CN103360351A - 异海松烷二萜化合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从一株印楝内生炭角菌YM311647（Xylariasp.YM311647）的发酵产物中分离获得异海松烷二萜化合物及其应用，属微生物技术领域。本发明的生产菌株YM311647已于2012年9月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：M2012365。本发明由菌株YM311647经常规发酵、提取分离获得三个异海松烷二萜化合物A、B和C。抗真菌活性试验证实该类化合物具有明显的抗真菌活性，具有作为制备新的农用或医用抗真菌药物的潜在用途。

Description

异海松烷二萜化合物及其应用
技术领域
本发明涉及三种化合物，特别是涉及一类来源于印楝内生炭角菌YM311647 (Xylaria sp. YM311647) 的具有抗菌活性的异海松烷二萜化合物及其应用，属微生物技术领域。
背景技术
植物内生真菌具有丰富的多样性，是一大类开发较少的生物资源，能产生多种结构类型的新活性化合物，是重要的活性次生产物来源，已成为国内外的研究热点之一，尤其是从温带和热带植物中寻找内生真菌。印楝 (Azadirachta indica A. Juss) 为热带树种，具有很高的生物农药和医药价值。我们从印楝植物中分离得到一株内生真菌：炭角菌YM311647 (Xylaria sp. YM311647)。
Li等从土壤来源的Xylaria sp. 101的子实体中分离获得Xylarenolide（Y. Y. Li, Z. Y. Hu, C. H. Lu, Y. M. Shen, Helv. Chim. Acta  2010, 93, 796.）；Isaka等从来源于腐木的真菌Xylaria sp. BCC 5484 分离获得hymatoxin E和9-Deoxy-14α-hydroxyhymatoxin E（M. Isaka, U. Srisanoh, M. Sappan, S. Kongthong, P. Srikitikulchai, Phytochemistry Lett.  2012, 5, 78.）；Isaka等从一种真菌Xylaria sp. BCC 4297分离得到Sphaeropsidin C 和xylopimarane（M. Isaka, A. Yangchum, P. Auncharoen, K. Srichomthong, P. Srikitikulchai, J. Nat. Prod.  2011, 74, 300.）
炭角菌属能产生结构类型多样和独特生理活性的代谢产物，对于新药先导化合物的发现具有较高的研究价值。迄今为止鲜见从植物内生真菌来源的炭角菌中分离获得异海松烷二萜化合物的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从印楝内生炭角菌YM311647 (Xylaria sp. YM311647) 的发酵产物中获得的具有抗菌活性的异海松烷二萜化合物及其应用。
本发明的生产菌株为印楝内生炭角菌YM311647菌株，已于2012年9月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No: M 2012365。
本发明采用PDB培养基，将菌株YM311647用常规方法进行发酵培养，将发酵液减压浓缩后，用乙酸乙酯萃取，再将有机相萃取液浓缩后，获得发酵粗提物，通过硅胶（氯仿/甲醇洗脱）、RP-18反相硅胶（甲醇/水洗脱）以及Sephadex LH-20凝胶（甲醇洗脱）反复柱层析，得到三种结构类似的新化合物，三种新化合物分别为异海松烷二萜化合物A，16-O-sulfo-19-oxo-6,19-epoxyisopimar-7-ene（简称化合物A），异海松烷二萜化合物B，16-O-sulfo-18-norisopimar-7-en-4a-ol（简称化合物B）和异海松烷二萜化合物C，14a, 16-epoxy-18-norisopimar-7-en-4a-ol（简称化合物C）。
异海松烷二萜化合物A、异海松烷二萜化合物B和异海松烷二萜化合物C的结构式分别为：
本发明所述的化合物A、B和C溶解于氯仿、丙酮、甲醇、二甲亚砜等，不溶于石油醚和水。
异海松烷二萜化合物A为白色无定形粉末；分子式为C19H32O5S；[a]22 D -36.2 (c 0.15, MeOH); IR (KBr) nmax3454, 2927, 1640, 1430, 1384, 1065, 877 cm-1; HRESIMS m/z 371.1916 [M-H]– (calcd for C19H31O5S, 371.1892)；1H 和13C NMR数据见表1。
异海松烷二萜化合物B为白色无定形粉末；分子式为C20H30O6S；[a]22 D -44.7 (c 0.18, ); IR (KBr) nmax3455, 2928, 2360, 1756, 1640, 1454, 1383, 1225, 1065, 983, 830, 777 cm-1; HRESIMS m/z 421.1643 [M + Na]+ (calcd for C20H30O6SNa, 421.1661)；1H 和13C NMR数据见表1。
异海松烷二萜化合物C为无色油状物；分子式为C19H30O2；[a]22 D -9.2 (c 0.14, MeOH); IR (KBr) nmax3328, 2934, 1643, 1247, 1092, 948, 796 cm-1; HRESIMS m/z 313.2176 [M + Na]+ (calcd for C19H30O2Na, 313.2143)；1H 和13C NMR数据见表1。
表1  化合物A、B和C的1H 和13C NMR数据
Figure 2013102988158100002DEST_PATH_IMAGE002
化合物A的测定溶剂为氘代吡啶；化合物B的测定溶剂为氘代甲醇；化合物C的测定溶剂为氘代氯仿。
本发明的异海松烷二萜化合物在抗真菌活性检测中显示较明显的抑制作用，具有作为制备新的农用或医用抗真菌药物的潜在用途。
具体实施例
实施例1：
化合物A、B和C的分离制备：
1．炭角菌Xylaria sp. YM311647菌株的斜面培养：马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸，纱布过滤，得马铃薯滤液，再加入葡萄糖和琼脂，用蒸馏水定容，灭菌，得斜面培养基；将斜面培养基制成试管斜面，挑取YM311647菌种接入斜面培养基培养，得斜面菌种；
2．炭角菌YM311647菌株的种子培养：从上述斜面菌种中取一菌种移植块，接种到PDB培养基中（PDB培养基：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、蒸馏水1000 mL、pH自然，121 ℃灭菌30分钟），在28℃、200 r/min摇床培养3天，得种子液；
3．炭角菌YM311647菌株的液体发酵培养：500 mL锥形瓶中装有200 mL PDB培养基，121℃灭菌30分钟，待冷却后，接入上述种子液，在28℃、200 r/min摇床培养7天，得发酵液。
4．将发酵液过滤，滤液减压浓缩后，用乙酸乙酯萃取，再将乙酸乙酯萃取液浓缩后，获得发酵粗提物，进行硅胶柱层析，以氯仿/甲醇溶剂系统从1：0到7：3梯度洗脱。收集含10-20%甲醇的氯仿/甲醇洗脱液，减压浓缩。将浓缩液再进行反复柱层析，经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以甲醇洗脱；再经RP-18反相硅胶柱层析，以甲醇/水溶剂系统从4：6到1：1梯度洗脱后得到化合物A、B和C。
实施例2：
采用微量二倍稀释法对本发明的异海松烷二萜化合物，即化合物A、B和C进行抗菌活性检测。
1．病原指示菌共五株：包括2株人体致病真菌：白色念珠菌 (Candida albicans)和紧密单孢枝霉 (Hormodendrum compactum)；3株植物病原真菌：黑曲霉（Aspergillus niger）、稻瘟霉（Pyricularia oryzae）和燕麦镰孢（Fusarium avenaceum）。
2．试验方法：
在长有指示菌的固体斜面培养基中加入1mL无菌水，震荡片刻制成指示菌悬液。将待测样品溶解于甲基亚砜，配制成浓度为512 μg/mL的样品溶液，把样品加到96孔细胞板中，采用微量二倍稀释法稀释样品至终浓度为1 μg/mL。然后再将菌悬液依次加入到各孔中，放入恒温箱中25℃培养48小时，肉眼观察，以没有菌生长的最小的样品浓度作为最小抑制浓度（MIC）。未加待测样品只含指示菌的为阴性对照；只含培养基的为空白对照；阳性对照用制霉菌素。
3．试验结果
表2 化合物A、B和C的抗菌活性 
 
Figure 2013102988158100002DEST_PATH_IMAGE004
结果表明，本发明的异海松烷二萜化合物A、B和C对5种病原指示菌均显示较明显的抗真菌活性，尤其是异海松烷二萜化合物A对白色念珠菌和稻瘟霉的最小抑制浓度值为最低（16μg/mL），具有作为制备新的农用或医用抗真菌药物的潜在用途。

Claims (2)

1.异海松烷二萜化合物，其特征在于所用的生产菌株为印楝内生炭角菌YM311647 (Xylaria sp. YM311647)，已于2012年9月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No: M 2012365，经常规发酵、提取分离获得三种结构类似的化合物，分别为异海松烷二萜化合物A，16-O-sulfo-19-oxo-6,19-epoxyisopimar-7-ene，异海松烷二萜化合物B，16-O-sulfo-18-norisopimar-7-en-4a-ol，异海松烷二萜化合物C，14a, 16-epoxy-18-norisopimar-7-en-4a-ol，结构式分别为：
Figure 75497DEST_PATH_IMAGE001
。
2. 如权利要求1所述的异海松烷二萜化合物在制备抗菌药物中的应用。
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