CN102517221B - 化合物的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种化合物物1,13-二羟基-6-甲基-6,7,8,9,12,13,14,14a-八烷氢-1H-环戊烷[f][1]环氧十三烷-4(11aH)-酮的制备方法及其应用，由生产菌株，采用固体发酵及提取分离的方法获得。其生产菌株为腊梅拟茎点霉（Phomopsischimonanthi），该菌已于2011年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo5551。本发明制备的该化合物，具有抑制烟曲霉活性。
Description
技术领域
本发明涉及化合物1,13-二羟基-6-甲基-6,7,8,9,12,13,14,14a-八烷氢-1H-环戊烷[f][1]环氧十三烷-4(11aH)-酮的制备方法及其应用。
背景技术
天然产物是发现药物和农药先导化合物的重要来源。天然产物是微生物、植物和动物等在生长发育过程中产生的一些次生代谢产物，其中植物来源的部分天然产物作为传统药物已经使用了几千年，有些至今还在使用，如世界上应用最广的镇痛药阿司匹林（Asprin）来源于柳属（Salix）和杨属（Populus）植物；而第一个销售额超过10亿美元的抗癌药物紫杉醇（Taxol）最初来源于太平洋植物红豆杉的树皮。Fleming和Chain等科学家对青霉素（Penicillin）的研究宣告了从微生物中发现抗生素时代的来临，在随后的几十年中，人们从微生物特别是土壤微生物链霉菌（Streptomycete）中发现了大量的抗生素，不仅减轻了疾病对人类的困扰、提高了生活质量，而且使生物工程、天然药物化学、有机化学等相关学科，以及制药业、农业和工业得到极大发展。
近20年来，由于高通量筛选和组合化学的兴起，大部分制药公司放弃了天然产物药物的研究；然而随着合成农药的残留对环境的破坏，合成药物对人体毒副作用的增强，更重要的因素是经过多年努力后，应用组合化学方法制备的化合物难以达到天然产物丰富的结构多样性，人们又重新审视天然药物研究的重要性。据统计，目前约有40%的处方药物来源于天然产物或其衍生物；过去25年里，美国食品和药品管理局（FDA）批准的抗肿瘤、抗偏头痛、抗高血压的新化学实体中约50%来源于天然产物及其衍生物。
目前以该化合物为母体化合物进行结构改造的化合物多达二十几个，发现了一些具有更好活性的药物候选化合物。由此可见，该化合物是一个药物研究的重要母体化合物，通过化学合成该化合物的成本较高，难度也较大。所以利用微生物发酵制备的方法获得该化合物是一条比较理想的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种天然化合物的具有抗真菌活性的化合物及其应用。通过研究我们研究发现该化合物还可以通过腊梅拟茎点霉（Phomopsis chimonanthi）的固体发酵生产得到，为该化合物的获得提供了另一条途径。经过活性测试，该化合物除了文献报道的活性外，还对烟曲霉生长有抑制作用。我们首次发现了该化合物对烟曲霉也有抑制作用。
本发明专利在微生物次生代谢产物活性化合物的高通量筛选基础上，发现了腊梅拟茎点霉（Phomopsis chimonanthi）的大米发酵粗提物具有抗条件致病菌Aspergillus fumigatus(FGSC A1100)活性，通过活性跟踪，进一步分离纯化，得到了具抗烟曲霉活性的化合物1,13-二羟基-6-甲基-6,7,8,9,12,13,14,14a-八烷氢-1H- 环戊烷[f][1]环氧十三烷-4(11a H) -酮。
本发明的生产菌株为腊梅拟茎点霉（Phomopsis chimonanthi），该菌株已于2011年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所内，保藏号CGMCC No 5551。
一种化合物1,13-二羟基-6-甲基-6,7,8,9,12,13,14,14a-八烷氢-1H- 环戊烷[f][1]环氧十三烷-4(11aH)-酮，其特征是结构式为：
分子式C16H24O4 ；ESI-MS：280；物理性状：无色晶体；它通过权利要求1所述的腊梅拟茎点霉菌（Phomopsis chimonanthi）的固体发酵获得。
一种化合物1,13-二羟基-6-甲基-6,7,8,9,12,13,14,14a-八烷氢-1H- 环戊烷[f][1]环氧十三烷-4(11aH)-酮的制备方法：其特征是包括如下步骤：生产菌株为腊梅拟茎点霉菌（Phomopsis chimonanthi），
（1）腊梅拟茎点霉（Phomopsis chimonanthi）的活化：
PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，水1000 mL，制成试管斜面，挑取菌丝体接种于试管斜面上，25 oC培养7天；得到孢子浓度为1 × 106 个/mL的菌悬液；
（2）腊梅拟茎点霉（Phomopsis chimonanthi）的固体发酵培养：
大米培养基，制备过程为：将100 g大米和100 mL 水加入500 mL三角瓶中，浸泡过夜，灭菌冷却待用；取制备好的菌悬液5 mL接种于大米培养基上，25 oC培养40天；
（3）待发酵完毕，将乙酸乙酯加入三角瓶中提取三次，减压蒸干有机溶剂，得到粗提物；
（4）将粗提物用石油醚-乙酸乙酯-甲醇体系进行减压硅胶柱层析；
（5）将减压硅胶柱层析所得组分：石油醚: 乙酸乙酯= 1:9，通过Sephdex-LH 20分离，洗脱剂为甲醇，所得固体经过重结晶后直接得到目标化合物。
一种化合物1,13-二羟基-6-甲基-6,7,8,9,12,13,14,14a-八烷氢-1H- 环戊烷[f][1]环氧十三烷-4(11aH)-酮的用途：其特征是其对烟曲霉有抑制作用。
本发明的该活性化合物的物化常数、氢谱和碳谱数据分别见表1和2。
表1. 化合物的物化常数
表2. 化合物的核磁数据
本发明的有益效果是，分离得到的该活性化合物经核磁共振波谱，质谱确定1,13-二羟基-6-甲基-6,7,8,9,12,13,14, 14a -八烷氢-1H- 环戊烷[f][1]环氧十三烷-4(11aH)-酮；本发明的化合物在真菌96空微孔板法抑菌活性测试中，在处理时间为24小时，该化合物对烟曲霉的IC50为23.57μg/ml。
具体实施方式
实施例1
化合物1,13-二羟基-6-甲基-6,7,8,9,12,13,14,14a-八烷氢-1H- 环戊烷[f][1]环氧十三烷-4(11aH)-酮的分离制备
a. 腊梅拟茎点霉（Phomopsis chimonanthi）的活化：
PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，水1000 mL，制成试管斜面，挑取菌丝体接种于试管斜面上，25 oC培养7天；得到孢子浓度为1 × 106 个/mL的菌悬液；
b. 腊梅拟茎点霉（Phomopsis chimonanthi）的固体发酵培养：
大米培养基（制备过程为：将100 g大米和100 mL 水加入500 mL三角瓶中，浸泡过夜，灭菌冷却待用）。
将制备好的菌悬液（孢子浓度为1 × 106 个/mL）5 mL接种于大米培养基上，25 oC培养40天；
c. 待发酵完毕，将乙酸乙酯加入三角瓶中提取三次，减压蒸干有机溶剂，得到粗提物。
d. 将粗提物用石油醚-乙酸乙酯-甲醇体系进行减压硅胶柱层析。
e. 将减压硅胶柱层析所得组分（石油醚: 乙酸乙酯= 1:9）通过Sephdex-LH 20分离，洗脱剂为甲醇，所得固体经过重结晶后直接得到目标化合物。
实施例2
采用真菌96空微孔板法抑菌法检测本发明的化合物的抗烟曲霉活性的试验
1 菌悬液的制备
真菌Aspergillus fumigatus在PDB培养基上活化48 h，使菌体处于对数生长期。取1–2个单菌落加入到相应的液体培养基中，调节菌浓度使真菌的菌浓度为0.5–2.5×104 cfu/mL。
2 样品配制
用DMSO或水作溶剂溶解样品。如果是以DMSO为溶剂，由于高浓度DMSO可能对测试菌具有抑制作用，因此要加水稀释（一般DMSO的浓度控制在5%以内）。
3 加样
取洁净无菌的96孔细胞培养板，一般A列作为空白对照，每孔内加入20 μL溶解样品所用的溶剂及180 μL菌悬液；B列作为阳性对照，每孔内加入20 μL标准抗生素溶液与180 μL菌悬液。从C列开始为不同浓度的样品溶液（20 μL）和菌悬液的混合液（180 μL）。在25°C孵育48 h，用酶标仪测定595 nm的OD值。
4. 试验结果
化合物1,13-二羟基-6-甲基-6,7,8,9,12,13,14,14a-八烷氢-1H- 环戊烷[f][1]环氧十三烷-4(11aH)-酮对烟曲霉的IC50为23.57μg/ml。
结果表明：本发明的化合物1,13-二羟基-6-甲基-6,7,8,9,12,13,14,14a-八烷氢-1H- 环戊烷[f][1]环氧十三烷-4(11aH)-酮具有抑制烟曲霉生长的活性。
Claims (2)
1.一种腊梅拟茎点霉（Phomopsis chimonanthi），其特征是该菌株已于2011年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No. 5551。
2.一种化合物1,13-二羟基-6-甲基-6,7,8,9,12,13,14,14a-八烷氢-1H- 环戊烷[f][1]环氧十三烷-4(11aH)-酮的制备方法：其特征是包括如下步骤：生产菌株是如权利要求1所述的腊梅拟茎点霉菌（Phomopsis chimonanthi），
（1）腊梅拟茎点霉（Phomopsis chimonanthi）的活化：
PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，水1000 mL，制成试管斜面，挑取菌丝体接种于试管斜面上，25 oC培养7天；得到孢子浓度为1 × 106 个/mL的菌悬液；
（2）腊梅拟茎点霉（Phomopsis chimonanthi）的固体发酵培养：
大米培养基，制备过程为：将100 g大米和100 mL 水加入500 mL三角瓶中，浸泡过夜，灭菌冷却待用；取制备好的菌悬液5 mL接种于大米培养基上，25 oC培养40天；
（3）待发酵完毕，将乙酸乙酯加入三角瓶中提取三次，减压蒸干有机溶剂，得到粗提物；
（4）将粗提物用石油醚-乙酸乙酯-甲醇体系进行减压硅胶柱层析；
（5）将减压硅胶柱层析所得组分：石油醚: 乙酸乙酯= 1:9，通过Sephdex-LH 20分离，洗脱剂为甲醇，所得固体经过重结晶后直接得到目标化合物；分离得到的该活性化合物经核磁共振波谱，质谱确定1,13-二羟基-6-甲基-6,7,8,9,12,13,14, 14a -八烷氢-1H- 环戊烷[f][1]环氧十三烷-4(11aH)-酮。
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