CN104031051B - 二酮哌嗪类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

二酮哌嗪类化合物及其制备方法和用途 Download PDF

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    • C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system

Abstract

本发明公开了二酮哌嗪类化合物及其制备方法和用途，其结构特点是有两个苯丙氨酸缩合而成，并有苯环部分双键的水解和乙酰化，具体结构如化合物1和2所示，其制备步骤如下：1）将球孢枝孢菌保藏号CCTCC？NO：M？2014098划线接种到2216-E固体培养基上，于28℃培养箱中培养活化1天后接种到2216-E液体培养基中在温度为28℃，摇床转速为150r/min的条件下发酵8天获取发酵液；2）将发酵液用离心机离心去除菌体，用活化的大孔树脂吸附过滤发酵上清液后用乙醇洗脱后，蒸干洗脱液获取粗浸膏；3）将粗浸膏经HSCCC分离纯化得到化合物1和2，优点是具有细胞增殖抑制以及直接杀伤癌细胞等抗肿瘤活性。

Description

二酮哌嗪类化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种二酮哌嗪类化合物，尤其是涉及一种用球孢枝孢菌制备二酮哌嗪类化合物的方法以及该类化合物在制备细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。
背景技术
二酮哌嗪类化合物(Diketopiperazines，DKPs)的基本结构是由2个氨基酸缩合而成的环二肽(DKP)，因其骨架具有稳定的六元环结构，且有2个氢键给体和2个氢键受体，使得DKPs在药物化学中成为一个重要的药效团，且它们的研究也为多肽化学方向研究奠定了基础。目前已经发现许多有活性的DKP。如AmbewelamideA、AmbewelamideB、phenylahistin和verticillinA具有抗肿瘤活性(参见文献如ChuM，TruumeesI，RothofskyML，PatelMG，GentileF，DasPR，PuarMS，LinSL(1995)Inhibitionofc-fosproto-oncogeneinductionbySch52900andSch52901，noveldiketopiperazinesproducedbyGliocladiumsp.JAntibiot(Tokyo)48：1440-1445；如KanohK，KohnoS，KatadaJ，HayashiY，MuramatsuM，UnoI(1999a)Antitumoractivityofphenylahistininvitroandinvivo.BiosciBiotechnolBiochem63：1130-1133；KanohK，KohnoS，KatadaJ，TakahashiJ，UnoI(1999b)(-)-等；)Gliotoxin和sirodesminPL具有抗菌、抗病毒和免疫抑制活性(参见文献如SuttonP，NewcombeNR，WaringP，MüllbacherA(1994)Invivoimmunosuppressiveactivityofgliotoxin，ametaboliteproducedbyhumanpathogenicfungi.InfectImmun62：1192-1198；如SuttonP，WaringP，MüllbacherA(1996)Exacerbationofinvasiveaspergillosisbytheimmunosuppressivefungalmetabolite，gliotoxin.ImmunolCellBiol74：318-322；WaringP，BeaverJ(1996)Gliotoxinandrelatedepipolythiodioxopiperazines.GenPharmacol27：1311-1316)等。
该类化合物是一类较常见的真菌代谢产物，其结构特点是都是有两个氨基酸酰胺化环合衍生而得。本发明人研究发现球孢枝孢菌Cladosporiumsphaerospermum液体发酵产物经超声破碎后的粗提物有很好的细胞坏死活性，遂对其活性成分进行了研究，结果发现了三个含硫二酮哌嗪类化合物具有抗肿瘤活性，目前尚未见对该化合物的化学结构及细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种结构独特的具有细胞增殖抑制以及直接杀伤癌细胞等抗肿瘤活性的二酮哌嗪类化合物及其制备方法和用途。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种二酮哌嗪类化合物，其结构有两个苯丙氨酸缩合而成，并有苯环部分双键的水解和乙酰化，具体结构如化合物1和2所示，
(1)化合物1
(2)化合物2
一种二酮哌嗪类化合物的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)发酵生产
将球孢枝孢菌(Cladosporiumsphaerospermum，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是：CCTCCNO：M2014098)划线接种到含有2216-E固体培养基的平板上，于28℃培养箱中培养活化1天后，将活化的单克隆菌落接种到装有2216-E液体培养基的装液量为40％的三角锥形瓶中发酵培养，在温度为28℃，摇床转速为150r/min的条件下发酵8天，获取发酵液；
(2)浸膏的获得
将发酵液用离心机离心去除菌体，获取发酵上清液，然后用活化的大孔树脂吸附过滤发酵上清液，接着用80％乙醇对其洗脱，最后用旋转蒸发仪蒸干洗脱液，获取粗浸膏；
(3)化合物的分离精制
a.将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和纯水按体积比1∶1∶1∶1的比例混合后作为高速逆流色谱仪(HSCCC)的第一两相体系，将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和纯水按体积比2∶1∶2∶1的比例混合后作为高速逆流色谱仪(HSCCC)的第二两相体系；
b.取300毫克粗浸膏溶于6毫升第一两相体系中，离心获取上清液，然后在HSCCC梯度洗脱模式下先在第一两相体系的下相的洗脱下获取化合物1(14.3毫克)，接着在第二两相体系的下相的洗脱下获取化合物2(25.4毫克)，化合物结构如下所示，(1)化合物1
(2)化合物2
所述的2216-E固体培养基的配制方法如下：将蛋白胨0.5g，酵母膏0.1g，硫酸铁0.01g，固体琼脂2g，溶于100ml海水中，调pH值至7.2。
所述的2216-E液体培养基的配制方法如下：将蛋白胨5g，酵母膏1g，硫酸铁0.1g，溶于1000ml海水中，调pH值至7.2。
上述二酮哌嗪类化合物1、2在制备抗肿瘤药物中的用途。
所述的抗肿瘤药物是指所述的酮哌嗪类化合物1、2在制备抑制肿瘤细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂中的用途。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开了二酮哌嗪类化合物及其制备方法和用途，本发明首次从球孢枝孢菌发酵液中发现了结构新颖的新含硫二酮哌嗪类化合物，其结构特征是有两个苯丙氨酸缩合而成，并有苯环部分双键的水解和乙酰化，其制备过程是发酵培养球孢枝孢菌，获取含有上述化合物的发酵液，然后从发酵物中分离纯化出化合物1、2。本发明的化合物1和2可用作细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂。化合物1和2与各种药物可接受的载体、赋形剂或辅料配伍，可制成抗肿瘤药物，用于肿瘤的治疗。化合物1和2还可作为抑制细胞增殖的低分子生物探针用于生命科学研究，作为探针应用时，化合物化合物1和2可溶于甲醇、水或含水甲醇中，也可溶于二甲基亚砜的含水溶液中加以应用。
上述球孢枝孢菌(Cladosporiumsphaerospermum)，该菌为YS3-15菌株，保藏编号为CCTCCNO：M2014098，于2014年03月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
一种二酮哌嗪类化合物，其结构特征是：有两个苯丙氨酸缩合而成，并有苯环部分双键的水解和乙酰化，具体结构如化合物1和2所示(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的坐标)，
(1)化合物1
(2)化合物2
实施例2
二酮哌嗪类化合物1和2的发酵生产及分离精制
(1)发酵生产
将球孢枝孢菌(Cladosporiumsphaerospermum，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是：CCTCCNO：M2014098)划线接种到含有2216-E固体培养基的平板上，于28℃培养箱中培养活化1天后，将活化的单克隆菌落接种到装有400ml的2216-E液体培养基的1000ml三角锥形瓶中发酵培养，在温度为28℃，摇床转速为150r/min的条件下发酵8天，获取发酵液；其中2216-E固体培养基的配制方法如下：将蛋白胨0.5g，酵母膏0.1g，硫酸铁0.01g，固体琼脂2g，溶于100ml海水中，调pH值至7.2；
2216-E液体培养基的配制方法如下：将蛋白胨5g，酵母膏1g，硫酸铁0.1g，溶于1000ml海水中，调pH值至7.2；
(2)浸膏的获得
将发酵液用离心机离心去除菌体，获取发酵上清液，然后用活化的大孔树脂吸附过滤发酵上清液，接着用80％乙醇对其洗脱，最后用旋转蒸发仪蒸干洗脱液，获取粗浸膏；(45L发酵液可获得1.8g粗浸膏)；
(3)化合物的分离精制
A.将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和纯水按体积比1∶1∶1∶1的比例混合后作为高速逆流色谱仪(HSCCC)的第一两相体系，将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和纯水按体积比2∶1∶2∶1的比例混合后作为高速逆流色谱仪(HSCCC)的第二两相体系；
B.取300毫克粗浸膏溶于6毫升第一两相体系中，离心获取上清液，然后在HSCCC梯度洗脱模式下先在第一两相体系的下相的洗脱下获取化合物1(14.3毫克)，接着在第二两相体系的下相的洗脱下获取化合物2(25.4毫克)。
化合物1白色粉末，分子式C22H24O5N2S2，ESI-MS(m/z)：483.06[M+Na]+。1H及13CNMR数据见表1，化学结构式如上述实施例1所示。
化合物2白色粉末，分子式C22H22O4N2S2，HR-ESI-MS(m/z)：465.0910[M+Na]+，计算值465.0919；Δ-1.9ppm)。1H及13CNMR数据见表2，化学结构式如上述实施例1所示。
表1化合物1的1H和13C频谱数据(CD3OD)
表2表1化合物2的1H和13C频谱数据(CDCl3)
需要特别说明的是，经发酵微生物制取本发明物化合物1和2的方法可采用其他任何能生产该类化合物的微生物，只要能生产该类化合物的微生物均可作为生产菌用于制备化合物1和2。
上述球孢枝孢菌(Cladosporiumsphaerospermum)，该菌为YS3-15菌株，保藏编号为CCTCCNO：M2014098，于2014年03月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
实施例3
体外抗肿瘤活性的测试(细胞增殖抑制活性测试)
(1)实验样品
被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例2中分离纯化的化合物1和2纯品，精密称取适量样品，用甲醇配制成所需浓度的溶液，供测活性。
细胞系及细胞的继代培养采用人宫颈癌Hela细胞和人肝癌HepG2细胞，均用10％BCS(生化细胞生长激素)的1640培养基，在37℃于通入0.5％二氧化碳的培养箱中继代培养。
(2)实验方法
细胞增殖抑制活性测试方法：四氮唑盐(MTT)法取对数生长期的人宫颈癌Hela细胞以及人肝癌HepG2细胞，将细胞用胰酶消化后，调节密度为2～3×104个/孔，添加于96孔板中，每孔195微升，置于37℃、0.5％CO2培养箱中培养24小时，然后加入不同浓度样品溶液到96孔板中，在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔，以甲醇作为阴性对，37℃、0.5％CO2培养箱中培养48小时；取出96孔板，每孔加入20微升MTT(四甲基偶氮唑盐)(浓度5mg/ml)，继续培养4小时；弃培养液，每孔加入150微升DMSO(二甲基亚砜)，37℃振荡6min，492nm处测定各孔的光吸收，取三孔平均OD值按IR(％)＝(OD阴性对照-OD样品)/OD阴性对照×100％式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR％)。
(3)实验结果
在MTT法测试中，不同浓度的化合物1和2对人宫颈癌Hela细胞以及人肝癌HepG2细胞的增殖抑制结果分别见表3和表4。
表3不同浓度的化合物1对癌细胞增殖的抑制率(％)
表4不同浓度的化合物2对癌细胞增殖的抑制率(％)
由上表可知化合物1和2均具有明显的肿瘤细胞增殖抑制作用，可作为细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂用于抗肿瘤的研究。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种二酮哌嗪类化合物的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤：
(1)发酵生产
将保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2014098的球孢枝孢菌(Cladosporiumsphaerospermum)划线接种到含有2216-E固体培养基的平板上，于28℃培养箱中培养活化1天后，将活化的单克隆菌落接种到装有2216-E液体培养基的装液量为40％的三角锥形瓶中发酵培养，在温度为28℃，摇床转速为150r/min的条件下发酵8天，获取发酵液；
(2)浸膏的获得
将发酵液用离心机离心去除菌体，获取发酵上清液，然后用活化的大孔树脂吸附过滤发酵上清液，接着用80％乙醇对其洗脱，最后用旋转蒸发仪蒸干洗脱液，获取粗浸膏；
(3)化合物的分离精制
a.将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和纯水按体积比1:1:1:1的比例混合后作为高速逆流色谱仪的第一两相体系，将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和纯水按体积比2：1：2：1的比例混合后作为高速逆流色谱仪的第二两相体系；
b.取300毫克粗浸膏溶于6毫升第一两相体系中，离心获取上清液，然后在高速逆流色谱仪梯度洗脱模式下先在第一两相体系的下相的洗脱下获取化合物1为14.3毫克，接着在第二两相体系的下相的洗脱下获取化合物2为25.4毫克，化合物结构如下所示，(1)化合物1
(2)化合物2
2.根据权利要求1所述的一种二酮哌嗪类化合物的制备方法，其特征在于：所述的2216-E固体培养基的配制方法如下：将蛋白胨0.5g，酵母膏0.1g，硫酸铁0.01g，固体琼脂2g，溶于100ml海水中，调pH值至7.2。
3.根据权利要求1所述的一种二酮哌嗪类化合物的制备方法，其特征在于：所述的2216-E液体培养基的配制方法如下：将蛋白胨5g，酵母膏1g，硫酸铁0.1g，溶于1000ml海水中，调pH值至7.2。
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