CN102190612B - 一种天然海藻内生真菌二萜生物碱类化合物及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细菌抑制剂领域，具体地说是一种天然的海藻内生真菌二萜生物碱类化合物及其制备和应用。具体结构式如(I)所示，其制备方法为将米曲霉(Aspergillus oryzae)cf-2接种于培养基中静止发酵，发酵液经乙酸乙酯萃取浓缩，菌丝体先用有机溶剂提取，再经乙酸乙酯萃取浓缩，合并浓缩物，得到粗提物；粗提物进行硅胶柱层析，用有机溶剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层层析检测；将以洗脱液体积比0-10∶100梯度，洗脱下的组分进行凝胶柱层析、硅胶柱层析和薄层层析分离纯化得目标化合物。本发明所得二萜生物碱类化合物具有显著的抑菌活性。
Description
技术领域
本发明涉及细菌抑制剂领域，具体地说是一种天然海藻内生真菌二萜生物碱类化合物及其制备和应用。
背景技术
致病性大肠杆菌通过污染饮水、食品等引起疾病暴发流行，病情严重者，可危急生命，常作为饮水和食物(或药物)的卫生学标准，而由于微生物的变异比较快，不断产生抗药性等，开发新型细菌抑制剂依然十分迫切，其中，微生物源细菌抑制剂具有易大规模培养、成本较低、高效和易降解等优点，其研究与开发尤其引人注目，显示出良好的生态效益、经济效益和社会效益，展现出广阔的发展前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种天然海藻内生真菌二萜生物碱类化合物及其制备和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种天然海藻内生真菌二萜生物碱类化合物：所述海藻内生真菌二萜生物碱类化合物如(I)所示。
制备方法如下步骤制备：
1)将米曲霉(Aspergillus oryzae)cf-2接种于真菌液体培养基中静止发酵20-25天，过滤，发酵液经乙酸乙酯萃取浓缩，收集的菌丝体用有机溶剂提取，而后再经乙酸乙酯萃取浓缩，发酵液所得浓缩物和菌丝体所得浓缩物合并，即为粗提物；
所述米曲霉(Asp.oryzae)cf-2，其于2010年3月1日保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M 2010045，株号为cf-2；
2)取步骤1)中的粗提物进行硅胶柱层析，用有机溶剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层层析检测；
3)收集步骤2)中以洗脱液体积比0-10∶100梯度的洗脱组分，将收集的洗脱组分进行凝胶柱层析、硅胶柱层析和薄层层析分离纯化，纯化收集Rf值为0.5-0.6组分，即得海藻内生真菌二萜生物碱类化合物。
步骤1)中的有机溶剂提取液为氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙醇或甲醇中一种或几种。步骤2)中的有机溶剂为石油醚-乙酸乙酯或石油醚-丙酮。步骤3)所述凝胶柱层析洗脱液为体积比1-2∶1的氯仿-甲醇或氯仿-乙醇；硅胶柱层析洗脱液为乙酸乙酯或丙酮；薄层层析展开剂为乙酸乙酯。步骤3)所述凝胶柱层析时收集经TLC检测含红色斑点的组分。
应用：所述海藻内生真菌二萜生物碱类化合物具有抑菌作用。所述海藻内生真菌二萜生物碱类化合物具有抑制革兰氏阴性细菌活性的作用。所述海藻内生真菌二萜生物碱类化合物具有抑制大肠杆菌活性的作用。
本发明具有以下优点：
本发明通过分离于海洋红藻异管藻的真菌米曲霉(Asp.oryzae)cf-2发酵经提取、分离获得的二萜生物碱类天然化合物，经杀虫活性实验得出二萜生物碱类化合物具有显著的抑菌活性。
具体实施方式：
下面结合实施实例对本发明做进一步阐述。
实施例1
海藻内生真菌二萜生物碱类化合物如(I)所示。
实施例2
二萜生物碱类化合物的制备方法：
取平板上生长良好的真菌米曲霉(Asp.oryzae)cf-2菌种，其于2010年3月1日保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M2010045，株号为cf-2；切成小块接种于PDB液体培养基中，每1L三角瓶中放300mL培养基，共30瓶，室温静止发酵23天，加入发酵液二分之一体积的乙酸乙酯杀灭真菌，过滤，分别收集菌丝体和发酵液。
收集发酵液约9L，用乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩；菌丝体粉碎后用体积比1∶1的氯仿-甲醇提取三次，再用乙酸乙酯萃取，减压浓缩；浓缩物经薄层层析检测其结果相似，合并发酵液和菌丝体两部分的浓缩物为粗提物8g。将粗提物进行200-300目的硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯以100∶0，50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，1∶1到0∶100的梯度进行洗脱，分别收集洗脱液，再用薄层层析(TLC)检测(薄层层析(TLC)检测时用茴香醛-硫酸作为显色剂)，根据Rf值来判断、合并相同或类似部分，获得22个组分(1-22)。将组分20即以石油醚-乙酸乙酯0∶100梯度洗脱下的组分再进行凝胶柱、硅胶柱和薄层层析分离，凝胶柱层析时洗脱液用体积比1∶1为氯仿-甲醇，硅胶柱层析时用乙酸乙酯进行洗脱，洗脱下组分经TLC检测收集含红色斑点的组分，其展为开剂乙酸乙酯，而后通过薄层层析分离(PTLC)用乙酸乙酯为展开剂，收集Rf值为0.5-0.6的组分，得式(I)所示的海藻内生真菌二萜生物碱类化合物(4.9毫克)，经TLC检测，呈单个、均匀红色斑点，确定为纯化合物。经波谱分析，其结构鉴定为一种新的二萜生物碱，结构式如(I)所示，命名为Asporyzin D。
该化合物具有以下理化和波谱特性：
无色油状，核磁共振氢谱(1H NMR，CDCl3，500MHz)δ7.70(br s)，1.58(m)，1.90(m)，1.82(m)，1.88(m)，3.52(t，7.7)，5.72(m)，2.00(m)，2.33(m)，1.64(dd，12.5，3.0)，1.42(m)，1.73(m)，1.58(m)，1.77(m)，2.75(m)，2.32(dd，13.2，3.7)，2.67(dd，13.2，6.4)，7.42(d，7.8)，7.06(t，7.8)，7.08(t，7.8)，7.29(d，7.8)，0.97(s)，1.10(s)，5.72(m)，1.34(s)，1.35(s)，0.86(s)；核磁共振碳谱(13C NMR，CDCl3，125MHz)δ150.8(s)，53.0(s)，39.2(s)，33.4(t)，27.4(t)，73.7(d)，122.6(d)，40.2(t)，42.4(s)，40.6(d)，22.5(t)，25.0(t)，48.8(d)，27.4(t)，118.4(s)，125.1(s)，118.4(d)，119.6(d)，120.5(d)，111.4(d)，139.9(s)，14.5(q)，19.0(q)，141.5(d)，70.8(s)，30.0(q)，30.3(q)，15.7(q)；高分辨质谱(HREIMS)[M]+m/z 421.2982，计算值421.2981。
实施例3
抑菌活性实验：
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)通常称为大肠杆菌，为革兰氏阴性短杆菌，致病性大肠杆菌通过污染饮水、食品等引起疾病暴发流行，病情严重者，可危急生命，常作为饮水和食物(或药物)的卫生学标准，它也是实验室中常用的实验菌种，故借其来评价化合物抑制细菌活性的强弱.
具体为：
实验所用的细菌培养基为LB培养基，用无菌棉签浸取菌悬液，均匀涂于培养基上，测试样品溶解于DMSO中，浓度为6.0毫克/毫升，取5微升样品加到直径为5毫米的无菌滤纸片上(每片30微克)，晾干；并用加有相同体积DMSO并晾干的滤纸片做阴性对照，用氯霉素作为抗细菌的阳性对照，各三个平行。加有样品的平板培养基置于37℃静置培养24小时，观察实验结果，出现抑菌圈的测量其抑菌圈直径。
实验结果：上述获得的二萜生物碱类化合物的抑菌圈直径为8.33毫米，具有的抑制大肠杆菌的活性。
实施例4
与实施例2不同之处在于
取平板上生长良好的真菌米曲霉(Asp.oryzae)cf-2菌种，其于2010年3月1日保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M2010045，株号为cf-2；切成小块接种于PDB液体培养基中，每1L三角瓶中放300mL培养基，共30瓶，室温静止发酵23天，加入发酵液二分之一体积的乙酸乙酯杀灭真菌，过滤，分别收集菌丝体和发酵液。
收集发酵液约9L，用乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩；菌丝体粉碎后用乙醇提取三次，再用乙酸乙酯萃取，减压浓缩；浓缩物经薄层层析检测其结果相似，合并发酵液和菌丝体两部分的浓缩物为粗提物8g。将粗提物进行200-300目的硅胶柱层析，用石油醚-丙酮以100∶0，50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，1∶1，10∶100到0∶100的梯度进行洗脱，分别收集洗脱液，再用薄层层析(TLC)检测(薄层层析(TLC)检测时用茴香醛-硫酸作为显色剂)，根据Rf值来判断、合并相同或类似部分，获得22个组分(1-22)。将组分20即以石油醚-丙酮10∶100梯度洗脱下的组分再进行凝胶柱、硅胶柱和薄层层析分离，凝胶柱层析时洗脱液用体积比2∶1为氯仿-乙醇，硅胶柱层析时用丙酮进行洗脱，洗脱下组分经TLC检测收集含红色斑点的组分，其展为开剂乙酸乙酯，而后通过薄层层析(PTLC)分离用乙酸乙酯为展开剂，收集Rf值为0.5-0.6的组分，得式(I)所示的海藻内生真菌二萜生物碱类化合物。
Claims (4)
1.一种天然海藻内生真菌二萜生物碱类化合物，其特征在于所述海藻内生真菌二萜生物碱类化合物如(I)所示
2.一种按权利要求1所述的天然海藻内生真菌二萜生物碱类化合物的制备方法，其特征在于如下步骤制备：
1)将米曲霉(Aspergillus oryzae)cf-2接种于真菌液体培养基中静止发酵20-25天，过滤，发酵液经乙酸乙酯萃取浓缩，收集的菌丝体用有机溶剂提取，而后再经乙酸乙酯萃取浓缩，发酵液所得浓缩物和菌丝体所得浓缩物合并，即为粗提物，所述有机溶剂提取液为氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙醇或甲醇中一种或几种；
所述米曲霉(Asp.oryzae)cf-2，其于2010年3月1日保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M 2010045，株号为cf-2；
2)取步骤1)中的粗提物进行硅胶柱层析，用有机溶剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层层析检测，所述有机溶剂为石油醚-乙酸乙酯或石油醚-丙酮；
3)收集步骤2)中以洗脱液体积比0-10∶100梯度的洗脱组分，将收集的洗脱组分进行凝胶柱层析、硅胶柱层析和薄层层析分离纯化，纯化收集Rf值为0.5-0.6组分，即得海藻内生真菌二萜生物碱类化合物，所述凝胶柱层析洗脱液为体积比1-2∶1的氯仿-甲醇或氯仿-乙醇；硅胶柱层析洗脱液为乙酸乙酯或丙酮；薄层层析展开剂为乙酸乙酯；
所述凝胶柱层析时收集经TLC检测含红色斑点的组分，薄层层析检测时用茴香醛-硫酸作为显色剂。
3.按权利要求1所述的天然海藻内生真菌二萜生物碱类化合物的应用，其特征在于：所述海藻内生真菌二萜生物碱类化合物在制备抑制革兰氏阴性细菌活性的药物中的用途。
4.按权利要求1所述的天然海藻内生真菌二萜生物碱类化合物的应用，其特征在于：所述海藻内生真菌二萜生物碱类化合物在制备抑制大肠杆菌活性的药物中的用途。
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