CN107973769A - 一种苯并二氢吡喃酮类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种苯并二氢吡喃酮类化合物及其制备和应用，特点是该苯并二氢吡喃酮类化合物的结构式如Ⅰ所示，其制备方法步骤包括通过保藏号为CCTCC No. M2014086的海洋曲霉菌发酵培养来获取含新苯并二氢吡喃酮类化合物的发酵物，然后将发酵物用甲醇浸泡、乙酸乙酯提取，得粗浸膏，将该粗浸膏经减压硅胶柱层析和反相半制备高效液相色谱分离纯化得到，该苯并二氢吡喃酮类化合物具有抑制细胞活性，抗肿瘤作用，优点是化合物I与各种药物可接受的载体、赋形剂或辅料配伍，可制成抗肿瘤药物，用于肿瘤的治疗，化合物I还可作为抑制细胞增殖的低分子生物探针用于生命科学研究。

Description

一种苯并二氢吡喃酮类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种苯并二氢吡喃酮类化合物，尤其是涉及一种用海洋曲霉菌制备一种苯并二氢吡喃酮类化合物的方法以及该类化合物在肿瘤细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的应用。
背景技术
随着人口的老龄化趋势和环境污染的加重，恶性肿瘤日益成为严重危害人类生命健康的重大疾病，且发病率与死亡率均呈逐年上升的趋势。20世纪70年代以来，癌症发病率以年均3%-5%的速度递增，癌症己经成为人类最主要的死亡原因。海洋环境中的微生物为了适应生存，逐步形成了独特的结构和生理机能，能够产生多种抗肿瘤活性物质，是抗肿瘤药物重要的资源宝库。本发明人研究得知，海洋曲霉Aspergillus ustus（保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No: M2014086）的液体发酵的乙酸乙酯提取物有较好的肿瘤细胞增殖抑制活性，遂对其活性成分进行了研究，并从其中制备得到一种苯并二氢吡喃酮类化合物。目前尚未见该化合物的化学结构及肿瘤细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有抑制肿瘤细胞增殖以及抗肿瘤活性的苯并二氢吡喃酮类化合物及其制备方法和应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种苯并二氢吡喃酮类化合物，该苯并二氢吡喃酮类化合物的结构式如Ⅰ所示：
（I）。
上述苯并二氢吡喃酮类化合物的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）发酵生产
将保藏号为CCTCC No: M2014086的焦曲霉Aspergillus ustus，划线复活，转接到PDB培养基中，于28℃、180 r/min培养5天，获得种子培养液，然后按体积百分数10%的接种量将种子液接种到大米培养基中，于28℃静置培养35天，获得发酵物；
（2）浸膏的获得
将上述发酵物用甲醇浸泡3次，而后对甲醇浸提液浓缩蒸干，用水复溶，再用与水等体积的乙酸乙酯重复萃取3次，合并三次萃取所得萃取液，将萃取液减压浓缩除去乙酸乙酯，获得粗浸膏；
（3）化合物的分离精制
将上述粗浸膏用二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，采用石油醚/乙酸乙酯以体积比8:1梯度为洗脱剂进行洗脱，对粗浸膏进行减压硅胶柱层析，收集洗脱组分，再经过半制备反相高效液相色谱进行分离纯化得到苯并二氢吡喃酮类化合物，其结构如式I所示：
（I）。
所述的大米培养基的配制方法如下：将80 g大米溶于120 mL海水中，于121℃高压灭菌20min即可。
所述的二氯甲烷和甲醇混合溶剂中二氯甲烷与甲醇的体积比为1：1。
所述的半制备反相高效液相色谱的洗脱液为甲醇与水按体积比1:1的比例混合。
上述苯并二氢吡喃酮类化合物的应用，所述的苯并二氢吡喃酮类化合物在制备肿瘤细胞增殖抑制剂或抗肿瘤药物方面的用途。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种苯并二氢吡喃酮类化合物及其制备方法和应用，通过微生物发酵培养来获取含新苯并二氢吡喃酮类化合物的发酵物，然后将发酵物用甲醇浸泡、乙酸乙酯提取，得粗浸膏，将该粗浸膏经减压硅胶柱层析和反相半制备高效液相色谱分离纯化得到，该苯并二氢吡喃酮类化合物具有抑制细胞活性，抗肿瘤作用。化合物I与各种药物可接受的载体、赋形剂或辅料配伍，可制成抗肿瘤药物，用于肿瘤的治疗。化合物I还可作为抑制细胞增殖的低分子生物探针用于生命科学研究，作为探针应用时，化合物I可溶于甲醇、水或含水甲醇中，也可溶于二甲基亚砜的含水溶液中加以应用。
上述焦曲霉（Aspergillus ustus），该菌为DJ003菌株，保藏编号为CCTCC No.M2014086，于2014年03月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
一种苯并二氢吡喃酮类化合物结构式如Ⅰ所示：
（I）。
实施例2
如I式所示的苯并二氢吡喃酮类化合物的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）发酵生产
将保藏号为CCTCC No: M2014086的焦曲霉Aspergillus ustus，划线复活，转接到装有100 mL PDB培养基的250mL锥形瓶中，于28℃、180 r/min培养5天，获得种子培养液，之后按照体积百分数10%的接种量将种子液接种到装有大米培养基(将80g大米溶于120 mL海水，于121℃高压灭菌20min即可)的1000mL锥形瓶中，28℃静置培养35天，获得发酵物；
（2）浸膏的获得
将上述发酵物用4L甲醇浸泡3次，而后对甲醇浸提液浓缩蒸干，用1L的水复溶，再用1L乙酸乙酯重复萃取3次，合并三次萃取所得萃取液，将萃取液减压浓缩除去乙酸乙酯，获得17克粗浸膏；
（3）化合物的分离精制
将上述粗浸膏用二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，采用石油醚/乙酸乙酯以体积比8:1梯度为洗脱剂进行洗脱，对粗浸膏进行减压硅胶柱层析，收集洗脱组分，再经过半制备反相高效液相色谱进行分离纯化得到苯并二氢吡喃酮类化合物，其结构如式I所示：
（I）。
该化合物Ⅰ，线黄色粉末，分子式C14H16O6，阳离子HRESIMS m/z：281.1029 [M + H]+，1H和13C-NMR数据见表1。
表1化合物Ⅰ的1H和13C NMR数据（600和150MHz，in CDCl3）
实施例3
体外抗肿瘤活性的测试（细胞增殖抑制活性测试）
（1）实验样品
被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例1中分离纯化的化合物Ⅰ纯品，精密称取适量样品，用甲醇配制成所需浓度的溶液，供测活性。
细胞系及细胞的继代培养采用人宫颈癌HeLa细胞以及人肝癌HepG2细胞，均用10%BCS（生化细胞生长激素）的1640培养基，在37℃于通入0.5%二氧化碳的培养箱中继代培养。
（2）实验方法
细胞增殖抑制活性测试方法：四甲基偶氮唑盐（MTT）法取对数生长期的人宫颈癌HeLa细胞以及人肝癌HepG2细胞，将细胞用胰酶消化后，调节密度为2～3×104个/孔，添加于96孔板中，每孔195微升，置于37℃、0.5％CO2培养箱中培养24小时，然后加入不同浓度样品溶液到96孔板中，在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔，以甲醇作为阴性对，37℃、0.5％CO2培养箱中培养48小时；取出96孔板，每孔加入20微升MTT(四甲基偶氮唑盐)（浓度5mg/ml），继续培养4小时；弃培养液，每孔加入150微升 DMSO(二甲基亚砜)，37℃振荡6 min，492 nm处测定各孔的光吸收，取三孔平均OD值按IR（%）＝（OD阴性对照－OD样品）/OD阴性对照×100％式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率（IR%）。
（3）实验结果
在MTT法测试中，不同浓度的化合物Ⅰ对人宫颈癌HeLa细胞以及人肝癌HepG2细胞的增殖抑制结果分别见表2。
表2不同浓度的化合物Ⅰ对癌细胞增殖的抑制率（%）
由上表可知化合物Ⅰ具有明显的肿瘤细胞增殖抑制作用，可作为细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂用于抗肿瘤的研究。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种苯并二氢吡喃酮类化合物，其特征在于：该苯并二氢吡喃酮类化合物的结构式如Ⅰ所示：
（I）。
2.一种根据权利要求1所述的苯并二氢吡喃酮类化合物的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤：
（1）发酵生产
将保藏号为CCTCC No：M2014086的焦曲霉Aspergillus ustus划线复活，转接到PDB培养基中，于28℃、180 r/min培养5天，获得种子培养液；然后按体积百分数10%的接种量将种子液接种到大米培养基中，于28℃静置培养35天，获得发酵物；
（2）浸膏的获得
将上述发酵物用甲醇浸泡3次，而后对甲醇浸提液浓缩蒸干，用水复溶，再用与水等体积的乙酸乙酯重复萃取3次，合并三次萃取所得萃取液，将萃取液减压浓缩除去乙酸乙酯，获得粗浸膏；
（3）化合物的分离精制
将上述粗浸膏用二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，采用石油醚/乙酸乙酯以体积比8:1梯度为洗脱剂进行洗脱，对粗浸膏进行减压硅胶柱层析，收集洗脱组分，再经过半制备反相高效液相色谱进行分离纯化得到苯并二氢吡喃酮类化合物，其结构如式I所示：
（I）。
3.根据权利要求2所述的一种苯并二氢吡喃酮类化合物的制备方法，其特征在于步骤（1）所述的大米培养基的配制方法如下：将80 g大米溶于120 mL海水中，于121℃高压灭菌20min即可。
4.根据权利要求2所述的一种苯并二氢吡喃酮类化合物的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述的二氯甲烷和甲醇混合溶剂中二氯甲烷与甲醇的体积比为1：1。
5.根据权利要求2所述的一种苯并二氢吡喃酮类化合物的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述的半制备反相高效液相色谱的洗脱液为甲醇与水按体积比1:1的比例混合。
6.一种根据权利要求1-5中任一项所述的苯并二氢吡喃酮类化合物的应用，其特征在于：所述的苯并二氢吡喃酮类化合物在制备肿瘤细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的应用。
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