CN103834704A - 一种生物杀菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物杀菌剂及其制备方法，该生物杀菌剂为N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼，由绿针假单胞菌属菌株的遗传改良菌株SN36在液体培养基中进行二级发酵培养制得，所述的菌株SN36在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.7846。与现有技术相比，本发明的生物发酵产物对多种农作物真菌病害的防治具有显著的防治效果，而且通过工业化能够批量生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种生物杀菌剂及其制备方法，尤其是涉及一种生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)及其制备方法。
背景技术
生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)主要来源于绿针假单胞菌株的次生代谢产物，具有广谱抗病性和不易产生抗药性等优点，被认为是一种天然的、具有高效抑制植物病原菌的抗菌物质。具有强烈的抗真菌特性，也抑制部分细菌的活性。但是目前还没有N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼作为生物杀菌剂及其制备方法方面的报道。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种生物杀菌剂及其制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种生物杀菌剂，其特征在于，该生物杀菌剂为N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼，由绿针假单胞菌属菌株的遗传改良菌株SN36培养制得，所述的菌株SN36在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.7846；保藏时间：2013-7-03，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名：绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis。
一种生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将绿针假单胞菌属菌株的遗传改良菌株SN36在液体培养基中进行二级发酵培养，其中第一级为种子液培养，所用培养基为液体培养基A，第二级为发酵培养，所用培养基为液体培养基B；在接种种子液前，加入黏稠剂，以达到细胞富集培养，减少发酵过程泡沫产生，增加IturinA及其同系物产量的目的。接种种子液后，进行发酵培养和流加补料液C的补料发酵培养，发酵结束后，从上述发酵培养液中收集生物农药N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼。
所述的培养基和补料液具体组分按g/m1计为：
液体培养基A：葡萄糖0.8％-6.0％，蛋白胨0.4％-6.0％，牛肉膏0.2％-3.0％，硫酸镁0.06％-1.0％，磷酸二氢钾0.2％-1.0％；
液体培养基B：玉米淀粉2.0％-10.0％，黄豆粉3.0％-12.0％，黄豆芽汁5.0％-15.0％，硫酸镁0.1％-1.2％，磷酸二氢钾0.4％-1.5％；
补料液C：1.0％-6.0％葡萄糖稀释液。
所述的黏稠剂为明胶、琼脂、可溶性淀粉、糊精、黄原胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠CMC中的一种或几种；添加黏稠剂的浓度范围为0.1-100.0g/L发酵液。
所述的黏稠剂的浓度范围为0.5-20.0g/L发酵液。
所述的黏稠剂的流加补料液C的方式为连续流加方式或间歇式流加方式。
所述的黏稠剂的连续流加方式为匀速或非匀速连续流加方式，以0.01-5.0L/h的速度连续流加补料液C，直至停止发酵前8小时。
所述的黏稠剂的间歇式流加的间歇时间为每隔3-24小时补料1-6次，每次补料量为发酵液总体积的0.01％-1.0％。
所述的黏稠剂的间歇式流加每次补料量为发酵液总体积的0.1％-0.5％。
所述的二级发酵培养的温度为26℃-37℃，pH为6-8，时间为3-6天。
发酵结束后，发酵液除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值至2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，进行硅胶柱层析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，以硅胶薄层层析方法检测(展层剂为正丁醇∶冰醋酸∶水=100∶5∶20)。收集生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即得生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品。
采用高效液相色谱法检测生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)，所用条件：色谱柱C1810.7φ°-250mm；流动相为45％乙腈∶水∶10mM醋酸铵；流速1mL/min；检测波长280nm。
采用本发明工艺，在第二级发酵时，液体培养基只流加补料而不用出料，可以维持发酵工艺需求的较好的碳氮比；通过采用一定比例的黏稠剂，提高发酵体系中细菌细胞的浓度，实现较高密度的发酵，大大减少发酵过程产生的泡沫，有利于控制溶解氧浓度、温度等技术参数，从而提高生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1- 甲酰肼)的产量。
在优选的具体实施方案中，本发明还采用例如新菌株等技术方案来进一步提高生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)的产量。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
一、采用液体培养基流加补料发酵，可以维持发酵工艺需求的较好的碳氮比，可以大幅提高生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)的产量。
二、采用一定比例的黏稠剂，有利于提高发酵体系中细菌细胞的浓度，实现较高密度的发酵，大大减少发酵过程产生的泡沫，有利于控制溶解氧浓度、温度等技术参数，从而提高生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)物的产率。
三、提取工艺流程简单，回收率高，操作方便。
具体实施方式
实施例1
用1000mL三角瓶10个，每瓶装300mL培养基A(葡萄糖2.0％、蛋白胨3.0％、牛肉膏0.5％、硫酸镁0.35％和磷酸二氢钾0.3％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的绿针假单胞菌属菌株SN36菌液，置于30℃温度下，摇瓶培养18小时。将培养好的菌种液按5％-10％的接种量接种于内装50L灭菌培养基B、2％黏稠剂(糊精，或黄原胶，或海藻酸钠，或羧甲基纤维素钠(CMC))的100L发酵罐中，(培养基B：淀粉2.0％、乳糖1.0％、蔗糖1.0％、甘油0.5％、葡萄糖1.0％、蛋白胨1.0％、花生粉5.0％、黄豆粉水解液2.0％、生物氮素3.0％、磷酸二氢钾0.1％、氯化钠0.5％和硫酸铁0.5％)。在28℃2-30℃温度下，通气搅拌发酵8-15小时后，以0.1-1.0L/h的速度连续流加培养基C(培养基C：蔗糖2.0％、甘油1.0％、葡萄糖2.0％、乳糖1.0％、蛋白胨2.0％、黄豆粉水解液3.0％、花生粉水解液2.0％和生物氮素2.0％)，直至停止发酵(下罐)前约12小时。发酵PH6-8，发酵周期4天。
发酵结束后，发酵液除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，进行硅胶柱层析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，以硅胶薄层层析方法检测(展层剂为正丁醇∶冰醋酸∶水=100∶5∶20)。收集合生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)的洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，生物杀菌剂(N-邻氯 苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即得生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品。
采用高效液相色谱法检测生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)，所用条件：色谱柱C1810.7φ°-250mm；流动相为45％乙腈∶水∶10mM醋酸铵；流速1mL/min；检测波长280nm。
经检测，经过4天发酵，生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)1.2g/L发酵液，产品回收率达75％以上。
实施例2
用1000mL三角瓶12个，每瓶装300mL培养基A(葡萄糖2.0％、蛋白胨3.0％、牛肉膏0.5％、硫酸镁0.35％和磷酸二氢钾0.3％)，于120℃2灭菌30分钟，冷却后接种活化后的绿针假单胞菌属菌株SN36菌液，置于30℃温度下，摇瓶培养18小时。将培养好的菌种液按5％-10％的接种量接种于内装50L灭菌培养基B、5％黏稠剂(琼脂，或可溶性淀粉，或海藻酸钠，或羧甲基纤维素钠(CMC))的100L发酵罐中，(培养基B：淀粉3.0％、乳糖2.0％、甘油0.6％、废糖蜜3.0％、葡萄糖1.0％、蛋白胨0.1％、花生粉水解液5.0％、黄豆粉水解液2.0％、生物氮素2.0％、磷酸二氢钾0.1％、氯化钠0.5％和硫酸铁0.5％)，在28℃-30℃温度下，通气搅拌发酵10-15小时后，以0.5-2.0L/h的速度连续流加培养基℃(培养基C：糖蜜3.0％、甘油1.0％、葡萄糖2.0％、乳糖1.0％、蛋白胨4.0％、黄豆粉5.0％、花生粉3.0％和生物氮素3.0％)，直至停止发酵(放罐)前约12小时。发酵PH6-8，发酵周期5天。
发酵结束后，发酵液除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，进行硅胶柱层析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，以硅胶薄层层析方法检测(展层剂为正丁醇∶冰醋酸∶水=100∶5∶20)。收集含生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)的洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即得生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品。
采用高效液相色谱法检测生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品，所用条件：色谱柱℃1810.7φ°-250mm；流动相为45％乙腈∶水∶10mM醋酸铵；流速1mL/min；检测波长280nm。
经检测，经过5天发酵，生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品产量可达到1.3g/L发酵液，产品回收率达80％以上。
实施例3
用1000mL三角瓶15个，每瓶装300mL培养基A(葡萄糖3.0％，蛋白胨3.0％，牛肉膏0.8％，硫酸镁0.35％，磷酸二氢钾0.3％)，于120灭菌30分钟，冷却后接种活化后的绿针假单胞菌属菌株SN36菌液，置于30℃温度下，摇瓶培养18小时。将培养好的菌种液按5％-20％的接种量接种于内装50L灭菌培养基B、8％黏稠剂(可溶性淀粉，或糊精，或海藻酸钠)的100L发酵罐中，(培养基B：淀粉2.0％、乳糖2.5％、甘油1.5％、废糖蜜3.0％、葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、花生粉5.0％、黄豆粉2.0％、生物氮素4.0％、磷酸二氢钾0.1％、氯化钠0.5％和硫酸铁0.5％)，在28℃-30℃温度下，通气搅拌发酵10-15小时后，以间歇式流加培养基C(培养基C：蔗糖、糖蜜2.0％、甘油1.0％、葡萄糖2.0％、乳糖1.0％、蛋白胨2.0％、黄豆粉水解液5.0％、花生粉2.0％和生物氮素3.0％)，间歇时间为大约间隔6小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.1％-0.5％。发酵PH6-8，发酵周期5天。
发酵结束后，发酵液除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值至2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，进行硅胶柱层析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，以硅胶薄层层析方法检测(展层剂为正丁醇∶冰醋酸∶水=100∶5∶20)。收集含生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)的洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即得生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品。
采用高效液相色谱法检测生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品，所用条件：色谱柱C1810.7φ°-250mm；流动相为45％乙腈∶水∶10mM醋酸铵；流速1mL/min；检测波长280nm。
经检测，经过5天发酵，生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)量可达到1.1g/L发酵液，产品回收率达80％以上。
实施例4
用1000mL三角瓶12个，每瓶装300mL培养基A(葡萄糖3.0％，蛋白胨3.0％，牛肉膏0.8％，硫酸镁0.35％，磷酸二氢钾0.3％)，于120℃灭菌30分钟， 冷却后接种活化后的绿针假单胞菌属菌株SN36菌液，置于30℃温度下，摇瓶培养18小时。将培养好的菌种液按5％-20％的接种量接种于内装50L灭菌培养基B、4％黏稠剂(明胶，或糊精，或海藻酸钠，或羧甲基纤维素钠(CMC))的100L发酵罐中，(培养基B：淀粉2.0％、乳糖2.5％、甘油1.5％、废糖蜜3.0％、葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、花生粉5.0％、黄豆粉2.0％、生物氮素4.0％、磷酸二氢钾0.1％、氯化钠0.5％和硫酸铁0.5％)，在28℃-30℃温度下，通气搅拌发酵10-15小时后，以0.5-2.0L/h的速度连续流加培养基C(培养基C：蔗糖3.0％、甘油1.0％、葡萄糖2.0％、乳糖1.0％、蛋白胨4.0％、黄豆粉5.0％、花生粉3.0％和生物氮素3.0％)，直至停止发酵(放罐)前约12小时。发酵PH6-8，发酵周期5天。
发酵结束后，发酵液除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，进行硅胶柱层析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，以硅胶薄层层析方法检测(展层剂为正丁醇∶冰醋酸∶水=100∶5∶20)。收集含生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)的洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即得生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品。
采用高效液相色谱法检测生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品，所用条件：色谱柱C1810.7φ°-250mm；流动相为45％乙腈∶水∶10mM醋酸铵；流速1mL/min；检测波长280nm。
经检测，经过5天发酵，生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)可达到1.0g/L发酵液，产品回收率达75％以上。
实施例5
用1000mL三角瓶16个，每瓶装300mL培养基A(葡萄糖2.0％，蛋白胨3.0％，牛肉膏0.5％，硫酸镁0.35％，磷酸二氢钾0.3％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的绿针假单胞菌属菌株SN36，置于30℃温度下，摇瓶培养18小时。将培养好的菌种液按5％-10％的接种量接种于内装50L灭菌培养基B的100L发酵罐中，(培养基B：淀粉2.0％、乳糖2.5％、甘油0.6％、蔗糖3.0％、葡萄糖2.0％、蛋白胨0.5％、花生粉水解液5.0％、黄豆粉水解液2.0％、生物氮素3.0％、磷酸二氢钾0.1％、氯化钠0.5％和硫酸铁0.5％)，在28℃-30℃温度下，通气搅拌发酵10-20小时后，以0.3-1.5L/h的速度连续流加培养基C(培养基C： 蔗糖2.0％、甘油1.0％、葡萄糖2.0％、乳糖1.0％、蛋白胨2.0％、黄豆粉水解液4.0％、花生粉水解液2.0％和生物氮素5.0％)，直至停止发酵(放罐)前约12小时。发酵PH6-8，发酵周期5天。
发酵结束后，发酵液除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，进行硅胶柱层析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，以硅胶薄层层析方法检测(展层剂为正丁醇∶冰醋酸∶水=100∶5∶20)。收集含生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)的洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即生物农药(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品。
采用高效液相色谱法检测生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)，所用条件：色谱柱C1810.7φ°-250mm；流动相为45％乙腈∶水∶10mM醋酸铵；流速1mL/min；检测波长280nm。
经检测，经过5天发酵，生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)量可达到1.2g/L发酵液，产品回收率达80％以上。
实施例6
用1000mL三角瓶15个，每瓶装300mL培养基A(葡萄糖3.0％，蛋白胨3.0％，牛肉膏0.8％，硫酸镁0.35％，磷酸二氢钾0.3％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的绿针假单胞菌属菌株SN36菌液，置于30C温度下，摇瓶培养18小时。将培养好的菌种液按5％-20％的接种量接种于内装50L灭菌培养基B、和10％黏稠剂(可溶性淀粉，或黄原胶，或羧甲基纤维素钠(CMC))的100L发酵罐中，(培养基B：淀粉2.0％、乳糖2.5％、甘油1.5％、废糖蜜3.0％、葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、花生粉5.0％、黄豆粉2.0％、生物氮素4.0％、磷酸二氢钾0.1％、氯化钠0.5％和硫酸铁0.5％)，在28℃-30℃温度下，通气搅拌发酵10-15小时后，以间歇式流加培养基C(培养基C：蔗糖/糖蜜2.0％、甘油1.0％、葡萄糖2.0％、乳糖1.0％、蛋白胨2.0％、黄豆粉水解液5.0％、花生粉2.0％和生物氮素3.0％)，间歇时间为大约间隔6小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.1％-0.5％。发酵PH6-8，发酵周期5天。
发酵结束后，发酵液除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，进行硅胶柱层析， 以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，以硅胶薄层层析方法检测(展层剂为正丁醇∶冰醋酸∶水=100∶5∶20)。收集含生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)的洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即得生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品。
采用高效液相色谱法检测I生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品，所用条件：色谱柱C1810.7φ°-250mm；流动相为45％乙腈∶水∶10mM醋酸铵；流速1mL/min；检测波长280nm。
经检测，经过5天发酵，生物农药(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)0.9g/L发酵液，产品回收率达75％以上。
应用实例1
生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)防治蔬菜真菌病害：番茄叶霉病。
试验方法
番茄叶霉菌(Cladosporium fulvum)孢子纸片法
一、生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)用二甲基甲酰胺溶解，
乙醇稀释溶解、稀释步骤：
1、母液：20mg样品→5mL二甲基甲酰胺，微加热溶解=4mg/mL=4000μg/mL母液。
2、工作液：0.1mL母液→4mL乙醇稀释。0.1mL×4000μg/mL=400μg→400μg/4mL=100μg/mL。
3、加入量1mL=100μg；0.8mL=80μg；0.6mL=60μg；0.4mL=40μg；0.2mL=20μg；皿中对应浓度5μg/mL；4μg/mL；3μg/mL；2μg/mL；1μg/mL。
二、利用含药平皿法测定上述菌株的最小抑菌浓度和有效抑菌浓度，将上述菌株定量加入PDA培养基中，制成含药平皿，然后将沾过叶霉菌孢子悬浮液直径6mm的无菌滤纸片贴于PDA培养基表面，25℃下培养3d后，观察、测量菌落直径，纸片上无叶霉菌长出的浓度为该摇瓶培养液的最小抑菌浓度(MIC)，以μL/mL表示；用游标卡尺测量各菌落直径，样品浓度以1og值计，菌落平均直径转为抑菌机率值，计算出剂量浓度与抑菌机率值的回归方程，得到有效抑菌浓度(EC50)。生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰N-吩嗪-1-甲酰肼的对番茄叶斑病有效抑菌浓度(EC50)评 估值为2.5μL/mL。制得的生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)对番茄叶霉病菌生物效价测定结果见表3：生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼对番茄叶霉病菌室内生物测定结果。
应用实例2
用2％的生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)简称(邻-吩-肼)悬浮剂稀释1000倍-2000倍，作田间喷施，防治番茄叶霉病，防治效果分别为88.7％、86.8％、84.2％。田间试验结果见表4：生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼对番茄叶霉病菌田间试验结果。
应用实例3
生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)防治禾本科真菌病害水稻纹枯病。
试验方法
水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solan)菌饼法
-、生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)用二甲基甲酰胺溶解，乙醇稀释溶解、稀释步骤：
1、母液：20样品→5mL二甲基甲酰胺，微加热溶解=4mg/mL=4000μg/mL母液。
2、工作液：0.1mL母液→4mL乙醇稀释。0.1mL×4000μg/mL=400μg→400μg/4mL=100μg/mL。
3、加入量1mL=100μg；0.8mL=80μg；0.6mL=60μg；0.4mL=40μ.g；0.2mL=20μg；皿中对应浓度5μg/mL；4μ/g/mL；3μg/mL；2μg/mL；1μg/mL。
二、(参照农业部农药室内生物测定试验准则《杀菌剂第2部份：抑制病原真菌菌丝生长试验平皿法》)用游标卡尺测量各菌落直径，样品浓度以1og值计，菌落平均直径转为抑菌机率值，计算出剂量浓度与抑菌机率值的回归方程，得到有效抑菌浓度(EC50)。生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰N-吩嗪-1-甲酰肼对水稻纹枯病的有效抑菌浓度(EC50)评估值为2.0μL/mL。制得的生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)对水稻纹枯病生物效价测定结果见表3：生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼对水稻纹枯病室内生物测定结果。
应用实例4
用2％的生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)简称(邻-吩-肼) 悬浮剂稀释1000倍-2000倍，作田间喷施，防治水稻纹枯病，防治效果分别为92.85％、88.26％、86.80％。田间试验结果见表4：生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼对水稻纹枯病田间试验结果。
实施例7
将绿针假单胞菌属菌株的遗传改良菌株SN36在液体培养基中进行二级发酵培养，其中第一级为种子液培养，所用培养基为液体培养基A(葡萄糖0.8％，蛋白胨0.4％，牛肉膏0.2％，硫酸镁0.06％，磷酸二氢钾0.2％，按g/ml计)，第二级为发酵培养，所用培养基为液体培养基B(玉米淀粉2.0％，黄豆粉3.0％，黄豆芽汁5.0％，硫酸镁0.1％，磷酸二氢钾0.4％，按g/ml计)；在接种种子液前，加入黏稠剂(黏稠剂为明胶、琼脂、可溶性淀粉、糊精、黄原胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠CMC中的一种或几种；添加黏稠剂的浓度范围为0.1g/L发酵液)，以达到细胞富集培养，减少发酵过程泡沫产生，增加IturinA及其同系物产量的目的。接种种子液温度为26℃2-27℃，pH为6-8，时间为3天后，在培养基B中进行发酵培养，温度为26C-27℃，pH为6-8，时间为3天，并以4L/h的速度连续流加补料液C(6.0％葡萄糖稀释液，按g/ml计)，直至停止发酵前8小时，发酵结束后，从上述发酵培养液中收集生物农药N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼。
实施例8
将绿针假单胞菌属菌株的遗传改良菌株SN36在液体培养基中进行二级发酵培养，其中第一级为种子液培养，所用培养基为液体培养基A(葡萄糖6.0％，蛋白胨6.0％，牛肉膏3.0％，硫酸镁1.0％，磷酸二氢钾1.0％，按g/ml计)，第二级为发酵培养，所用培养基为液体培养基B(玉米淀粉10.0％，黄豆粉12.0％，黄豆芽汁15.0％，硫酸镁1.2％，磷酸二氢钾1.5％，按g/mi计)；在接种种子液前，加入黏稠剂(黏稠剂为明胶、琼脂、可溶性淀粉、糊精、黄原胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠CMC中的一种或几种；添加黏稠剂的浓度范围为99-100.0g/L发酵液)，以达到细胞富集培养，减少发酵过程泡沫产生，增加Iturin A及其同系物产量的目的。接种种子液温度为36℃-37℃，pH为6-8，时间为6天后，在培养基B中进行发酵培养，温度为36℃-37℃，pH为6-8，时间为6天，并以5.0L/h的速度连续流加补料液C(6.0％葡萄糖稀释液，按g/ml计)，直至停止发酵前8小时，发酵结束后，从上述发酵培养液中收集生物农药N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼。
所得生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)的结构如下
表1 生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼对番茄叶霉病菌
室内生物测定结果
表2 生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼对番茄叶霉病菌
田间试验结果
表3 生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼对水稻纹枯病菌
室内生物测定结果
表4 生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼对水稻纹枯病菌
田间试验结果
Claims (10)
1.一种生物杀菌剂，其特征在于，该生物杀菌剂为N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰胼，由绿针假单胞菌属菌株的遗传改良菌株SN36培养制得，所述的菌株SN36在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.7846。
2.一种如权利要求1所述的生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将绿针假单胞菌属菌株的遗传改良菌株SN36在液体培养基中进行二级发酵培养，其中第一级为种子液培养，所用培养基为液体培养基A，第二级为发酵培养，所用培养基为液体培养基B；在接种种子液前，加入黏稠剂，接种种子液后，进行发酵培养和流加补料液C的补料发酵培养，发酵结束后，从上述发酵培养液中收集生物农药N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼。
3.根据权利要求2所述的生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述的培养基和补料液具体组分按g/m1计为：
液体培养基A：葡萄糖0.8％-6.0％，蛋白胨0.4％-6.0％，牛肉膏0.2％-3.0％，硫酸镁0.06％-1.0％，磷酸二氢钾0.2％-1.0％；
液体培养基B：玉米淀粉2.0％-10.0％，黄豆粉3.0％-12.0％，黄豆芽汁5.0％-15.0％，硫酸镁0.1％-1.2％，磷酸二氢钾0.4％-1.5％；
补料液C：1.0％-6.0％葡萄糖稀释液。
4.根据权利要求2所述的生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述的黏稠剂为明胶、琼脂、可溶性淀粉、糊精、黄原胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠CMC中的一种或几种；添加黏稠剂的浓度范围为0.1-100.0g/L发酵液。
5.根据权利要求4所述的生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述的黏稠剂的浓度范围为0.5-20.0g/L发酵液。
6.根据权利要求2所述的生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述的黏稠剂的流加补料液C的方式为连续流加方式或间歇式流加方式。
7.根据权利要求6所述的生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述的黏稠剂的连续流加方式为匀速或非匀速连续流加方式，以0.01-5.0L/h的速度连续流加补料液C，直至停止发酵前8小时。
8.根据权利要求6所述的生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述的黏稠剂的间歇式流加的间歇时间为每隔3-24小时补料1-6次，每次补料量为发酵液总体积的0.01％-1.0％。
9.根据权利要求8所述的生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述的黏稠剂的间歇式流加每次补料量为发酵液总体积的0.1％-0.5％。
10.根据权利要求2所述的生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述的二级发酵培养的温度为26℃-37℃，pH为6-8，时间为3-6天。
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN107641633A (zh) * | 2016-07-22 | 2018-01-30 | 上海农乐生物制品股份有限公司 | 一种提高吩胺霉素发酵产量的方法 |
| CN109097411A (zh) * | 2017-06-20 | 2018-12-28 | 上海农乐生物制品股份有限公司 | 一种培养基及用该培养基提高吩胺霉素产量的方法 |
| CN111748501A (zh) * | 2020-07-27 | 2020-10-09 | 浙江嘉冠环保股份有限公司 | 一种牛羊粪生物发酵菌及其制备方法 |
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- 2014-02-25 CN CN201410065238.2A patent/CN103834704A/zh active Pending
Non-Patent Citations (2)
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| 董卉: "假单胞菌抗生素：吩嗪类化合物的检测与藤黄绿菌素的土壤残留分析", 《上海交通大学硕士学位论文》 * |
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