CN101880302B - 一种多羟基甾醇衍生物及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术,具体的说是一种多羟基甾醇衍生物及其制备和应用。所述多羟基甾醇衍生物如式A所示,制备方法为将真菌产黄青霉Penicillium chrysogenum于PDA以20-35℃培养4-7天作为菌种;将上述菌种接种于固体培养基中,以20-35℃发酵培养30-35天;所得发酵产物用过量的乙酸乙酯浸泡2-3次,而后浓缩蒸干;而后采用硅胶柱进行色谱分离,即得式A化合物。所述式A所示多羟基甾醇衍生物具有抑制真菌的作用。本发明制备所得多羟基甾醇衍生物利用微生物进行发酵生产,具有操作工艺简单,生产周期短、产品成本低的特点。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术,具体的说是一种多羟基甾醇衍生物及其制备和应用。
背景技术
真菌是具有真核和细胞壁的异养生物。种属很多,已报道的属达1万以上,种超过10万个。其营养体除少数低等类型为单细胞外,大多是由纤细管状菌丝构成的菌丝体。在报道的文献中,很多真菌是病原微生物。如:黑曲霉Aspergillus niger能引起水分较高粮食的霉变,黄曲霉Aspergillusflavus能引起幼蚕期的一些重要疾病等等。目前已有文献报道甾醇衍生物的抗真菌活性(Gallimore W A et al.,J.Nat.Prod.,2001,64,741-744;Bruno I etal.,J.Nat.Prod.,1993,56,1057-1064;Chludil H D et al.,J.Nat.Prod.,2005,68,1279-1283)。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种具有抗真菌活性的多羟基甾醇衍生物,及其提取、制备该衍生物的方法。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
一种多羟基甾醇衍生物:所述多羟基甾醇衍生物如式A所示:
制备方法,按如下步骤:
1)将真菌产黄青霉EN-24S于PDA以20-35℃培养4-7天作为菌种;
2)将上述菌种接种于固体培养基中,以20-35℃发酵培养30-35天;所得发酵产物用过量的乙酸乙酯浸泡2-3次,而后浓缩蒸干得总提取物;
3)将上述所得总提取物用氯仿-甲醇溶解,然后用硅胶柱进行色谱分离,先经石油醚-乙酸乙酯洗脱后再由氯仿-甲醇洗脱;
4)收集上述由氯仿-甲醇体积比20∶1至10∶1的梯度洗脱下的组分,将洗脱组分再由硅胶柱层析,收集洗脱液体积比10∶1梯度的洗脱组分,纯化后即为式A化合物。
所述PDA培养基成分为:陈海水配制的20%的马铃薯浸出液1000mL、葡萄糖20g和琼脂20g,PH 6.5-7.0。所述陈海水配制的20%的马铃薯浸出液1000mL为每200g马铃薯加入1000mL海水。所述固体培养基的组成为:大米100g,陈海水100mL,蛋白胨0.6g。所述步骤3)中石油醚-乙酸乙酯梯度为1∶0至0∶1;氯仿-甲醇梯度为20∶1至1∶1。所述步骤4)再次硅胶柱层析是的洗脱液为氯仿-甲醇,梯度为20∶1至10∶1;所述步骤4)纯化为将洗脱下组分用C-18反相柱纯化,洗脱液为体积比为5∶1的甲醇-水,即得纯化后式A所示化合物。
多羟基甾醇衍生物的应用:所述式A所示多羟基甾醇衍生物具有抑制真菌的作用。所述式A所示多羟基甾醇衍生物具有抑制黑曲霉Aspergillusniger的作用。所述式A所示多羟基甾醇衍生物可作为制备抗真菌的药物。
本发明化合物多羟基甾醇衍生物即16β-乙酰氧基-3β,6β,7β,11β-四羟基-麦角甾-22-烯,英文名为16β-acetoxy-3β,6β,7β,11β-tetrahydroxy-ergost-22-en能够有效抑制黑曲霉Aspergillus niger的生长,采用滤纸片法抗菌实验发现,其对黑曲霉Aspergillus niger的抑菌圈直径为18mm,表明该化合物可用作制备抗真菌的药物。
本发明所具有的优点:
1.本发明制备所得多羟基甾醇衍生物可以作为具有抗真菌作用的新药物成分或先导化合物。
2.本发明制备所得多羟基甾醇衍生物利用微生物进行发酵生产,具有操作工艺简单,生产周期短、产品成本低的特点。
3.本发明利用微生物发酵法制备抗真菌化合物对环境无污染。
具体实施方式
通过下面给出的具体实施例可进一步了解本发明,但它不是对本发明的限定。
实施例1多羟基甾醇衍生物如式A所示,
式A化合物的制备:
1)将真菌产黄青霉EN-24S培养于PDA(potato dextrose agar)培养基中,将培养基配制成平板,然后将保种管斜面上的菌株挑入平板,以28℃培养4-7天,作为下一步培养的菌种,待用;所述PDA培养基组成为:用陈海水配制的200g的马铃薯浸出液1000mL,葡萄糖20g,琼脂20g,PH6.5-7.0。所述陈海水配制的20%的马铃薯浸出液1000mL为每200g马铃薯加入1000mL海水。陈海水为自然海水经沉降、过滤而得。
2)将上述菌种平板上的EN-24S菌株切成约1cm2大小的方块放入含固体培养基的无菌三角瓶中,总共培养100瓶,28℃培养30天。发酵产物用过量的乙酸乙酯浸泡3次,然后将乙酸乙酯溶液浓缩蒸干得总提取物;所述固体培养基的组成为:大米100g,陈海水100mL,蛋白胨0.6g。
3)将上述所得总提取物用体积比为1∶1的氯仿-甲醇溶解提取物,溶解物用硅胶柱进行色谱分离,硅胶柱分离时先经体积比为1∶0至0∶1梯度的石油醚-乙酸乙酯洗脱,再经体积比为20∶1至1∶1梯度的氯仿-甲醇洗脱;
4)收集上述由氯仿-甲醇体积比20∶1至10∶1的梯度洗脱下的组分,将洗脱组分再由硅胶柱层析,此时洗脱液为梯度为20∶1至10∶1的氯仿-甲醇;收集洗脱液体积比10∶1梯度的洗脱组分,洗脱组分用C-18反相柱纯化,洗脱液为体积比为10∶1的甲醇-水,即得纯化后白色粉末如式A所示化合物。式A所示化合物其结构鉴定为16β-乙酰氧基-3β,6β,7β,11β-四羟基-麦角甾-22-烯,英文名为16β-acetoxy-3β,6β,7β,11β-tetrahydroxy-ergost-22-en。式A所示化合物的实验数据:+72.3(c 0.47,CH3OH).IR(KBr)vmax:3386,2954,2923,2869,1712,1457,1380,1265,1168,1103,1037cm-1.ESI-MS:m/z 529[M+Na]+。式A所示化合物的NMR数据如表1所示。
表1式A所示化合物的NMR数据(500MHz,in acetone-d6)
实施例2:用滤纸片法检测式A所示化合物抗黑曲霉Aspergillusniger的活性。
1.材料:
1.1沙氏培养基:葡萄糖40g,蛋白胨10g,水1000ml。
1.2滤纸片:用打孔机将滤纸制成直径为5mm大小的圆纸片。
1.3配制含0.25%Tueen-20的0.85%氯化钠水溶液备用。
1.4麦氏比浊管(1.5×108CFU/ml):配制0.048M氯化钡0.5ml和0.18M硫酸99.5ml,将二液混合,放暗处保存。存放期为六个月,用前混匀,并且需要进一步稀释成1×106CFU/ml。
1.5实验用菌株:黑曲霉Aspergillus niger。
1.6两性霉素B(Sigma)。
2.操作步骤:
2.1将斜面上的黑曲霉Aspergillus niger挑入含沙氏培养基的平板,28℃培养4-7天,直至菌落铺满整个平板。
2.2取1mL 0.85%氯化钠溶液加入长满黑曲霉Aspergillus niger的平板上,然后用玻璃刮刀将菌轻轻刮下,再吸入含0.85%氯化钠溶液的无菌试管中备用。
2.3将试管中菌液与麦氏比浊管进行浓度比对,确定菌液浓度在1×106CFU/mL左右。
2.4用玻璃刮刀将比对好的菌液涂布到平板上,晾干后备用。
2.5将2μL式A所示化合物溶液(浓度为10mg/mL,溶剂为甲醇)、2μL两性霉素B溶液(作为阳性对照,浓度为10mg/mL,溶剂为甲醇)和2μL甲醇(作为空白对照)分别加入到滤纸片上,晾干备用。
2.6将含式A所示化合物、两性霉素B以及作为空白对照的滤纸片贴到涂满黑曲霉菌液的平板上,28℃培养24小时后,测量抑菌圈直径。
实验结果如表2所示。实验结果表明,加入式A所示化合物20微克到滤纸片上时对黑曲霉Aspergillus niger的抑菌圈直径为18mm,与阳性对照两性霉素B的抑菌活性相当(加到滤纸片上也为20微克,其抑菌圈直径为24mm)。说明式A所示化合物具有较强的抗黑曲霉Aspergillus niger的活性,可用于制备抗真菌的药物。
表2 式A所示化合物的抗菌活性实验结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
2.一种按权利要求1所述的多羟基甾醇衍生物的制备方法,其特征在于:按如下步骤:
1)将真菌产黄青霉Penicillium chrysogenum于PDA以20-35℃培养4-7天作为菌种;
2)将上述菌种接种于固体培养基中,以20-35℃发酵培养30-35天;所得发酵产物用过量的乙酸乙酯浸泡2-3次,而后浓缩蒸干得总提取物;
3)将上述所得总提取物用氯仿-甲醇溶解,然后用硅胶柱进行色谱分离,先经石油醚-乙酸乙酯洗脱后再由氯仿-甲醇洗脱;
4)收集上述由氯仿-甲醇体积比20∶1至10∶1的梯度洗脱下的组分,将洗脱组分再由硅胶柱层析,收集洗脱液体积比10∶1梯度的洗脱组分,纯化后即为式A化合物。
3.按权利要求2所述的多羟基甾醇衍生物的制备方法,其特征在于:所述PDA培养基成分为:陈海水配制的20%的马铃薯浸出液1000mL、葡萄糖20g和琼脂20g,pH 6.5-7.0;
所述陈海水配制的20%的马铃薯浸出液1000mL为每200g马铃薯加入1000mL海水。
4.按权利要求2所述的多羟基甾醇衍生物的制备方法,其特征在于:所述固体培养基的组成为:大米100g,陈海水100mL,蛋白胨0.6g。
5.按权利要求2所述的多羟基甾醇衍生物的制备方法,其特征在于:所述步骤3)中石油醚-乙酸乙酯梯度为1∶0至0∶1;氯仿-甲醇梯度为20∶1至1∶1。
6.按权利要求2所述的多羟基甾醇衍生物的制备方法,其特征在于:所述步骤4)再次硅胶柱层析的洗脱液为氯仿-甲醇,梯度为20∶1至10∶1;所述步骤4)纯化为将洗脱下组分用C-18反相柱纯化,洗脱液为体积比为5∶1的甲醇-水,即得纯化后式A所示化合物。
7.按权利要求1所述的多羟基甾醇衍生物的应用,其特征在于:所述式A所示多羟基甾醇衍生物用于制备抗黑曲霉Aspergillus niger的药物。
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