CN103304614B - 一种抑制肿瘤细胞活性的化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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一种抑制肿瘤细胞活性的新化合物及其制备方法和应用，它是由真菌腊梅拟茎点霉进行固体发酵并对发酵产物进行分离纯化获得，对其结构通过应用质谱、核磁共证波谱等技术进行鉴定。本发明制备的化合物具有抑制肿瘤细胞A549的活性。

Description

一种抑制肿瘤细胞活性的化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种具有抑制肿瘤细胞A549的活性的新化合物，该化合物的制备方法，以及该化合物在制备抑制肿瘤细胞A549活性的药物中的应用。具体而言，本发明涉及式（Ⅰ）的化合物： （Ⅰ）。 
背景技术
式（Ⅰ）的化合物是通过腊梅拟茎点霉（Phomopsis chimonanthi）的发酵制备获得，该化合物是自然界中首次发现的新天然产物，具有抗肿瘤生物活性，是一个具有很大潜在价值的药物先导化合物。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种新天然化合物的制备。通过研究我们发现了腊梅拟茎点霉（Phomopsis chimonanthi）的固体发酵能够生产得到一种新天然产物3S, 22R, 26-三羟基-8, 24E- 11-羰基-大戟二烯醇。经过活性测试，该化合物具有抑制人肿瘤细胞A549的活性。这也是我们首次在自然界中发现了该化合物。 
本发明专利在微生物次生代谢产物活性化合物的高通量筛选基础上，发现了腊梅拟茎点霉（Phomopsis chimonanthi）的大米发酵粗提物具有抑制肿瘤细胞活性，通过活性跟踪，进一步分离纯化，得到了新化合物3S, 22R, 26-三羟基-8, 24E- 11-羰基-大戟二烯醇。 
本发明的生产菌株为腊梅拟茎点霉（Phomopsis chimonanthi），该菌株已于2011年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所内，保藏号CGMCC No. 5551。 
式（Ⅰ）的化合物，其特征是结构式为： 
分子式C30H48O4 ；HRESIMS ：[m/z 495.3462 (M+Na)+; Δ –1.2 mmu]；物理性状：无色粉末；它通过腊梅拟茎点霉（Phomopsis chimonanthi）的固体发酵获得。
式（Ⅰ）的化合物的制备方法：其特征是包括如下步骤：生产菌株为腊梅拟茎点霉（Phomopsis chimonanthi）， 
（1）腊梅拟茎点霉（Phomopsis chimonanthi）的活化：
PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，水1000 mL，制成试管斜面，挑取菌丝体接种于试管斜面上，25 oC培养7天；得到孢子浓度为1 × 106 个/mL的菌悬液；
（2）腊梅拟茎点霉（Phomopsis chimonanthi）的固体发酵培养：
大米培养基，制备过程为：将100 g大米和100 mL 水加入500 mL三角瓶中，浸泡过夜，灭菌冷却待用；取制备好的菌悬液5 mL接种于大米培养基上，25 oC培养40天；
（3）待发酵完毕，将乙酸乙酯加入三角瓶中提取三次，减压蒸干有机溶剂，得到粗提物；
（4）将粗提物用石油醚-乙酸乙酯-甲醇体系进行减压硅胶柱层析；
（5）将减压硅胶柱层析所得组分：石油醚: 乙酸乙酯= 2:8，通过Sephdex-LH 20分离，洗脱剂为1:1 CHCl3-CH3OH，反复分离后直接得到目标化合物。
具体实施方式
实施例1
式（Ⅰ）的化合物的分离制备
a. 腊梅拟茎点霉（Phomopsis chimonanthi）的活化：
PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，水1000 mL，制成试管斜面，挑取菌丝体接种于试管斜面上，25 oC培养7天；得到孢子浓度为1 × 106 个/mL的菌悬液；
b. 腊梅拟茎点霉（Phomopsis chimonanthi）的固体发酵培养：
大米培养基（制备过程为：将100 g大米和100 mL 水加入500 mL三角瓶中，浸泡过夜，灭菌冷却待用）。
将制备好的菌悬液（孢子浓度为1 × 106 个/mL）5 mL接种于大米培养基上，25 oC培养40天； 
c. 待发酵完毕，将乙酸乙酯加入三角瓶中提取三次，减压蒸干有机溶剂，得到粗提物。
d. 将粗提物用石油醚-乙酸乙酯-甲醇体系进行减压硅胶柱层析。 
e. 将减压硅胶柱层析所得组分：石油醚: 乙酸乙酯= 2:8，通过Sephdex-LH 20分离，洗脱剂为1:1 CHCl3-CH3OH，反复分离后直接得到目标化合物。 
实施例2
式（Ⅰ）的化合物的结构鉴定
对式（Ⅰ）的化合物进行有机质谱（测试仪器型号为LTQ Orbitrap XL）和核磁共振谱分析（测试仪器型号为Bruker-600）。根据其高分辨质谱HRESIMS ：[m/z 495.3462 (M+Na)+; Δ –1.2 mmu]，以及分析其氢谱和碳谱核磁数据，我们推出其分子式为C30H48O4。分析该化合物的氢谱、碳谱和HMQC核磁数据，我们得知该化合物含有7个CH3，9个CH2（其中一个与氧原子相连），5个CH，4个季碳，4个烯碳和一个羰基。进一步通过1H–1H COSY、HMBC，我们确定了式（Ⅰ）的化合物的结构如下：
 
本发明的式（Ⅰ）的化合物的氢谱和碳谱及二维核磁共振数据见表1。
表1. 化合物的核磁数据 
     a在125MHz和在DMSO-d 6 中测试；b在600 MHz和在DMSO-d 6 中测试
实施例3
采用MTT法检测本发明的式（Ⅰ）的化合物的抑制肿瘤细胞活性的试验
在96孔板中每孔加入104个细胞，过夜并除去培养基，用50 μL含有0.2% DMSO的培养基溶液或含有适当浓度式（Ⅰ）的化合物的溶液处理每个孔。样品溶液的初始浓度为10 mg/mL（DMSO溶解），再用培养基稀释成所需的浓度。在37°C、5% CO2条件下孵育细胞4小时。孵育结束后，将培养基换成新鲜的DMEM并继续孵育48 h。以下实验均须在避光条件下完成。将MTT溶解在无血清培养基或PBS培养基中，浓度为0.5 mg/mL。超声片刻后除去把每个孔中的培养基，加入50 μL MTT/培养基溶液，在37°C孵育3小时。除去MTT/培养基，每孔加入100 μL DMSO溶液，在60 rpm震荡5 min使沉淀溶解，并除去气泡。用酶标仪测定样品在540 nm的吸光值。
结果表明：本发明的式（Ⅰ）的化合物具有抑制人肿瘤细胞A549的活性，IC50 为 20.32μM。 

Claims (3)

1.一种抑制肿瘤细胞活性的化合物，其特征是它的结构式为
分子式C30H48O4 ；HRESIMS ：[m/z 495.3462 (M+Na)+; Δ –1.2 mmu]；物理性状：无色粉末。
2.一种制备如权利要求1所述的抑制肿瘤细胞活性的化合物的方法，其特征是它包括下列步骤：
生产菌株为腊梅拟茎点霉（Phomopsis chimonanthi），该菌已于2011年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 5551；
（1）腊梅拟茎点霉（Phomopsis chimonanthi）的活化：
PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，水1000 mL，制成试管斜面，挑取菌丝体接种于试管斜面上，25 oC培养7天；得到孢子浓度为1 × 106 个/mL的菌悬液；
（2）腊梅拟茎点霉（Phomopsis chimonanthi）的固体发酵培养：
大米培养基，制备过程为：将100 g大米和100 mL 水加入500 mL三角瓶中，浸泡过夜，灭菌冷却待用；取制备好的菌悬液5 mL接种于大米培养基上，25 oC培养40天；
（3）待发酵完毕，将乙酸乙酯加入三角瓶中提取三次，减压蒸干有机溶剂，得到粗提物；
（4）将粗提物用石油醚-乙酸乙酯-甲醇体系进行减压硅胶柱层析；
    （5）将减压硅胶柱层析所得组分：石油醚: 乙酸乙酯= 2:8，通过Sephdex-LH 20分离，洗脱剂为CHCl3-CH3OH（V:V=1:1），反复分离后直接得到抑制肿瘤细胞活性的化合物。
3.如权利要求1所述的抑制肿瘤细胞活性的化合物在制备抑制肿瘤细胞A549活性的药物中的用途。
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