CN101372454B - 一种抑制烟曲霉活性的新化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新的式(I)的化合物，
Description
技术领域
本发明涉及一种具有抗烟曲霉(Aspergillis fumigatus)活性的新化合物，该化合物的制备方法，以及该化合物在制备抑制烟曲霉活性的药物中的应用。具体而言，本发明涉及式(I)的化合物：
背景技术
烟曲霉为半知菌纲曲霉菌属，是一种严重危害工农业生产及人类健康的条件致病真菌。在潮湿环境中，烟曲霉可感染玉米、豆粕等谷物，造成粮食单位产量和质量的下降；烟曲霉也会感染动物，烟曲霉所产生的毒素会引起马脑白质软化症，造成家禽体重减少、腹泻、饲料转化效率低和肝坏死，导致猪的胰脏坏死、肝损伤及肺水肿等。可见烟曲霉能给人类的工农业生产带来极大危害。此外，随着临床上高效广谱抗生素、肾上腺皮质激素、免疫抑制剂的广泛应用，以及AIDS、器官组织移植和化疗等免疫受损病人的逐渐增多，使得条件致病真菌感染日益严重，人类生活健康面临了重大威胁。烟曲霉会给人类生活健康带来重大威胁。早在1848年就有烟曲霉可感染人的报道，目前它仍然是临床上重要的条件致病真菌，并且与1848年相比，其感染率已上升了约14倍，已超过念珠菌成为世界上最常见的真菌感染病害[参见，Nature(自然).2005，438，1105-1115]。
目前临床上广泛用于治疗烟曲霉感染的药物主要是多烯类药物两性霉素B；广谱三唑类药物，如伊曲康唑、伏立康唑；棘白菌素类药物卡泊芬净(caspofungin)。两性霉素B有很强的毒性，能引起高热和肾毒性，所以限制了它的临床应用。唑类药物和棘白菌素类药物虽然有较好的安全性，但持续使用会诱发耐药菌株的出现。例如，以氟康唑为代表的第三代抗真菌药物是目前临床上治疗烟曲霉菌感染的首选药物。氟康唑属咪唑类药物，主要是通过竞争性抑制真菌羊毛甾醇14α去甲基化酶而发挥作用，使羊毛甾醇蓄积、细胞膜结构功能组成如麦角甾醇的合成缺乏，导致真菌膜通透性和膜上许多酶活性改变，从而抑制真菌的生长。但是咪唑类抗真菌药物同时能够作用于人体的多个细胞色素P450蛋白，特别是人类细胞色素P450酶中3A4酶，而细胞色素P450中的3A4及2C8～2C10酶是成人肝脏中主要的酶，因此，大量使用氟康唑后，会造成较严重的不良反应，其不良反应发生率高达10％～16％。因此，寻找对烟曲霉感染有效的防治方法和药剂，已经迫在眉睫[参见，中国处方药.2004，3，69-71]。
发明内容
本发明人在微生物次生代谢产物活性化合物的高通量筛选基础上，发现了生产菌株Geomyces sp.的固体发酵提取物具有烟曲霉抑制活性；通过活性跟踪指导下的进一步分离纯化，制备了本发明的化合物，并通过应用质谱、核磁共振波谱、红外光谱等技术表征其结构式。与专利文献报道的其它类抗烟曲霉化合物相比，本发明的的化合物具有显著的抑制烟曲霉的活性。
具体而言，本发明内容如下：
本发明提供了式(I)的化合物，
本发明还提供了一种利用微生物发酵制备式(I)的化合物的方法，所述方法包括下列步骤：
a)将Geomyces sp.进行固体发酵；
b)向步骤a)的固体发酵培养产物中加入有机溶剂提取，得到提取液，将所述提取液减压蒸馏，得到粗提物；
c)将所述粗提物进行减压硅胶柱层析和凝胶色谱分离而得到活性组分溶液，将所述活性组分溶液用高效液相色谱分离得到式(I)的化合物。其中式(I)的化合物的生产菌株是Geomyces sp.，该菌株分离自南极土壤样品，并于2008年05月07日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为2481。
在如上所述的本发明方法中，本领域技术人员应当理解所述有机溶剂包括多种不溶于水的在室温下是液态的有机溶剂，诸如氯仿、乙酸乙酯、苯、甲苯、二甲苯等，优选地，所述有机溶剂是乙酸乙酯。
本发明还提供了式(I)的化合物在制备抑制烟曲霉(Aspergillis fumigatus)活性的药物中的应用。
式(I)的化合物在作为制备抑制烟曲霉(Aspergillis fumigatus)活性的药物的体外抑菌活性筛选测试中，与文献报道的其它抗烟曲霉化合物相比，式(I)的化合物具有显著的抑制烟曲霉活性的效果。本发明为研究与开发新的抗烟曲霉药物提供了候选化合物。
附图说明
图1是式(I)的化合物的HMQC二维核磁共振图谱。
图2是式(I)的化合物的HMBC二维核磁共振图谱。
菌种保藏
本发明所用的菌种Geomyces sp.于2008年05月07日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为2481。
具体实施方式
实施例1：式(I)的化合物的制备
a.菌株Geomyces sp.的固体发酵
菌株Geomyces sp.的活化。PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000mL，121℃高压蒸汽灭菌30min，制成试管斜面，挑取菌丝体接种于试管斜面上，25℃培养7天；
菌株Geomyces sp.的固体发酵。大米培养基的制备(将100g大米和100mL水加入500mL三角瓶中，浸泡过夜，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却待用)；将制备好的菌悬液(孢子浓度为1×106个/mL)5mL接种于大米培养基上，在25℃无菌培养间培养40天。
b.式(I)的化合物的提取
待发酵完毕，将500mL乙酸乙酯加入三角瓶中提取，重复三次，将乙酸乙酯减压蒸馏至干燥，得到5.0g粗提物；
c.粗提物的分离纯化
将粗提物用正己烷-二氯甲烷体系(100％正己烷→100％二氯甲烷)和二氯甲烷-甲醇体系(100％二氯甲烷→100％甲醇)连续进行减压硅胶柱层析梯度洗脱，按照极性由小到大的顺序将粗提物分成20个组分，在活性跟踪(用纸片抑菌测试法分别测试20个组分对烟曲霉的抑制活性)指导下，发现在二氯甲烷∶甲醇＝99∶1作为流动相洗脱得到的组分有抑制活性，收集活性洗脱液(200mg)。
将活性洗脱液通过凝胶色谱分离，凝胶柱填料为Sephadex LH-20，流动相是二氯甲烷∶甲醇＝1∶1，按照分子量由大到小的顺序将组分分成15个组分，然后，再通过纸片抑菌测试法分别测试15个组分对烟曲霉的抑制活性，得到30mg活性组分。
将活性组分通过HPLC纯化而得到5.0mg活性的式(I)的化合物，其中HPLC的条件是：采用Agilent 1100型半制备高压液相色谱仪，Agilent C18反相半制备色谱柱(10μm、10×250mm)，流速2.0mL/min，用甲醇和水作为流动相，制备条件：70％甲醇/水等度洗脱40min，得到式(I)的化合物的保留时间tR＝32.4min。
综上，5.0g粗提物经过分离纯化而得到5.0mg式(I)的化合物，其纯度为99％以上，收率为0.1％。
实施例2：式(I)的化合物的表征
对式(I)的化合物进行红外光谱，紫外光谱，有机质谱和核磁共振谱分析，其中红外光谱由北京大学化学学院提供测试(测试仪器型号为NicoletMagna-IR 750)，有机质谱由南京大学提供测试(测试仪器型号为BrukerEsquire 3000plus)，核磁共振谱由中国医学科学院药物研究所提供测试(测试仪器型号为Varian Mercury-400和Varian Mercury-500)。
本发明制备的式(I)的化合物的理化数据为：黄色粉末；分子式：C34H30O14；分子量：662；高分辨质谱HRESIMS：m/z 685.1497[M+Na]+(计算的C34H30O14Na，685.1528)；红外光谱IR(涂膜)νmax：3093(br)，2952，1725，1664，1632，1600，1460，1438，1362，1329，1248，1205，1064，1004，828cm-1；氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)数据见表1：
表1.式(I)的化合物的氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)数据
a在500MHz和在DMSO-d6中测试。b在600MHz和在CD3OD中测试。c在500MHz和在CDCl3中测试。d在100MHz和在CDCl3中测试。
依据上述化合物的理化数据及其氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)数据，再参看附图1和2中该化合物的二维核磁共振谱HMQC和HMBC谱，确证本化合物的结构如下：
实施例3：采用Alamar Blue荧光检测法检测式(I)的化合物对于烟曲霉(Aspergillis fumigatus)活性的抑制
1.试验用试剂：
将本发明制备的式(I)的化合物用二甲亚砜(DMSO)作为溶剂分别配制4、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005及0.002mg/mL的待测溶液；
将阳性对照物氟康唑(购于Sigma公司)用DMSO配制成4mg/mL的溶液；
2.烟曲霉(Aspergillis fumigatus)的培养
将烟曲霉(Aspergillis fumigatus 48238E，该菌由中国科学院微生物研究所菌种保藏中心提供)接种在PDB培养基(淀粉40g/L，葡萄糖20g/L)上，在28℃摇床培养2天后并在显微镜下计孢子数，调整孢子数目在1×105个/mL。
3.试验方法
试验条件如表3所示。
表3活性测试所需体积
| 阴性对照 | 空白对照 | 阳性对照 | 待测药液 | |
| PDB培养基 | 190μL | |||
| 烟曲霉培养液 | 190μL | 190μL | 190μL | |
| 式(I)的化合物溶液 | 1μL | |||
| 氟康唑溶液(4mg/mL) | 1μL | |||
| Alamar Blue染液 | 10μL | 10μL | 10μL | 10μL |
按如表3所示方法，取190μL PDB培养基和10μL Alamar Blue染液加入到96孔板中配成阴性对照组；取190μL烟曲霉培养液和10μL AlamarBlue染液加入到96孔板中配成空白对照组；取190μL烟曲霉培养液，10μL Alamar Blue染液和1μL 4mg/mL的氟康唑加入到96孔板中配成阳性对照组；取1μL本发明制备的式(I)的化合物溶液(浓度分别为4、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005及0.002mg/mL)分别加入到96孔板中，再分别加入190μL烟曲霉培养液，10μL Alamar Blue染液，使供试样品的最终浓度分别为20、10、5、2.5、1.0、0.5、0.25、0.1、0.05、0.025和0.01μg/mL。待药液和菌悬液混和均匀，在28℃及黑暗条件下培养48小时。
用酶标仪(Tecan公司的GENios Plus)在590nm下测试96孔板中每个测试孔的荧光吸收值(OD值)。
计算抑制率I％：I％＝[1-(OD测试药液-OD空白对照)/(OD阴性对照-OD空白对照)]×100％
计算IC50值：IC50＝[CL(IH-50)+CH(50-IL)]/(IH-IL)
CL：低浓度值；CH：高浓度值；IH：高浓度下的I％；IL：低浓度下的I％。
4.试验结果
本发明制备的式(I)的化合物对烟曲霉(Aspergillis fumigatus 48238E)抑制的IC50值为2.21μg/mL。阳性对照物氟康唑的IC50为2.25μg/mL。
结果表明：本发明的式(I)的化合物对烟曲霉(Aspergillis fumigatus48238E)的活性略强于氟康唑对烟曲霉(Aspergillis fumigatus 48238E)的抑制活性。
Claims (4)
1.式(I)的化合物，
2.一种制备如权利要求1所述的式(I)的化合物的方法，所述方法包括下列步骤：
a)将Geomyces sp.进行固体发酵；
b)向步骤a)的固体发酵培养产物中加入有机溶剂提取，得到提取液，将所述提取液减压蒸馏，得到粗提物；
c)将所述粗提物进行减压硅胶柱层析和凝胶色谱分离而得到活性组分溶液，将所述活性组分溶液用高效液相色谱分离得到式(I)的化合物。
3.权利要求2所述的方法，其中所述有机溶剂是乙酸乙酯。
4.如权利要求1所述的式(I)的化合物在制备抑制烟曲霉(Aspergillis fumigatus)活性的药物中的用途。
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| 赵文英.海洋来源真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus)次级代谢产物研究Ⅰ：生物碱.《青岛科技大学学报》.2007,第28卷(第3期),全文. * |
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