CN104250619B - 扩展青霉fp2菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种扩展青霉菌株，命名为扩展青霉FP2，学名为Penicillium？expansum？FP2，保藏编号为CCTCC？NO：M2014040。采用本发明筛选的扩展青霉FP2菌株用于制备棒曲霉素，在制备棒曲霉素的发酵步骤中，由于采用了苹果培养基，所制备的粗提取液中棒曲霉素含量是PDA液体培养基制备量的300倍，产品的成本是sigma公司同类产品的1/380，大大降低了产品的成本。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及到扩展青霉的一种菌株。
背景技术
霉菌能产生丰富多样的具有各种生物活性的次级代谢产物，一些霉菌在基质上生长时也会产生有毒的次级代谢产物——真菌毒素，这些毒素能引起人和动物发生各种疾病。棒曲霉素(Patulin，PAT)，又称展青霉素，是一种具有较强毒性的真菌代谢产物，晶体无色棱形，分子式为C7H6O4，分子量为154，化学名称为4-羟基4-氢-呋喃(3,2-碳)骈吡喃-2(6-氢)酮[4-hydroxy-4-H-furo(3,2c)pyran-2(6H)-one]。在许多因霉菌腐败的水果，如苹果、杏子、蓝莓、樱桃、葡萄、梨、桃子和李子及其制品中都有发现，以苹果发霉最易积累该种毒素。
大量的研究表明，棒曲霉素具有基因毒性和细胞毒性，能导致哺乳动物细胞的DNA损伤[Zhou SM等，2010]，染色体畸变和微核形成[Alves I等，2000；Melo FT等，2012]，并具有致癌性，致畸性，免疫毒性和生殖毒性[Puel O等，2010]，在动物活体内，会损害肾脏、肝脏和肠等器官组织[Saxena N等，2011；Mohan HM等，2012]。因而它成为判断食品质量安全的一个重要指标，受到世界各国及国际组织的极大关注，例如欧盟在2004年就颁布了限制含棒曲霉素食品进口的法令。
随着棒曲霉素污染食品的问题日趋严重，对于其毒性、检测方法和控制技术的研究越来越广泛。无论是基础研究还是检测和控制研究，都需要大量的毒素样品。而市售的棒曲霉素标准品价格昂贵，如：sigma公司98％以上纯度的棒曲霉素P1639-5MG(5mg)的价格是1946.88元人民币，P1639-10MG(10mg)的价格是3601.26元人民币。这大大增加了科学研究工作的成本，一定程度上限制了研究工作。在食品技术领域，当前急需解决的一个技术问题是提供一种生产棒曲霉素成本低、产量大、产品纯度高的菌株。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题在于提供高产棒曲霉素的扩展青霉FP2菌株。
本发明所要解决的另一个技术问题在于为扩展青霉FP2菌株提供一种新用途。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：命名为扩展青霉FP2菌株(Penicilliumexpansum FP2)，于2014年2月19日保藏于武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2014040。
扩展青霉FP2菌株的ITS-5.8S rDNA序列为：
扩展青霉FP2菌株的菌落及细胞形态：
按照常规操作，接种扩展青霉FP2菌株在PDA培养基上，25℃培养7天，菌落直径为30mm，有放射状沟纹，绒毛状，边缘不规则，暗绿色后变橙褐色，边缘白色。分生孢子梗自表生菌丝生出，单生，簇生或孢梗束状生，分生孢子梗茎200～300μm×3μm，顶端呈帚状分枝，多为两层轮生；分生孢子椭圆形，光滑，无色，单胞，3～3.5μm×2.5～3μm，形成不规则链状。
扩展青霉FP2菌株的筛选方法如下：
1、分离纯化
无菌接种针蘸取不同腐烂苹果上的霉点，分别划线接种于PDA固体培养基平板上，28℃培养。待长出的菌落有明显孢子后，无菌接种针蘸取孢子分别划线于PDA固体培养基平板，28℃培养5天，挑取单菌落边缘菌丝分别于PDA斜面上28℃培养7天，加入10mL无菌水，无菌接种针蘸取孢子悬液于PDA固体培养基平板上划线，纯化，28℃培养7天，分别挑取单菌落于PDA斜面4℃冰箱保藏。
2、筛选
每100g去皮苹果块装入250mL三角瓶中，加8层纱布塞，121℃灭菌20分钟，制成无菌苹果培养基；
将分离得到的12株霉菌分别用PDA斜面28℃活化7天后，各加入无菌水制备成浓度为107cfu/mL的孢子悬液，分别取1mL孢子悬液接种于100g无菌苹果培养基中，28℃培养箱中避光培养8天，分别取出培养物，研磨，各加入100mL乙酸乙酯，180r/min避光振荡抽提1小时，静置5～10分钟分层，上层有机相用无水硫酸钠过滤，下层培养物再次用100mL乙酸乙酯抽提2次，合并3次乙酸乙酯抽提液，用无水硫酸钠过滤后，40℃旋转蒸发至干燥，用15mLpH为4.0的冰醋酸水溶液溶出，-20℃保存，每株霉菌平行2组，用0.22μm水系滤膜过滤冰醋酸水溶液溶出物，按照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2008--2007《进出口果汁中棒曲霉毒素的检测方法高效液相色谱法》进行检测，相同条件下比较棒曲霉素的出峰面积，峰面积最大的样品棒曲霉素含量最多。从而筛选出产棒曲霉素最多的菌株，命名为FP2菌株，鉴定，送保藏中心保藏。
上述检测方法中使用色谱柱为：C18柱，250mm×4.6mm(内径)，粒径5μm。
采用扩展青霉FP2菌株制备棒曲霉素的方法如下：
1、发酵
每个250mL三角瓶中装入100g去皮苹果块作为培养基，加8层纱布塞，121℃灭菌20分钟。将扩展青霉FP2菌株接种PDA试管斜面，28℃活化7天，每支试管斜面加入无菌水制备成浓度为107cfu/mL孢子悬液，每个装100g苹果培养基的三角瓶中接入1mL浓度为107cfu/mL的孢子悬液，28℃避光培养10天，获得培养物。
2、分离
取培养物，分别研磨成糊状，每100g加入乙酸乙酯100mL，150～200r/min避光振荡抽提1小时，静置5～10分钟分层，收集上层乙酸乙酯抽提液，下层培养物中加入乙酸乙酯100mL/100g，150～200r/min避光振荡抽提2小时，静置5～10分钟分层，收集乙酸乙酯抽提液，下层培养物中再加入乙酸乙酯100mL/100g，150～200r/min避光振荡抽提1小时，静置5～10分钟分层，合并三次乙酸乙酯抽提液，用无水硫酸钠过滤，40℃旋转蒸发至干燥，用pH为4.0的冰醋酸水溶液定溶至50mL，用0.22μm水系滤膜过滤，得到棒曲霉素的粗提取液。
取棒曲霉素的粗提取液500μL，稀释100倍，按照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2008--2007《进出口果汁中棒曲霉毒素的检测方法高效液相色谱法》检测其中棒曲霉素含量。
使用的色谱柱为：C18柱，250mm×4.6mm(内径)，粒径5μm。棒曲霉素标准品，购于Sigma公司，准确吸取2mL pH为4.0的冰醋酸水溶液，充分溶解10mg棒曲霉素标准品，吸取其中1mL的棒曲霉素溶液，稀释为30mg/L、60mg/L、90mg/L、120mg/L、150mg/L的标准液，以棒曲霉素的出峰面积X为横坐标，棒曲霉素含量Y为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程：
Y＝0.4789X+0.2114(R2为0.9994)
根据绘出的标准曲线和测定出的棒曲霉素峰面积计算棒曲霉素的含量。
3、纯化
-70℃，100Pa冷冻干燥棒曲霉素粗提取液至干，用乙酸乙酯充分溶解，40℃旋转蒸发乙酸乙酯至10～15mL，200～300目硅胶柱层析纯化，用丙酮与二氯甲烷体积比为1:30的洗脱剂洗脱，湿法装柱，干法上样，用薄层层析法检测每管洗脱液中含有棒曲霉素的情况；将含有棒曲霉素的洗脱液合并，40℃避光旋转蒸发至干，溶于10～15mL的石油醚与乙酸乙酯体积比为1:1的溶剂中；再次200～300目硅胶柱层析，用石油醚与乙酸乙酯体积比为1:1的洗脱剂洗脱，湿法装柱，干法上样，用薄层层析法检测每管洗脱液中含棒曲霉素的情况；将只含有棒曲霉素的溶液合并，避光40℃旋转蒸干，溶于5～10mL的乙酸乙酯中，静止放置，得到棒曲霉素产物。
上述薄层层析法的条件为：采用硅胶GF254层析板，乙酸乙酯与石油醚体积比1:2为展开剂，展层3次，在254nm的紫外灯下，对比观察样品与从Sigma公司购买棒曲霉素标准品的Rf值。
4、鉴定
采用核磁共振分析仪，按仪器的使用方法对产物进行分析鉴定。用质谱分析仪，以ESI电离方式对产物进行分析，确定产物的分子量。
采用本发明筛选的扩展青霉FP2菌株用于制备棒曲霉素，在制备棒曲霉素的发酵步骤中，由于采用了苹果培养基，所制备的粗提取液中棒曲霉素含量是PDA液体培养基制备量的300倍，产品的成本是sigma公司同类产品的1/380，大大降低了产品的成本。
附图说明
图1是扩展青霉FP2菌株在PDA培养基上的菌落形态照片。
图2是扩展青霉FP2菌株在显微镜下放大400倍的菌丝及分生孢子照片。
图3是扩展青霉FP2菌株基于ITS-5.8S rDNA序列的邻接法系统发育树。
图4是棒曲霉素标准品的高效液相色谱图。
图5是采用苹果培养基发酵扩展青霉FP2菌株制备的棒曲霉素粗提取液稀释100倍的高效液相色谱图。
图6是用扩展青霉FP2菌株制备的棒曲霉素溶于pH为4.0的冰醋酸水溶液的高效液相色谱图。
图7是由扩展青霉FP2菌株制备的棒曲霉素的1H-NMR谱图。
图8是由扩展青霉FP2菌株制备的棒曲霉素的13C-NMR谱图。
图9是Sigma公司公布的棒曲霉素核磁谱图。
图10是由扩展青霉FP2菌株制备的棒曲霉素的质谱(ESI)分析图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
命名为扩展青霉FP2的菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2014040。
扩展青霉FP2菌株的ITS-5.8S rDNA序列为：
上述扩展青霉FP2菌株的筛选方法如下：
1、分离纯化
无菌接种针分别蘸取3个不同腐烂苹果上的霉点，分别划线接种于6个PDA固体培养基平板上，28℃培养。待长出的菌落有明显孢子后，用无菌接种针蘸取孢子分别划线于PDA固体培养基平板，28℃培养5天。挑取单菌落边缘菌丝分别于12个PDA斜面上28℃培养7天，加入10mL无菌水，用无菌接种针蘸取孢子悬液于12个PDA固体培养基平板上划线，纯化。28℃培养7天，分别挑取单菌落于PDA斜面4℃冰箱保藏。
2、筛选
每100g去皮苹果块装入250mL三角瓶中，加8层纱布塞，121℃灭菌20分钟，制成无菌苹果培养基。
将分离得到的12株霉菌分别用PDA斜面28℃活化7天，各加入无菌水制备成浓度为107cfu/mL的孢子悬液，分别取1mL孢子悬液接种于100g无菌苹果培养基中，28℃培养箱中避光培养8天，分别取出培养物，研磨，加入100mL乙酸乙酯，150～200r/min避光振荡抽提1小时，静置5～10分钟分层，上层有机相用无水硫酸钠过滤，下层培养物再次用100mL乙酸乙酯抽提2次，合并3次乙酸乙酯抽提液，用无水硫酸钠过滤后，40℃旋转蒸发至干燥，用15mL pH为4.0的冰醋酸水溶液溶出，-20℃保存。每株霉菌平行2组。用0.22μm水系滤膜过滤冰醋酸水溶液溶出物，按照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2008--2007《进出口果汁中棒曲霉毒素的检测方法高效液相色谱法》进行检测，相同条件下比较棒曲霉素的出峰面积，峰面积最大的样品棒曲霉素含量最多。从而筛选出产棒曲霉素最多的菌株，命名为FP2菌株。
上述检测方法中使用色谱柱为：C18柱，250mm×4.6mm(内径)，粒径5μm。
对采用本实施例筛选的扩展青霉FP2菌株进行了形态学鉴定以及分子生物学分类鉴定，各种试验情况如下：
1、形态学鉴定
按照常规操作，扩展青霉FP2在PDA培养基上25℃培养7天，菌落直径为30mm，有放射状沟纹，绒毛状，边缘不规则，暗绿色后变橙褐色，边缘白色，菌落形态照片见图1。分生孢子梗自表生菌丝生出，单生，簇生或孢梗束状生，见图2箭头A所示；分生孢子梗茎200～300μm×3μm，顶端呈帚状分枝，多为两层轮生，见图2箭头B所示；分生孢子呈椭圆形，光滑，无色，单胞3～3.5μm×2.5～3μm，形成不规则链状，见图2箭头C所示(图2中标尺为20μm)。
2、分子生物学分类鉴定
采用ITS-5.8S rDNA序列进行分类鉴定：采用CTAB法提取基因组DNA，20μL的PCR反应体系，具体见表1，其中引物ITS1的碱基序列为5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，引物ITS4的碱基序列为5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。
表1PCR反应体系
| 成分 | 含量(μL) |
| DNA模板 | 1.0 |
| ITS1(10μM) | 0.4 |
| ITS4(10μM) | 0.4 |
| 10×Buffer | 2.0 |
| dNTP(2.5mM) | 0.2 |
| Taq聚合酶(5U/μL) | 0.2 |
| 双蒸水 | 15.8 |
| 总计 | 20 |
PCR反应反应条件为：95℃ 5分钟；95℃ 40秒，55℃ 50秒，72℃ 1分钟，共35次循环；72℃延伸5分钟。用1.0％的琼脂糖凝胶检测，使用Easy Pure QuikGel Extraction Kit试剂盒(由北京全式金生物技术有限公司销售)按试剂盒的使用说明书对目的片段进行纯化，送南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定。序列拼接结果见序列表(584bp)。
用Basic BLAST将FP2菌株的ITS序列和NCBI中已登录的ITS rDNA序列进行同源性比较，对比结果发现FP2菌株与多株扩展青霉(Penicillium expansum)的ITS核苷酸序列的同源性在99％以上。用MEGA5.0软件构建的邻位相连法系统发育树(见图3)。结合形态鉴定和同源性比对及系统发育结果，可认定FP2菌株为扩展青霉(Penicillium expansum)。
将扩展青霉FP2(Penicillium expansum FP2)菌株寄存于中国武汉，中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M2014040。
实施例2
采用实施例1筛选的扩展青霉FP2菌株在制备棒曲霉素的用途，其使用方法如下：
1、发酵
取28个250mL三角瓶，每瓶装入100g去皮苹果块作为培养基，加8层纱布塞，121℃灭菌20分钟。将扩展青霉FP2菌株接种PDA试管斜面，28℃活化7天，每支试管斜面加入无菌水制备成浓度为107cfu/mL孢子悬液，在每个装苹果培养基的三角瓶中接入1mL浓度为107cfu/mL的孢子悬液，28℃避光恒温培养10天，获得培养物。
2、分离
取28瓶培养物，分别研磨成糊状，每瓶加入乙酸乙酯100mL，150～200r/min避光振荡抽提1小时，静置5～10分钟分层，收集上层乙酸乙酯抽提液，下层培养物中加入乙酸乙酯100mL/100g，150～200r/min避光振荡抽提2小时，静置5～10分钟分层，收集乙酸乙酯抽提液，下层培养物中再加入乙酸乙酯100mL/100g，150～200r/min避光振荡抽提1小时，静置5～10分钟分层，合并三次乙酸乙酯抽提液，用无水硫酸钠过滤后，40℃旋转蒸发至干燥，用pH为4.0的冰醋酸水溶液定溶至50mL，用0.22μm水系滤膜过滤，得到棒曲霉素的粗提取液。
取棒曲霉素的粗提取液500μL，稀释100倍，按照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2008--2007《进出口果汁中棒曲霉毒素的检测方法高效液相色谱法》检测其中棒曲霉素含量，见图4，图5。
使用的色谱柱为：C18柱，250mm×4.6mm(内径)，粒径5μm。棒曲霉素标准品，购于Sigma公司，准确吸取2mL pH为4.0的冰醋酸水溶液，充分溶解10mg棒曲霉素标准品，吸取其中1mL的棒曲霉素溶液，稀释为30mg/L、60mg/L、90mg/L、120mg/L、150mg/L的标准液，以棒曲霉素的出峰面积X为横坐标，棒曲霉素含量Y为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程：
Y＝0.4789X+0.2114(R2为0.9994)
根据绘出的标准曲线和测定出的棒曲霉素峰面积计算棒曲霉素的含量。测得棒曲霉素粗提取液中含有棒曲霉素1.35×104mg/L，即含有棒曲霉素675mg。
3、纯化
用苹果培养基发酵扩展青霉FP2菌株制备棒曲霉素的粗提取液三批，每批30瓶，高效液相色谱法检测，方法与分离步骤2相同，所得粗提取液中共有棒曲霉素2.139g。
-70℃，100Pa冷冻干燥棒曲霉素的粗提取液至干燥，用100mL乙酸乙酯充分溶解，40℃旋转蒸发乙酸乙酯至10～15mL，200～300目硅胶柱层析纯化，用丙酮与二氯甲烷体积比为1:30的洗脱剂洗脱，湿法装柱，干法上样，用薄层层析法检测每管洗脱液中含有棒曲霉素的情况；将含有棒曲霉素的洗脱液合并，40℃避光旋转蒸发至干，溶于10～15mL的石油醚与乙酸乙酯体积比为1:1的溶剂中；再次200～300目硅胶柱层析，用石油醚与乙酸乙酯体积比为1:1的洗脱剂洗脱，湿法装柱，干法上样，用薄层层析法检测每管洗脱液中含棒曲霉素的情况；将只含有棒曲霉素的溶液合并，避光40℃旋转蒸干，溶于5～10mL的乙酸乙酯中，静止放置，得到棒曲霉素产物1.509g。取该产物70mg溶于1000mLpH为4.0的冰醋酸水溶液中，高效液相色谱仪检测其纯度大于等于98％，见图6，方法同实施例2的分离步骤。
上述薄层层析法的条件为：采用硅胶GF254层析板，乙酸乙酯与石油醚体积比1:2为展开剂，展层3次，在254nm的紫外灯下，对比观察样品与从Sigma公司购买棒曲霉素标准品的Rf值。
4、鉴定
采用氢核磁共振和碳核磁共振，按仪器的使用方法对产物进行分析鉴定。
1H NMR和13C NMR核磁检测：瑞士Bruker公司，AVANCF 300MHz核磁共振仪，图谱见图7和图8，与Sigma公司公布的棒曲霉素核磁图谱数据吻合，见图9。数据表征：1H NMR(300MHz,CDCl3)δ6.07–5.77(m,2H),4.66(d,J＝17.2Hz,1H),4.36(dd,J＝17.2,3.9Hz,1H),3.23(s,1H)；13C NMR(75MHz,CDCl3)δ168.60,149.83,146.26,111.19,107.48,88.87,59.56。这与棒曲霉素相关文献数据吻合。
用Bruker质谱仪对产物进行分析，确定产物的分子量。电离方式：ESI，图谱见图10。C7H6NaO4(M+Na)+:分子量计算值为177.0158，实测值为177.0160，C7H7O4(M+H)+:实测值为155.0340，故纯化的物质分子量为154，与棒曲霉素的分子量吻合。
由以上的核磁共振的表征数据以及质谱仪确定产物的分子量，确认采用扩展青霉FP2(CCTCC NO：M 2014040)菌株制备的产物为棒曲霉素。
为了确定采用扩展青霉FP2制备棒曲霉素的最佳工艺条件，发明人采用苹果培养基与PDA液体培养基进行了实验室对比实验，试验情况如下：
1、发酵
取28个250mL三角瓶，每瓶装入100g去皮苹果块作为培养基；另取28个250mL三角瓶，每瓶装入100mL PDA液体培养基。分别加8层纱布塞，121℃灭菌20分钟；将扩展青霉FP2菌株接种PDA试管斜面，28℃活化7天，每支试管斜面加入无菌水制备成浓度为107cfu/mL孢子悬液，在每个装有培养基的三角瓶中接入1mL孢子悬液；装苹果培养基的三角瓶28℃避光培养10天，装PDA液体培养基的三角瓶28℃150r/min避光振荡培养10天。
2、分离
取28瓶苹果培养物，分别研磨成糊状，每瓶加入乙酸乙酯100mL，150～200r/min避光震荡抽提1小时，静置5～10分钟分层；取28瓶PDA液体培养物，每瓶加入乙酸乙酯100mL，150～200r/min避光振荡抽提1小时，3000r/min离心10分钟辅助分层。分别收集两种培养物的上层乙酸乙酯抽提液，在下层培养物中每瓶加入乙酸乙酯100mL，150～200r/min避光振荡抽提2小时，苹果培养物静置5～10分钟分层，PDA培养物3000r/min离心10分钟辅助分层。分别收集两种培养物的上层乙酸乙酯抽提液，在下层培养物中每瓶加入乙酸乙酯100mL，150～200r/min避光振荡抽提1小时，苹果培养物静置5～10分钟分层，PDA培养物3000r/min离心10分钟辅助分层。分别合并两种培养物的三次乙酸乙酯抽提液，经无水硫酸钠过滤，40℃旋转蒸发至干燥，用pH为4.0的冰醋酸水溶液定溶至50mL，用0.22μm水系滤膜过滤，得到两种棒曲霉素的粗提取液。
分别取两种棒曲霉素的粗提取液500μL，其中苹果培养基制备的粗提取液稀释100倍，按照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2008--2007《进出口果汁中棒曲霉毒素的检测方法高效液相色谱法》检测其中棒曲霉素含量。
使用的色谱柱为：C18柱，250mm×4.6mm(内径)，粒径5μm。棒曲霉素标准品，购于Sigma公司，准确吸取2mL pH为4.0的冰醋酸水溶液，充分溶解10mg棒曲霉素标准品，吸取其中1mL的棒曲霉素溶液，稀释为30mg/L、60mg/L、90mg/L、120mg/L、150mg/L的标准液，以棒曲霉素的出峰面积X为横坐标，棒曲霉素含量Y为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程：
Y＝0.4789X+0.2114(R2为0.9994)
根据绘出的标准曲线和测定出的棒曲霉素峰面积计算棒曲霉素的浓度。测得苹果培养基制备的粗提取液中，棒曲霉素的含量为1.35×104mg/L，即含有棒曲霉素675mg；PDA液体培养基制备的粗提取液中，棒曲霉素含量为41.875mg/L，即含有棒曲霉素2.094mg。
对比试验结果表明，在发酵步骤1中，将等量的扩展青霉FP2菌株孢子悬液加入苹果培养基、PDA液体培养基中，制备的粗提取液中棒曲霉素的含量相差很大，在苹果培养基中产生棒曲霉素量是PDA液体培养基中产生棒曲霉素量的300倍。本发明选择在发酵步骤1中，采用苹果作为培养基。
Claims (2)
1.一种扩展青霉菌株，命名为扩展青霉FP2，学名为Penicillium expansum FP2，保藏编号为CCTCC NO：M2014040，扩展青霉FP2菌株的ITS-5.8S rDNA序列为：
2.权利要求1所述的扩展青霉FP2菌株在制备棒曲霉素中的用途，其使用方法如下：
（1）发酵
取28个250mL三角瓶，每瓶装入100g去皮苹果块作为培养基，加8层纱布塞，121℃灭菌20分钟，将扩展青霉FP2菌株接种PDA试管斜面，28℃活化7天，每支试管斜面加入无菌水制备成浓度为107cfu/mL孢子悬液，在每个装苹果培养基的三角瓶中接入1mL浓度为107cfu/mL的孢子悬液，28℃避光恒温培养10天，获得培养物；
（2）分离
取28瓶培养物，分别研磨成糊状，每瓶加入乙酸乙酯100mL，150～200r/min避光振荡抽提1小时，静置5～10分钟分层，收集上层乙酸乙酯抽提液，下层培养物中加入乙酸乙酯100mL/100g，150～200r/min避光振荡抽提2小时，静置5～10分钟分层，收集乙酸乙酯抽提液，下层培养物中再加入乙酸乙酯100mL/100g，150～200r/min避光振荡抽提1小时，静置5～10分钟分层，合并三次乙酸乙酯抽提液，用无水硫酸钠过滤后，40℃旋转蒸发至干燥，用pH为4.0的冰醋酸水溶液定溶至50mL，用0.22μm水系滤膜过滤，得到棒曲霉素的粗提取液；
（3）纯化
用苹果培养基发酵扩展青霉FP2菌株制备棒曲霉素的粗提取液三批，每批30瓶，高效液相色谱法检测，方法与分离步骤（2）相同；
-70℃，100Pa冷冻干燥棒曲霉素的粗提取液至干燥，用100mL乙酸乙酯充分溶解，40℃旋转蒸发乙酸乙酯至10～15mL，200～300目硅胶柱层析纯化，用丙酮与二氯甲烷体积比为1:30的洗脱剂洗脱，湿法装柱，干法上样，用薄层层析法检测每管洗脱液中含有棒曲霉素的情况；将含有棒曲霉素的洗脱液合并，40℃避光旋转蒸发至干，溶于10～15mL的石油醚与乙酸乙酯体积比为1:1的溶剂中；再次200～300目硅胶柱层析，用石油醚与乙酸乙酯体积比为1:1的洗脱剂洗脱，湿法装柱，干法上样，用薄层层析法检测每管洗脱液中含棒曲霉素的情况；将只含有棒曲霉素的溶液合并，避光40℃旋转蒸干，溶于5～10mL的乙酸乙酯中，静止放置，得到棒曲霉素产物；
（4）鉴定
采用氢核磁共振和碳核磁共振，按仪器的使用方法对产物进行分析鉴定。
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