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Abstract

本发明涉及从一株拟盾壳霉菌YM311593（Paraconiothyrium sp.YM311593）的发酵产物中分离获得一种氧杂蒽酮类化合物及其应用，属微生物药物技术领域。本发明的生产菌株YM311593已于2013年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 2013142。本发明由菌株YM311593经常规发酵、提取分离获得一种氧杂蒽酮类化合物。活性试验证实该化合物具有明显的抗肿瘤细胞活性和抗植物病原真菌活性，具有作为制备新的抗肿瘤药物和农用抗菌剂的潜在用途。

Description

一种氧杂蒽酮类化合物及其应用
技术领域
本发明涉及一种从拟盾壳霉菌YM311593（Paraconiothyriumsp. YM311593）分离获得的具有抗肿瘤细胞活性和抗植物病原真菌活性的氧杂蒽酮类化合物及其应用，属微生物药物技术领域。
背景技术
植物内生真菌的次生代谢产物具有结构多样性和新颖性的特点，是发现生物活性物质的重要来源，在医药、农林业等领域具有潜在的应用前景。印楝 (Azadirachta indica)为楝科植物，广泛种植于热带、亚热带地区，由于其独有的生物特性，在世界各国引起了广泛的关注。我们从印楝植物中分离获得了一株拟盾壳霉菌YM311593（Paraconiothyrium sp. YM311593）。
拟盾壳霉属(Paraconiothyrium) 隶属于腔孢纲(Coelomycetes)、球壳孢目(Sphaeropsidales)、球壳孢科(Sphaeropsidaceae)，是2004年被描述的新属，目前有关该属真菌的次生代谢产物研究较少。国内外文献检索表明，至今还未从拟盾壳霉属中分离获得过氧杂蒽酮类化合物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从拟盾壳霉菌YM311593（Paraconiothyrium sp. YM311593）的发酵产物中获得的具有抗肿瘤细胞活性和抗植物病原真菌活性的氧杂蒽酮类化合物及其应用。
本发明的生产菌株为拟盾壳霉菌YM311593菌株。现在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，简称：CCTCC，保藏单位地址：中国，武汉大学，邮政编码：430072。保藏日期为2013年4月10日，保藏编号为CCTCC No: M 2013142。
本发明采用PDB培养基，将菌株YM311593用常规方法进行发酵培养，将发酵液减压浓缩后，用乙酸乙酯萃取，再将有机相萃取液浓缩后，获得发酵粗提物，通过硅胶（氯仿/甲醇洗脱）和RP-18反相硅胶（甲醇/水洗脱）柱层析，再经重结晶得到本发明的氧杂蒽酮类化合物，命名为1, 2-dihydro-1, 2-dihydroxyvertixanthone，结构式为：
本发明所述的氧杂蒽酮类化合物溶解于甲醇、吡啶、二甲亚砜，不溶于石油醚、氯仿、丙酮和水。
本发明所述的氧杂蒽酮类化合物为黄色针状结晶；分子式为C15H12O7；UV (MeOH) l max(log e) 208 (4.3), 268 (4.1), 342 (3.6) nm；IR (KBr) lmax3443, 1735, 1656, 1639, 1595, 1564, 1476, 1446, 1281, 1219, 1192, 1087, 1051, 982, 735 cm-1; HRESIMS m/z 327.0474 [M+Na]+ (calcd for C15H12O7Na, 327.0481)；1H 和13C NMR数据见表1。
表1 本发明的氧杂蒽酮类化合物的1H和13C NMR数据
Figure 28522DEST_PATH_IMAGE002
本发明所述的氧杂蒽酮类化合物的绝对构型是通过X-单晶衍射分析确定的。
本发明的氧杂蒽酮类化合物的X-单晶衍射数据：晶体呈黄色透明针状，晶体大小为0.32 x 0.17 x 0.09 mm ，属单斜晶系，空间群为P21, 晶胞参数：a = 7.4129(3) Å, b = 7.7700(3) Å, c = 10.9292(5) Å,α = 90.00°, β = 95.269(2)°, γ = 90.00°, 晶胞体积V=626.84(5) Å3，晶胞内不对称单位数Z= 2。用Bruker APEX II CCD 衍射仪收集衍射强度数据，温度T = 100(2) K，CuKa辐射，扫描方式：Ф/w扫描，收集总衍射点数为5154个，独立衍射点数为2072个，可观察点数(|F|2≥2s|F|2)为3340个。采用直接法(Shelxs97)解析晶体结构，使用最小二乘法修正结构参数和判别原子种类，使用几何计算法和差值Fourier法获得全部氢原子位置，最终可靠因子R1 = 0.0321 (I > 2σ(I))，wR(F 2) = 0.0836 (I > 2σ(I))，R1 = 0.0322 (all data)，wR(F 2) = 0.0837 (all data)，goodness of fit on F 2 = 1.062。结果表明:晶态下分子排列属第一类空间群，经计算与绝对构型相关的Flack系数为0.03(15)，表明分子的绝对构型可以确定。
本发明的氧杂蒽酮类化合物的X-晶体结构
本发明的氧杂蒽酮类化合物在抗肿瘤细胞检测和抗植物病原真菌活性检测中均显示较明显的抑制作用，具有作为制备新的抗肿瘤药物和农用抗菌剂的潜在用途。
具体实施方式：
实施例1：
本发明所述的氧杂蒽酮类化合物的分离制备：
1．拟盾壳霉菌Paraconiothyriumsp. YM311593菌株的斜面培养：马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸，纱布过滤，得马铃薯滤液，再加入葡萄糖和琼脂，用蒸馏水定容，灭菌，得斜面培养基；将斜面培养基制成试管斜面，挑取YM311593菌种接入斜面培养基培养，得斜面菌种；
2．拟盾壳霉菌YM311593菌株的种子培养：从上述斜面菌种中取一菌种移植块，接种到PDB培养基中（PDB培养基：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、蒸馏水1000 mL、pH自然，121 ℃灭菌30分钟），在28℃、200 r/min摇床培养3天，得种子液；
3．拟盾壳霉菌YM311593菌株的液体发酵培养：500 mL锥形瓶中装有200 mL PDB培养基，121℃灭菌30分钟，待冷却后，接入上述种子液，在28℃、200 r/min摇床培养7天，得发酵液。
4．将发酵液过滤，滤液减压浓缩后，用乙酸乙酯萃取，再将乙酸乙酯萃取液浓缩后，获得发酵粗提物，进行硅胶柱层析，以氯仿/甲醇溶剂系统从1：0到1：1梯度洗脱。收集含20-30%甲醇的氯仿/甲醇洗脱液，减压浓缩。将浓缩液再进行RP-18反相硅胶柱层析，以甲醇/水溶剂系统1：1梯度洗脱，再用氯仿/甲醇重结晶得到本发明的氧杂蒽酮类化合物。
实施例2：
采用MTT法对本发明的氧杂蒽酮类化合物进行抗肿瘤细胞活性检测。
1、试验方法：选用对数生长期的贴壁人肺腺癌细胞A549、人宫颈癌细胞Hela、人结肠癌细胞HCT-8、人肝癌细胞Bel7402四种肿瘤细胞，分别用胰酶消化后，用10%小牛血清的RPMI1640培养液配成15000个/ml的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种190 µl，37℃，5%CO2培养24h。实验组加浓度为100 µg/ml的发酵液提取物样品10 µl，每孔终体积为200 µl，用1640培养液补足。37℃，5%CO2培养3d。弃上清液，每孔加入100 µl新鲜配制的0.5mg/ml MTT的无血清培养液，37℃继续培养4h。小心弃上清，并加入200 µl DMSO溶解MTT formazon沉淀，用微型超声振荡器混匀，在酶标仪上测定波长544 nm处的光密度值，计算肿瘤细胞生长抑制率（%）=（OD对照-OD实验）/（OD对照-OD空白）X 100%。以样品浓度为横坐标，以抑制率为纵坐标，作图并求出抑制率为50%时样品的浓度（IC50），样品活性结果即以半数抑制浓度（IC50）表示。
2、 试验结果：
本发明的氧杂蒽酮类化合物对四种肿瘤细胞A549、Hela、HCT-8、Bel7402的半数抑制浓度分别为12.55 µg/ml、9.38 µg/ml、14.75 µg/ml、17.29 µg/ml，具有作为制备新的抗肿瘤药物的潜在用途。
实施例3：
采用微量二倍稀释法对本发明的氧杂蒽酮类化合物进行抗植物病原真菌的活性检测。
1．病原指示菌共四株：烟草赤星病菌（Alternaria alternata）、小麦赤霉菌（Gibberella saubinettii）、苹果炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、玉米弯孢霉（Curvularia lunata）。
2．试验方法：在长有指示菌的固体斜面培养基中加入1 ml无菌水，震荡片刻制成指示菌悬液。将待测样品溶解于二甲基亚砜，配制成浓度为512 µg/ml的样品溶液，把样品加到96孔细胞板中，采用微量二倍稀释法稀释样品至终浓度为1 µg/ml。然后再将菌悬液依次加入到各孔中，放入恒温箱中25℃培养48小时，肉眼观察，以没有菌生长的最小的样品浓度作为最小抑制浓度（MIC）。未加待测样品只含指示菌的为阴性对照；只含培养基的为空白对照；阳性对照用制霉菌素。
3．试验结果：
本发明的氧杂蒽酮类化合物对4种植物病原真菌均显示较明显的抑制生长活性，对烟草赤星病菌、玉米弯孢霉、小麦赤霉菌和苹果炭疽菌的最小抑制浓度分别为16 µg/ml、16 µg/ml、32 µg/ml、64 µg/ml，具有作为制备新的农用抗菌剂的潜在用途。

Claims (2)

1.一种氧杂蒽酮类化合物，其特征在于所用的生产菌株为拟盾壳霉菌YM311593（Paraconiothyriumsp. YM311593），已于2013年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No: M 2013142，由生产菌株经常规发酵、提取分离获得一种氧杂蒽酮类化合物，命名为1, 2-dihydro-1, 2-dihydroxyvertixanthone，其结构式为：
。
2.如权利要求1所述的氧杂蒽酮类化合物在制备抗肿瘤药物和农用抗菌剂中的应用。
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