为单键或双键。
优选的本发明化合物之一是所述的式I化合物(R2、R3、R4、R5和R6均为氢)：R-(+)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(1)、S-(-)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(3)及其外消旋(±)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(5)：优选的本发明化合物之二是所述的式II化合物(R1、R2、R3、R4、R5和R6均为氢)：(2R，3′R)+(2S.3′R)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(2)、(2R，3′S)+(2S，3′S)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(4)及其消旋物(±)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(6)。
上述发明中最优选的化合物是由海南儋州白马井的近海海泥来源的细菌-蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)041381的液体发酵物经大孔树脂柱层析，以乙醇、水为溶剂梯度洗脱，乙醇-水70∶30洗脱物具有抗白色念珠菌的活性；此部分再经反相硅胶柱层析，甲醇、水为溶剂进行梯度洗脱，其中甲醇-水80∶20洗脱物为活性组分，再经Sephadex LH-20柱层析，所得氯仿-甲醇1∶1洗脱产物，最后经HPLC分离纯化(甲醇-水75∶25)洗脱得式I化合物R-(+)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(1)和式II的一对非对映体混合物(2R，3′R)+(2S，3′R)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(2)。
上述发明中最优选的化合物还可以由合成方法获得，由R-(-)-2-乙基己酸为原料，经草酰氯制为酰氯后，与邻氨基苯甲酰胺反应，所得到的反应物在碳酸氢钠饱和溶液中回流或与六甲基二硅胺(HMDS)和I2反应，所得产物经HPLC分离纯化(甲醇-水75∶25洗脱)得式I化合物R-(+)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(1)。化合物1经NaBH4还原，所得产物经HPLC分离纯化(甲醇-水70∶30洗脱)得式II的一对非对映体混合物(2R，3′R)+(2S，3′R)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(2)。同样条件，由S-(+)-2-乙基己酸为原料，制得式I化合物S-(-)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(3)和式II的一对非对映体混合物(2R，3′S)+(2S，3′S)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(4)；由(±)-2-乙基己酸为原料，可得式I化合物(±)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(5)和式II化合物(±)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(6)。
本发明采用纸片法测试了式I、II的化合物对白色念珠菌(Candida albicans)的抑菌活性。实验证实，此类化合物对白色念珠菌有生长抑制作用，R-(+)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(1)、非对映体混合物(2R，3R)+(2S，3′R)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(2)、S-(-)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(3)、混合物(2R，3′S)+(2S，3′S)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(4)、(±)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(5)和(±)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(6)对白色念球菌的最小抑制浓度为1.3-10.2μM。
因此本发明的式I、II化合物可用作白色念珠菌的抑制剂。
式I、II化合物与各种药物可接受的载体、赋形剂或辅料配伍，可制成抗白色念珠菌药物，用于白色念珠菌感染的治疗。
式I、II化合物还可作为抑制白色念珠菌的低分子生物探针用于生命科学研究，作为探针应用时，式I化合物可溶于氯仿、甲醇、或含水甲醇中，也可溶于二甲基亚砜的含水溶液中加以应用。
本发明的式I、II化合物可通过微生物发酵培养，然后从发酵物中分离纯化而得到；也可以由简单原料通过化学合成而获得。
需要特别说明的是，经发酵微生物制取本发明式I、II化合物的方法可采用其它任何能生产该类化合物的微生物，只要能生产该类化合物的微生物均可作为式I、II化合物的生产菌。
本发明的实施例中列举了利用蜡样芽胞杆菌041381株制备优选的本发明式I、式II化合物的实例。
该细菌041381株从采自海南儋州白马井的近海海泥中分离，并经分类学研究和分子生物学研究鉴定为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)，并由中国典型培养物保藏中心保藏(编号：CCTCC M 203030，日期：2003年4月25日，地点：中国武汉、武汉大学)。
该蜡样芽胞杆菌041381(Bacillus cereus 041381)株具有如下微生物菌学特征：
菌落在培养基(酵母粉0.4％、麦芽膏1％、葡萄糖0.4％、陈海水75％、pH7.4)、28℃培养24小时的直径2mm；菌落隆起，呈淡黄色，边缘齐整，不透明，较湿，稍有光泽；个体形态为杆状，有芽孢，端部圆形。可在0-15％盐度生长，最佳生长盐度为6％。
该蜡样芽胞杆菌041381能利用糊精、糖原、吐温40、吐温80、N-乙酰-D-葡萄糖胺、D-纤维二糖、D-果糖、α-D-葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、D-甘露糖、D-阿洛酮糖、D-核糖、蔗糖、D-海藻糖、D-木糖、α-酮戊二酸、α-酮颉草酸、L-苹果酸、丙酮酸甲酯、丙酮酸、琥珀酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、谷氨酰-L-谷氨酸、L-丝氨酸、2，3-丁二醇、甘油、腺苷、2-脱氧-酰苷、肌苷、胸苷、尿苷、腺苷-5′-磷酸、胸苷-5′-磷酸、尿苷-5′-磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、D-L-α-甘油磷酸。
该蜡样芽胞杆菌041381不能利用α-环糊精、β-环糊精、菊粉、甘露聚糖、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、杏苷、阿拉伯糖、L-果糖、D-半乳糖、龙胆二糖、m-肌糖、α-D-乳糖、D-甘露醇、D-松三糖、α-甲基-D-半乳糖苷、β-甲基-D-半乳糖苷、α-甲基-D-葡萄糖苷、α-甲基-D-甘露糖苷、D-棉籽糖、L-鼠李糖、水杨苷、水苏糖、D-山梨醇、D-塔格糖、木糖醇、乙酸、α-羟基丁酸、p-羟基苯乙酸、D-乳酸甲酯、D-苹果酸、丙酸、D-果糖-6-磷酸。
该蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus 041381，CCTCC M 203030)菌株具有如下分子生物学特征：
16S rRNA序列信息(GenBank登陆号：AY973027)：
GCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTT
CGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGG
TAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAG
ACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGG
AGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGC
TAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGC
CGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCT
TAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCA
GAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCG
AAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATA
CCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGAAG
TTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGG
GCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGAC
ATCCTCCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTCATGGTTGTC
GTCAGCTCGTGTCTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAT
CATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAAT
CATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCCAAGACCG
CGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACA
具体实施方式：
在如下的实施实例中所指的具有抗白色念珠菌活性的喹唑啉酮生物碱的化学结构是(式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位)：式I、II化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6为氢、烃基、氨基、烷氧基、羟基、酰基、酰氧基、酰氨基或芳香基团。
【实施例1】化合物1、2的发酵生产及分离精制
1发酵生产
按培养微生物的常规方法，取蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)041381适量，接种到斜面培养基上，在28℃培养箱中培养3天。取斜面培养3天的B.cereus 041381适量，接种到装有150mL培养液(培养基组成为：可溶性淀粉4％、酵母粉0.1％、海水素2.5％、pH＝7.0)的500mL锥型瓶中，在28℃、120rps/min摇床培养18小时，获得B.cereus 041381的种子培养液。将该种子培养液按1％接种量分别接种于装有300mL生产培养液(培养基组成同上)的1000mL锥型瓶中，装载于28℃环境下静置发酵96小时，获得发酵培养液。
2浸膏的获得
所取得的发酵培养液用等体积的正丁醇萃取3次，萃取液合并，减压浓缩获得正丁醇提取浸膏共25.5g。
3化合物的分离精制
浸膏(25.5g)加水超声悬浮后，用大孔树脂柱层析，以乙醇、水为溶剂梯度洗脱，乙醇-水70∶30洗脱物Fr-2(8.6g)，再经反相硅胶柱层析，甲醇、水为溶剂进行梯度洗脱，分为3个组分。Fr-2-1(153.5mg，甲醇-水8∶2洗脱物)经Sephadex LH-20柱层析，氯仿-甲醇1∶1洗脱产物再经HPLC分离纯化，以甲醇-水75∶25洗脱得式I化合物R-(+)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(1)(8mg)和一对非对映体的混合物(2R，3′R)+(2S，3′R)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(2)(10mg)。
R-(+)-2-(Heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(1)：白色晶体，熔点为123-125℃，分子式为：C15H20N2O，[α]D 20+2.1(c 0.1，acetone)；UVλmax MeOH(log 
)202(4.17)，224(4.23)，265(3.73)，304(3.44)，316(3.35)nm；1Rvmax KBr3177，3034，2959，2906，1674，1609，1494，1465，1241，1196，890，768cm-1；Positive HRESIMS m/z245.1655[M+H]+。其NMR数据如表1所示。
(2R，3′R)+(2S，3′R)-2-(Heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(2)：白色晶体，熔点为86-87℃，分子式为：C15H22N2O，[α]D 20+3.9(c 0.1，acetone)；UVλmax MeOH(log 
)：221(4.17)，252(3.42)，349(3.18)nm；IRvmax KBr3290，3063，2955，2928，2867，1646，1517，1489，1460，1395，1312，1262，1151，750cm-1，Positive HRESIMSm/z 247.1819[M+H]+。其NMR数据如表1所示。
表1.化合物1和2的1H和13C NMR数据(600and 125MHz，in CDCl3)a
a本表信号归属基于DEPT、1H-1HCOSY、HMQC及HMBC图谱解析结果。碳信号的多重性利用DEPT方法确定并分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)表示。
b此栏中的数字和代号别代表以合成方法所制备的化合物1的1H和13C谱信息。
c分别为化合物2的一对非对映异构体NMR数据。
【实施例2】抗白色念珠菌活性的喹唑啉酮生物碱的化学制备
上述发明中式I的化合物还可以由合成方法获得，以最优选的化合物R-(+)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(1)、非对映体混合物(2R，3′R)+(2S,3′R)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(2)、S-(-)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(3)、非对映体混合物(2R，3′S)+(2S，3′S)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(4)、(±)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(5)、(±)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(6)为例，其化学制备路线见下图：
1 R-(-)-2-乙基己酸和S-(+)-2-乙基己酸的制备
将4.8mL(0.03mol)(±)-2-乙基己酸置于三颈瓶中，在搅拌条件下缓慢滴加4mL(0.03mol)(R)-(+)-α-苯乙胺，白色铵盐立即析出，约10分钟后铵盐完全析出。粗产物加入30mL石油醚重结晶(反复重结晶)。所得晶体溶于10mL水中，后用6mol/L盐酸酸化至弱酸性。酸化后的水溶液用乙酸乙酯萃取3次(每次20mL)，合并乙酸乙酯，无水硫酸钠干燥后真空蒸干，得到1.8g S-(+)-2-乙基己酸(收率38％)，[α]D 20+10.2(c 2，acetone)，91％ee。
将结晶后的石油醚母液减压蒸干，残留物加10mL水溶解，酸化后乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，真空蒸干，得到500mg R-(一)-2-乙基己酸，[α]D 20-4.4(c 2，acetone)，42％ee。
2 R-(-)-2-(2-ethylhexanamido)benzamide(7)的制备
将制得的R-(-)-2-乙基己酸80mg(0.56mmol)置于25mL两口瓶中，用10mL CH2Cl2溶解、N2保护下滴加草酰氯142mg(1.12mmol)，室温反应5h，真空蒸去CH2Cl2和草酰氯，用10mL CH2Cl2重新溶解，滴加到5mL CH2Cl2溶解的邻氨基苯甲酰胺76mg(0.56mmol)和三乙胺62mg(0.62mmol)中，室温反应1小时，反应完全，真空蒸干溶剂，乙酸乙酯重新溶解，分别用水、5％NaHCO3溶液洗，有机层用无水硫酸钠干燥，蒸干。硅胶柱层析分离纯化(乙酸乙酯∶石油醚4∶1)得125mg白色结晶粉末，产率85％。[α]D 20-1.3(c 1，acetone)；mp 152-153℃，ESI-MS m/z 263.2[M+H]+，285.1[M+Na]+；1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：11.2(1H，s，H-2)，8.68(1H，d，J＝8.4Hz，H-7)，7.54(1H，d，J＝8.0Hz，H-4)，7.49(1H，t，J＝8.0Hz，H-5)，7.06(1H，t，J＝7.7Hz，H-6)，6.31(1H，brs，-NH2a)，5.75(1H，brs，-NH2b)，2.18(1H，m，H-3′)，1.71(2H，m，H-2′)，1.55～1.59(4H，m，H-4′，H-5′)，1.32(2H，m，H-6′)，0.94(3H，t，J＝7.5Hz，H-1′)，0.85(3H，t，J＝6.8Hz，H-7′)。
3 R-(+)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(1)的制备
法一：取R-(-)-2-(2-ethylhexanamido)benzamide 90mg(0.34mmol)置于25mL两口瓶中用1mL甲醇溶解，加入15mL饱和的碳酸氢钠水溶液，回流2小时，冷却至室温，加水10mL。反应液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，经无水硫酸钠干燥后减压除去乙酸乙酯。硅胶柱层析分离纯化(乙酸乙酯∶石油醚：6∶1)得到80mg白色结晶，收率96％。[α]D 20+0.4(c 1，acetone)。
法二：取R-(-)-2-(2-ethylhexanamido)benzamide 60mg(0.23mmol)和I2 175mg(0.69mmol)置于25mL两口瓶中，用10mL CH2Cl2溶解，N2保护下滴加HMDS 148mg(0.92mmol)，室温反应12小时，用10mL二氯甲烷稀释，分别用5％Na2S2O3溶液、盐、水洗后，有机层用无水硫酸钠干燥、蒸干。硅胶柱层析分离纯化(乙酸乙酯∶石油醚：6∶1)得R-(+)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(1)48mg，产率86％。[α]D 20+0.4(c 1，acetone)；ESI-MS m/z 245.2[M+H]+。
4 (2R，3′R)+(2S，3′R)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(2)的制备取R-(+)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(1)15mg(0.06mmol)和NaBH4 23mg(0.60mmol)置于25mL单口瓶中，-10℃下搅拌加入4mL乙酸，缓慢升温至50℃，反应48小时，饱和碳酸氢钠溶液终止反应，等体积乙酸乙酯萃取，经无水硫酸钠干燥后减压除去乙酸乙酯，得到白色固体，经HPLC分离纯化(以甲醇-水75∶25洗脱)得到白色结晶粉末7.4mg，收率50％。[α]D 20+1.3(c 1，acetone)，mp 86-87℃；ESI-MS m/z247.2[M+H]+；1H NMR(600MHz，CDCl3)δ：7.88(2H，d，J＝7.7Hz，H-5)，7.30(2H，t，J＝7.3Hz，H-7)，6.84(2H，t，J＝7.3Hz，H-6)，6.66(2H，d，J＝7.7Hz，H-8)，5.71(2H，brs，H-3)，4.96(2H，‘t’like，J＝3.7Hz，H-2)，4.06(2H，brs，H-1)，1.58(2H，m，H-2′a)，1.55(2H，m，H-4′a)，1.50(2H，m，H-3′)，1.40(2H，m，H-2′b)，1.34(6H，m，H-4′b/H-5′)，1.33(4H，m，H-6′)，0.98(3H，t，J＝7.8Hz，H-1′)/0.96(3H，t，J＝7.8Hz，H-1′)，0.92(3H，t，J＝6.9Hz，H-7′)/0.90(3H，t，J＝6.9Hz，H-7′)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ：165.70/165.66(C-4)，147.9(2C，C-8a)，133.9(2C，C-7)，128.6(2C，C-5)，119.2(2C，C-6)，115.8(2C，C-4a)，114.7(2C，C-8)，67.4(2C，C-2)，44.2(2C，C-3′)，29.8/29.7(C-5′)，28.6(2C，C-4′)，23.1(2C，C-6′)，22.0(2C，C-2′)，14.1(2C，C-7′)，12.0/11.9(C-1′)。
5 S-(-)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(3)的制备
制备方法同化合物1：以拆分得到的S-(+)-2-乙基己酸80mg(0.56mmol)和草酰氯142mg(1.12mmol)反应得S-(+)-2-(2-ethylhexanamido)benzamide 115mg，产率80％，[α]D 20+1.6(c 1，acetone)，mp 148-149℃；波谱数据同化合物7。法一：由S-(+)-2-(2-ethylhexanamido)benzamide 90mg与饱和NaHCO3可得白色结晶381mg，收率97％。[α]D 20-0.9(c 1，acetone)；法二：由S-(+)-2-(2-ethylhexanamido)benzamide 60mg(0.23mmol)和I2175mg(0.69mmol)及HMDS 148mg(0.92mmol)反应得化合物347mg，产率84％。[α]D 20-1.1(c 1，acetone)，mp 93-94℃；波谱数据同化合物1。
6 (2R，3′R)+(2S，3′R)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(4)的制备
制备方法同化合物2：由S-(-)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one 20mg(0.082mmol)和NaBH4 32mg(0.82mmol)反应，得化合物2 10.4mg，产率52％。[α]D 20+1.3(c 1，acetone)。mp 89-90℃，ESI-MS m/z 247.2[M+H]+；1H NMR(600MHz，CDCl3)δ：7.87(2H，d，J＝7.7Hz，H-5)，7.28(2H，t，J＝7.7Hz，H-7)，6.82(2H，t，J＝7.7Hz，H-6)，6.67(2H，d，J＝7.7Hz，H-8)，6.39(2H，brs，H-3)，4.94(2H，dd，J＝3.3，6.6Hz，H-2)，4.19(2H，brs，H-1)，1.62(2H，m，H-2′a)，1.56(2H，m，H-4′a)，1.52(2H，m，H-2′b)，1.45(2H，m，H-3′)，1.39(2H，m，H-4′b)，1.32(4H，m，H-5′)，1.30(4H，m，H-6′)，0.97(3H，t，J＝6.6Hz，H-1′)/0.95(3H，t，J＝6.6Hz，H-1′)，0.89(3H，t，J＝6.6Hz，H-7′)/0.88(3H，t，J＝6.6Hz，H-7′)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ：165.73/165.70(C-4)，147.9(2C，C-8a)，133.8(2C，C-7)，128.6(2C，C-5)，119.1(2C，C-6)，115.8(2C，C-4a)，114.7(2C，C-8)，67.4(2C，C-2)，44.2(2C，C-3′)，29.8/29.7(C-5′)，28.6(2C，C-4′)，23.13/23.09(C-6′)，22.0(2C，C-2′)，14.1(2C，C-7′)，12.0/11.9(C-1′)。
7 (±)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(5)的制备
制备方法同化合物1：以(±)-2-乙基己酸108mg(0.75mmol)和草酰氯190mg(1.5mmol)反应得(±)-2-(2-ethylhexanamido)benzamide 169mg，产率86％。由(±)-2-(2-ethylhexanamido)benzamide 120mg(0.46mmol)和I2 350mg(1.38mmol)及HMDS 296mg(1.84mmol)反应得化合物(±)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(5)95mg，产率85％。[α]D 20(c 1，acetone)，mp 115-116℃。
8 (±)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(6)的制备
制备方法同化合物2：由(±)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(5)20mg(0.082mmol)和NaBH432mg(0.82mmol)反应，得化合物69.6mg，产率48％。[α]D 20(c 1，acetone)；mp 76-80℃。
【实施例3】抗白色念珠菌活性的测试
1 实验样品及实验方法
被测样品及阳性对照药溶液的配制：测试样品为上述实施例1中分离精制的纯品化合物R-(+)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(1)和(2R，3′R)+(2S，3′R)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(2)及其化学合成的S-(-)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(3)和(2R，3′S)+(2S，3′S)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(4)、(±)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(5)和(±)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(6)，以及阳性对照药酮康唑纯品(日本东京化成)。准确称取适量样品，用甲醇按二倍稀释法配制成所需浓度的溶液，即10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL、0.15625μg/mL、0.078125μg/mL供活性测试。
致病菌白色念球菌培养：活性测试采用致病菌白色念球菌。取冻存保藏的白色念珠菌适量，接种到YPD培养基的斜面上活化(培养基组成为：酵母膏1％、葡萄糖2％、蛋白胨2％、琼脂2％、pH＝7.0)。取斜面培养3天的白色念球菌适量，接种到装有150mL培养液(培养基组成为：酵母膏1％、葡萄糖2％、蛋白胨2％、pH＝7.0)的500mL锥型瓶中，在28℃、120rps/min的条件下摇床培养24小时，获得白色念球菌的种子培养液。用涂布棒将该种子培养液均匀的涂抹在YPD培养菌的平板上，供活性测试。
纸片法测定实验样品的抑菌活性实验：将上述配制好的各个浓度的样品，吸取10μL滴加在直径为6mm的灭菌滤纸片上。无菌操作将加有样品的滤纸片贴在上述制备好的带有菌的平板上。28℃培养12小时，观察抑菌圈直径大小，以看不到抑菌圈的最大浓度为该样品的最小抑制浓度(MIC)。
2 实验结果
化合物R-(+)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(1)、(2R，3′R)+(2S，3′R)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(2)、S-(-)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(3)和(2R，3′S)+(2S，3′S)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(4)、(±)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(5)和(±)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(6)对白色念球菌具有强的抑制活性，其MIC分别为2.5、2.5、1.3、5.0、10.2、10.1μM，阳性对照药酮康唑的MIC为0.2μM。其中，S-构型的喹唑啉酮生物碱(3)的活性最强，表明S-构型和2，3-双键可能是活性基团，而外消旋的产物则降低其抑菌活性。
3结论
化合物R-(+)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(1)、(2R，3′R)+(2S，3′R)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(2)、S-(-)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(3)和(2R，3′S)+(2S，3′S)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(4)、(±)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(5)和(±)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(6)对白色念珠菌的生长具有较强抑制作用。因此，本发明的式I、II化合物、特别是具有S-构型的喹唑啉酮生物碱可作为白色念珠菌抑制剂用于治疗白色念珠菌感染所导致的疾病，还可作为抑制白色念珠菌的低分子生物探针用于生命科学研究。
Claims (10)
1.式I、或式II化合物
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6为氢、烃基、氨基、烷氧基、羟基、酰基、酰氧基、酰氮基或芳香基团。
2.权利要求1所述的式I的1个天然产物R-(+)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(1)，其中R2、R3、R4、R5和R6均为氢；式II的1个天然产物(2R，3′R)+(2S，3′R)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(2)，其中R1、R2、R3、R4、R5和R6均为氢。
3.权利要求1所述的式I的2个合成产物(式I，R2、R3、R4、R5和R6均为氢)：S-(-)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(3)、外消旋体(±)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(5)及其2个还原产物(式II，R1、R2、R3、R4、R5和R6均为氢)：非对映体混合物(2R，3S)+(2S，3′S)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(4)、(±)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(6)。
4.权利要求2所述的式I、II化合物的制备方法，其特征是液体发酵培养蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)041381，获取含有上述式I、II化合物的发酵物，然后从发酵物中分离纯化出式I化合物R-(+)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(1)和式II的-对非对映体混合物(2R，3′R)+(2S，3′R)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(2)。
5.权利要求4所述的制备方法，将所述发酵物经火孔树脂柱层析，以乙醇、水为溶剂梯度洗脱，乙醇-水70∶30洗脱物具有抗白色念珠菌的活性；此部分再经反相硅胶柱层析，甲醇、水为溶剂进行梯度洗脱，其中甲醇-水80∶20洗脱物，再经Sephadex LH-20柱层析，所得氯仿-甲醇1∶1洗脱产物，最后经HPLC分离纯化(甲醇-水75∶25)洗脱得式I化合物R-(+)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(1)和式II的一对非对映体混合物(2R，3′R)+(2S，3′R)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(2)。
6.权利要求5所述的式I、II化合物的微生物制备方法，其生产菌是蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)041381，保藏编号为：CCTCC M 203030。
7.权利要求2所述的式I化合物的化学制备方法，由R-(-)-2-乙基己酸为原料，经草酰氯制为酰氯后，与邻氨基苯甲酰胺反应，所得到的反应物在碳酸氢钠饱和溶液中回流或与六甲基二硅胺(HMDS)和I2反应，所得产物经HPLC分离纯化(甲醇-水75∶25洗脱)得式I化合物R-(+)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(1)。化合物1经NaBH4还原，所得产物经HPLC分离纯化(甲醇-水70∶30洗脱)得式II的一对非对映体混合物(2R，3′R)+(2S，3′R)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(2)。
8.权利要求3所述的式I、II化合物的化学制备方法，由S-(+)-2-乙基己酸为原料，以权力要求7所述的方法制得S-(-)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(3)和混合物(2R，3′S)+(2S，3′S)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(4)；由(±)-2-乙基己酸为原料，同样方法可得(±)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(5)和(±)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(1H)-one(6)。
9.权利要求1所述的式I、II化合物在制备白色念珠菌抑制剂的用途。
10.权利要求1所述的式I、II化合物在制备抗白色念珠菌药物中的用途。
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