CN101805259B - 一种单萜衍生物及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制药，具体的说是一种单萜衍生物及其制备和应用。单萜衍生物如式A所示。将产黄青霉放在固体培养基中，以20-35℃发酵培养30天；发酵产物用过量的乙酸乙酯浸泡2-3次，然后将乙酸乙酯溶液浓缩蒸干得总提取物；将上述所得总提取物用氯仿-甲醇溶解提取物，溶解物用硅胶柱进行色谱分离，收集上述以洗脱液体积比1∶1梯度的洗脱组分，将洗脱下的组分经洗脱液为氯仿-甲醇的硅胶柱层析，收集洗脱液体积比20∶1梯度的洗脱组分，再将洗脱下组分用C-18反相柱纯化，纯化后即得单萜衍生物A。所述单萜衍生物具有抑制白菜黑斑病菌的作用。本发明所涉及的化合物A能够有效抑制白菜黑斑病菌的生长，可用作制备抗白菜黑斑病菌的农药。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药，具体的说是一种单萜衍生物及其制备和应用。
背景技术
微生物是生物制药的重要来源，从微生物中寻找活性代谢产物是获得新的抗菌药物的一个重要途径。自从弗莱明发明了青霉素(penicillin)以来，从微生物中发现了很多结构新颖而且活性显著的化合物，很多已经成为药物或在临床研究当中。
黑斑病是十字花科蔬菜中常见的病害之一。该病在白菜、甘蓝及花椰菜上发生较多，以春秋两季发生普遍，流行年份可减产20％-50％。感病后，蔬菜茎叶变枯，品质低劣。病原为芸苔链格孢Alternariabrassicae(Berk.)Sacc.(白菜黑斑病菌)和芸苔生链格孢A.brassicola(Schw.)Wiltshire，属半知菌亚门链格孢属。两种病菌的主要区别是：前者分生孢子梗单生或2～6根丛生，分生孢子多单生，较大，42～138μm×11～28μm，淡橄榄色，喙长，顶端近无色，具15个隔膜，主要危害白菜、油菜、芥菜等。后者分生孢子常串生，8～10个连成一串，较小，50～75μm×11～17μm，色较深，无喙或喙短，主要危害甘蓝和花椰菜。目前抗白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae(Berk.)Sacc.)的天然活性物质少见报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种具有潜在农业药用价值的单萜衍生物及其制备和应用。
为实现上述目的本发明采用的技术方案为：
一种单萜衍生物：所述单萜衍生物如式A所示，
单萜衍生物的制备方法：按以下步骤：
a.将产黄青霉(Penicillium chrysogenum)放在固体培养基中，以20-35℃发酵培养30天；发酵产物用过量的乙酸乙酯浸泡2-3次，然后将浸泡后的乙酸乙酯溶液浓缩蒸干得总提取物；所述固体培养基的组成为：大米100g，陈海水100mL，蛋白胨0.6g；
b.将上述所得总提取物用氯仿-甲醇溶解提取物，溶解物用硅胶柱进行色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯进行洗脱，收集器体积比2∶1至1∶1梯度的洗脱组分，而后将该组分用氯仿-甲醇进行硅胶柱进行色谱分离，收集其体积比20∶1梯度的洗脱组分，洗脱下的组分纯化即得如式A所示化合物。
所述真菌EN24S，用PDA培养基配制成平板斜面培养，以20-35℃培养4-7天；所述PDA培养基成分为：陈海水配制的质量百分比20％的马铃薯浸出液1000mL，葡萄糖20g，琼脂20g，PH 6.5-7.0。其中陈海水配制的质量百分比20％的马铃薯浸出液1000mL：每200g土豆加1000mL陈海水。
所述步骤b中硅胶柱分离时所采用的洗脱液为体积比为1∶0至0∶1的石油醚-乙酸乙酯和体积比为20∶1至1∶1的氯仿-甲醇。
单萜衍生物的应用：所述式A所示单萜衍生物具有抑制白菜黑斑病菌的作用；所述式A所示单萜衍生物在制备抗白菜黑斑病菌农药当中的用途。所述式A所示单萜衍生物在制备抑制白菜黑斑病菌增殖药物当中的用途。所述式A所示单萜衍生物在制备白菜黑斑病菌杀伤剂中的用途。
本发明所具有的优点：
本发明化合物单萜衍生物即(E)-8-乙酰氧基-3-羟基-3，7-二甲基-6-辛烯酸，英文名为(E)-8-acetoxy-3-hydroxy-3，7-dimethyloct-6-enoic acid能够有效抑制白菜黑斑病菌Alternaria brassicae(Berk.)Sacc.的生长，采用滤纸片法抗菌实验发现，其对白菜黑斑病菌Alternariabrassicae(Berk.)Sacc.的抑菌圈直径为17mm，与阳性对照两性霉素B的抑菌活性相当(其抑菌圈直径为18mm)，表明化合物A可用作制备抗白菜黑斑病菌的农药。
具体实施方式
实施例1
单萜衍生物如式A所示，
式A化合物的制备：
a.将真菌产黄青霉Penicillium chrysogenum EN24S培养于PDA(potato dextrose agar)培养基中，将培养基配制成平板，然后将保种管斜面上的菌株挑入平板，28℃培养4-7天，待用；将菌种平板上的EN24S菌株切成约1cm2大小的方块放入含固体培养基的无菌三角瓶中，总共培养100瓶，28℃培养30天。发酵产物用过量的乙酸乙酯浸泡3次，然后将乙酸乙酯溶液浓缩蒸干得总提取物；所述PDA培养基组成为：用陈海水配制的200g的马铃薯浸出液1000ml，葡萄糖20g，琼脂20g，PH 6.5-7.0。
固体培养基的组成为：大米100g，陈海水100mL，蛋白胨0.6g；所述真菌EN24S为产黄青霉Penicillium chrysogenum；陈海水为自然海水经沉降、过滤而得。其中陈海水配制的质量百分比20％的马铃薯浸出液1000mL：每200g土豆加1000mL陈海水。
b.将上述所得总提取物用用体积比为1∶1的氯仿-甲醇溶解提取物，溶解物用硅胶柱进行色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯进行洗脱，收集器体积比1∶1梯度的洗脱组分，而后将该组分用氯仿-甲醇进行硅胶柱进行色谱分离，收集其体积比20∶1梯度的洗脱组分，洗脱下组分用体积比为4∶1的甲醇-水进行C-18反相柱纯化，纯化后即得无色油状如式A所示化合物。其结构鉴定为(E)-8-乙酰氧基-3-羟基-3，7-二甲基-6-辛烯酸，英文名为(E)-8-acetoxy-3-hydroxy-3，7-dimethyloct-6-enoic acid。
式A所示化合物的实验数据：[α]D 20：+1.4(c 0.14，CH3OH).IR(KBr)Vmax：3178，2969，2938，1727，1700，1442，1380，1293cm1.ESI-MS：m/z 267[M+Na]+，511[2M+Na]+。式A所示化合物的NMR数据如表1所示。
表1式A所示化合物的NMR数据(500MHz，in CDCl3)
实施例2：用滤纸片法检测式A所示化合物抗白菜黑斑病菌Alternaria brassicae(Berk.)Sacc.的活性。
1.材料：
1.1沙氏培养基：葡萄糖40g，蛋白胨10g，水1000ml。
1.2滤纸片：用打孔机将滤纸制成直径为5mm大小的圆纸片。
1.3配制含0.25Tueen-20的0.85％氯化钠水溶液备用。
1.4麦氏比浊管(1.5×108CFU/ml)：配制0.048M氯化钡0.5ml和0.18M硫酸99.5ml，将二液混合，放暗处保存。存放期为六个月，用前混匀，并且需要进一步稀释成1×106CFU/ml。
1.5实验用菌株：白菜黑斑病菌Alternaria brassicae(Berk.)Sacc.
1.6两性霉素B(Sigma)。
2.操作步骤：
2.1将斜面上的白菜黑斑病菌挑入含沙氏培养基的平板，28℃培养4-7天，直至菌落铺满整个平板。
2.2取1mL 0.85％氯化钠溶液加入长满白菜黑斑病菌的平板上，然后用玻璃刮刀将菌轻轻刮下，再吸入含0.85％氯化钠溶液的无菌试管中备用。
2.3将试管中菌液与麦氏比浊管进行浓度比对，确定菌液浓度在1×106CFU/mL左右。
2.4用玻璃刮刀将比对好的菌液涂布到平板上，晾干后备用。
2.5将2μL式A所示化合物溶液(浓度为10mg/mL，溶剂为甲醇)、2μL两性霉素B溶液(作为阳性对照，浓度为10mg/mL，溶剂为甲醇)和2μL甲醇(作为空白对照)分别加入到滤纸片上，晾干备用。
2.6将含式A所示化合物、两性霉素B以及作为空白对照的滤纸片贴到涂满白菜黑斑病菌菌液的平板上，28℃培养24小时后，测量抑菌圈直径。
实验结果如表2所示。实验结果表明，加入式A所示化合物20微克到滤纸片上时对白菜黑斑病菌Alternaria brassicae(Berk.)Sacc.的抑菌圈直径为17mm，与阳性对照两性霉素B的抑菌活性相当(加到滤纸片上也为20微克，其抑菌圈直径为18mm)。说明式A所示化合物具有较强的抗白菜黑斑病菌Alternaria brassicae(Berk.)Sacc.活性，可用于制备抗白菜黑斑病菌的农药。
表2式A所示化合物的抗菌活性实验结果
Claims (7)
1.一种单萜衍生物，其特征在于：所述单萜衍生物如式A所示，
2.一种按权利要求1所述的单萜衍生物的制备方法，其特征在于：按以下步骤：
a.将产黄青霉(Penicillium chrysogenum)放在固体培养基中，以20-35℃发酵培养30天；发酵产物用过量的乙酸乙酯浸泡2-3次，然后将浸泡后的乙酸乙酯溶液浓缩蒸干得总提取物；所述固体培养基的组成为：大米100g，陈海水100mL，蛋白胨0.6g；
b.将上述所得总提取物用氯仿-甲醇溶解提取物，溶解物用硅胶柱进行色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯进行洗脱，收集体积比2∶1至1∶1梯度的洗脱组分，而后将该组分用氯仿-甲醇进行硅胶柱进行色谱分离，收集其体积比20∶1梯度的洗脱组分，洗脱下的组分纯化即得如式A所示化合物。
3.按权利要求2所述的单萜衍生物的制备方法，其特征在于：所述产黄青霉(Penicillium chrysogenum)，用PDA培养基配制成平板斜面培养，以20-35℃培养4-7天；所述PDA培养基成分为：陈海水配制的质量百分比20％的马铃薯浸出液1000mL，葡萄糖20g，琼脂20g，pH 6.5-7.0。
4.按权利要求2所述的单萜衍生物的制备方法，其特征在于：所述步骤b中硅胶柱分离时所采用的洗脱液为体积比为1∶0至0∶1的石油醚-乙酸乙酯和体积比为20∶1至1∶1的氯仿-甲醇。
5.一种按权利要求1所述的单萜衍生物的应用，其特征在于：所述式A所示单萜衍生物在制备抗白菜黑斑病菌农药当中的用途。
6.一种按权利要求1所述的单萜衍生物的应用，其特征在于：所述式A所示单萜衍生物在制备抑制白菜黑斑病菌增殖药物当中的用途。
7.一种按权利要求1所述的单萜衍生物的应用，其特征在于：所述式A所示单萜衍生物在制备白菜黑斑病菌杀伤剂中的用途。
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| J.J. Diliberto et al..Metabolism of citral, an a,b-unsaturated aldehyde, in male F344 rats.《Drug Metabolism and Disposition》.1990,第18卷(第6期),866-875. * |
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