CN102020649A - 二酮哌嗪类化合物、其组合物、其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药化工领域，涉及二酮哌嗪类化合物、其组合物、其制备方法和用途。具体地，本发明涉及式I化合物或其药学上可接受的盐，其中，R₁和R₂各自独立地代表氢、羟基、C_1-10直链或支链烷氧基、C_2-10直链或支链烯基氧基、C_2-10直链或支链炔基氧基、C_6-10直链或支链芳基氧基、或C_2-18的饱和或不饱和脂肪酰氧基。本发明还涉及用于制备该化合物的产紫青霉。经实验证实，该类化合物可用于制备细胞凋亡诱导剂、骨架蛋白抑制剂和抗肿瘤剂。本发明的化合物具有良好的抗肿瘤活性。

Description

二酮哌嗪类化合物、其组合物、其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药化工领域，涉及二酮哌嗪类化合物、其组合物、其制备方法和用途。

背景技术

肿瘤(Tumor)是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。一般将肿瘤分为良性和恶性两大类。所有的恶性肿瘤总称为癌症(cancer)。

二酮哌嗪类化合物是分子结构中含二酮哌嗪环状骨架的化合物，目前已知有些二酮哌嗪类化合物具有抗肿瘤活性。

其中，tryprostatin A和B、fumitremorgin类衍生物及其类似物、spirotryprostatin类、cyclotryprostatin类等具有一定的抗肿瘤活性，例如：对小鼠乳腺癌tsFT210细胞的细胞周期G2/M期阻断作用，或对人白血病MOLT-4细胞和HL-60细胞、人肺癌A549细胞、人肝癌BEL-7402细胞的杀伤性细胞毒，或对微管蛋白的抑制作用等(C.-B.Cui，et al，Novel mammalian cell cycleinhibitors，tryprostatins A，B and other diketopiperazines produced by Aspergillus fumigatus.I.Taxonomy，fermentation，isolation and biological properties，J.Antibiot.，1996，49(6)，527-533；C.-B.Cui，et al，Novel mammalian cell cycle inhibitors，spirotryprostatins A and Bproduced by Aspergillus fumigatus，which inhibit mammalian cell cycle at G2/M phase，Tetrahedron，1996，52(39)，12651-12666；F.Wang，et al，Seven new prenylated indole diketopiperazine alkaloids from holothurian-derived fungus Aspergillus fumigatus，Tetrahedron，2008，64(34)，7986-7991；C.-B.Cui，et al，Novel mammalian cell cycle inhibitors，cyclotryprostatins A-D produced by Aspergillus fumigatus，which inhibit mammalian cell cycleat G2/M phase，Tetrahedron，1997，53(1)，59-72)。

有些硫代二酮哌嗪类化合物也有抗肿瘤活性，如对小鼠乳腺癌tsFT210细胞的细胞凋亡诱导、细胞周期G0/G1期阻断和杀伤性细胞毒等作用以及对小鼠白血病P388细胞和人肺癌细胞A549的增殖抑制作用(韩小贤，许晓妍，崔承彬，顾谦群，海洋真菌烟曲霉H1-04的硫代二酮哌嗪类产物及其抗肿瘤活性，中国药物化学杂志，2007，17(3)，155-159&165)。

Fructigenine类及其衍生物也是一类二酮哌嗪类化合物，但是对小鼠乳腺癌tsFT210细胞则没有显示出抗肿瘤活性(辛志宏，方玉春，朱天骄，段琳，顾谦群，朱伟明，海绵来源真菌黄灰青霉Sp-19中的抗肿瘤活性成分研究，中国海洋药物杂志，2006，25(6)，1-6)。并且在已有记载的所有fructigenine A类化合物中，尚未见到在其二酮哌嗪的环骨架碳3或11a位上连有氧取代基的化合物的报道。

发明内容

本发明人通过创造性的劳动和不懈的努力，发现了下述式I所示的一类新的二酮哌嗪类化合物：

式I

其中，

阿拉伯数字表示相应标位，其结构特征在于，R₁和/或R₂为氧取代基。

具体地，R₁和R₂各自独立地代表氢、羟基、C_1-10直链或支链烷氧基、C_2-10直链或支链烯基氧基、C_2-10直链或支链炔基氧基、C_6-10直链或支链芳基氧基、或C_2-18的饱和或不饱和脂肪酰氧基。

并且本发明人还惊奇地发现，上述的式I化合物具有抗肿瘤活性。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及式I化合物，或其药学上可接受的盐，

式I

其中，

R₁和R₂各自独立地代表氢、羟基、C_1-10直链或支链烷氧基、C_2-10直链或支链烯基氧基、C_2-10直链或支链炔基氧基、C_6-10直链或支链芳基氧基、或C_2-18的饱和或不饱和脂肪酰氧基。

具体地，所述C_1-10直链或支链烷氧基为甲氧基、乙氧基、C₃直链或支链烷氧基、C₄直链或支链烷氧基、C₅直链或支链烷氧基、C₆直链或支链烷氧基、C₇直链或支链烷氧基、C₈直链或支链烷氧基、C₉直链或支链烷氧基、或C₁₀直链或支链烷氧基。

具体地，所述C_2-10直链或支链烯基氧基为乙烯氧基、C₃直链或支链烯基氧基、C₄直链或支链烯基氧基、C₅直链或支链烯基氧基、C₆直链或支链烯基氧基、C₇直链或支链烯基氧基、C₈直链或支链烯基氧基、C₉直链或支链烯基氧基、或C₁₀直链或支链烯基氧基。

具体地，所述C_2-10直链或支链炔基氧基为乙炔氧基、C₃炔基氧基、C₄直链或支链炔基氧基、C₅直链或支链炔基氧基、C₆直链或支链炔基氧基、C₇直链或支链炔基氧基、C₈直链或支链炔基氧基、C₉直链或支链炔基氧基、或C₁₀直链或支链炔基氧基。

具体地，所述C_6-10芳基氧基为苯氧基、苄氧基、C₈直链或支链芳基氧基、C₉直链或支链芳基氧基、或C₁₀直链或支链芳基氧基。

在本发明的一个实施方案中，所述的式I化合物，或其药学上可接受的盐，其中，

R₁和R₂各自独立地代表氢、羟基、甲氧基、乙氧基、乙酰氧基、琥珀酰氧基、或亚油酰氧基。具体地，R₁和R₂各自独立地代表氢、羟基。

在本发明的一个实施方案中，所述的式I化合物，或其药学上可接受的盐，其中，

R₁代表β-H，R₂代表α-OH、α-OCH₃、或α-OCOCH₃；或者

R₁代表α-OH、α-OCH₃、或α-OCOCH₃，R₂代表β-H。

在本发明的一个实施方案中，所述的式I化合物，或其药学上可接受的盐，其中，

R₁代表β-H，R₂代表α-OH；或者

R₁代表α-OH，R₂代表β-H。

本发明的另一方面涉及产紫青霉(Penicillium purpurogenum)G591DS600S，其保藏编号为CGMCC No.4283，保藏日期为2010年11月1日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

该菌株是从天津塘沽驴驹河渤海湾潮间带海泥样品中分离并经分类学研究鉴定为产紫青霉(Penicillium purpurogenum)的青霉菌属的产紫青霉野生菌株G59的突变株G591DS600S。其具有如下微生物菌学特征：

菌落在查氏培养基上25℃培养12天直径达17-30mm，平坦、近于平坦或有几道同心环纹；质地绒状或兼絮状；分生孢子面暗灰绿色或暗绿色，近于橄榄柠檬色、褐橄榄色、或微暗橄榄绿色；菌丝体橘黄色、黄色或橙红色；反面暗红色、橘红色或紫红色；分生孢子梗发生于基质，发生气生菌丝者少，孢梗茎(70-)100-250(-300)×2.5-3.2(-3.5)μm，壁平滑，顶端通常膨大；帚状枝双轮生，偶有三轮生或单轮生，彼此紧贴而近于平行；梗基每轮4-8个，9.0-13(-14)×2.5-3.0μm；瓶梗每轮4-6个，9.5-13×(1.8-)2.0-2.4μm，披针形，梗茎明显；分生孢子呈椭圆形，充分成熟时部分呈近球形，2.8-3.5(-4.0)×2.2-3.0μm，壁平滑或稍粗糙；分生孢子链较疏松，叉开或近于圆柱形。

本发明的还一方面涉及本发明的式I化合物的制备方法，包括如下步骤：

将上述的产紫青霉进行发酵培养，获得含有式I化合物的发酵物，将发酵物进行分离纯化，得到式I化合物。

所述分离纯化包括利用本领域技术人员熟知的天然产物分离纯化的常规方法，如液液萃取、柱层析、薄层层析、高效液相层析及重结晶等。

也可以使用青霉菌属的其它能够产生式I化合物的生产菌进行发酵培养。

在本发明的一个实施方案中，所述的制备方法，包括如下步骤：

1)将上述的产紫青霉进行发酵培养，获得发酵液；

2)将发酵液过滤，得到滤液和菌丝体；

3)将滤液用乙酸乙酯萃取得到滤液的乙酸乙酯萃取物；将菌丝体用丙酮水溶液浸提后过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，得到菌丝体的乙酸乙酯萃取物；将该两部分萃取物合并后减压浓缩至干，得到乙酸乙酯总浸膏；

4)将乙酸乙酯总浸膏用体积比为9∶1的二氯甲烷-甲醇的混合溶剂溶解，用100-200目硅胶柱分离，用二氯甲烷-甲醇溶剂系统进行减压梯度洗脱，得到含有所述化合物的洗脱组分，再将该洗脱组分用Sephadex LH-20柱经用95％乙醇进行洗脱分离，得到含有所述化合物的柱层析组分；

5)将柱层析组分进一步进行Sephadex LH-20柱分离和硅胶制备薄层层析分离，得到含有所述化合物的层析组分；

6)将层析组分进行HPLC分离，得到所述化合物。

本发明的还一方面涉及上述的产紫青霉在制备本发明的式I化合物中的用途。

本发明的还一方面涉及一种组合物，其含有本发明的式I化合物或其药学上可接受的盐，可选地，还含有一种或多种药用载体或赋形剂。具体地，所述组合物为药物组合物。

本发明的还一方面涉及本发明的式I化合物或其药学上可接受的盐在制备细胞骨架蛋白抑制剂、细胞凋亡诱导剂、或肿瘤细胞增殖抑制剂中的用途。

本发明的还一方面涉及本发明的式I化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的用途，具体地，所述肿瘤为白血病、乳腺癌、肺癌、肝癌、或肠癌等等。

本发明采用MTT法，测试了式I化合物对人白血病K562细胞增殖的抑制作用。经实验证实，式I化合物可显著抑制K562细胞的体外增殖，因而具有抗肿瘤作用。

本发明中的术语“药学上可接受的盐”可以是药用无机或有机盐。本发明式I中具有碱性基团的化合物可以与无机酸形成药用盐，例如硫酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐；也可与有机酸形成药用盐，例如乙酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、葡萄糖酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、马来酸盐等。本发明式I中具有酸性基团的化合物可以与碱金属或碱土金属形成药用盐，优选但不限于钠盐、钾盐、镁盐或钙盐。

本发明的式I化合物可与各种药物上可接受的载体、赋形剂或辅料配伍制成抗肿瘤药物，用于肿瘤的治疗。

本发明化合物可单独或以药物组合物的形式给药。给药途径可以是口服、非肠道或局部给药。药物组合物可根据给药途径配成各种适宜的剂型。

本发明化合物的药物组合物可以以下面的任意方式施用：口服，喷雾吸入，直肠用药，鼻腔用药，颊部用药，局部用药，非肠道用药，如皮下，静脉，肌内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中优选口服、腹膜内或静脉内给药方式。

当口服用药时，本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊制剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。

当皮肤局部施用时，本发明化合物可制成适当的软膏、洗剂或霜剂制剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。软膏制剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、吐温60、十六烷酯蜡、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。

本发明化合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮液或无菌注射溶液。其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。

另外需要指出，本发明化合物使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。优选的使用剂量介于0.01～100mg/kg体重/天。

发明的有益效果

本发明的化合物具有良好的抗肿瘤活性。

涉及保藏的生物材料

产紫青霉G591DS600S已于2010年11月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；保藏编号为CGMCC No.4283；分类命名为Penicillium purpurogenum。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

在下面的实施例中，称为化合物I的本发明化合物经核磁共振等鉴定具有如下结构：式I化合物，其中R₁为β-H，R₂为α-OH；以下称为化合物II的本发明化合物经核磁共振等鉴定具有如下结构：式I化合物，其中R₁为α-OH，R₂为β-H。

在下面实施例的结构研究中，熔点用北京天地宇科技有限责任公司X-4型精密显微熔点测定仪测定，温度未校正。比旋光度用英国OA公司PolAAr 3005型旋光仪测定。正负离子ESI-MS和HR-ESI-MS分别用美国AB公司API 3000型液相色谱-质谱联用仪和英国Micromass公司LCT型质谱仪测定，紫外光谱用澳大利亚GBC公司Cintra 20型紫外可见分光光度仪测定，红外光谱用美国Nicolet公司NICOLET6700型红外光谱仪测定，核磁共振谱用日本JEOL公司JNM-ECA-400型超导核磁共振仪(400MHz¹H-NMR，100MHz ¹³C-NMR)测定。

实施例1：微生物发酵培养与化合物I和化合物II的制备

1.发酵培养与发酵物的提取处理

1)生产菌株

本实施例中用于发酵生产化合物I和II的产素菌是保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的产紫青霉(Penicillium purpurogenum)G591DS600S株，保藏编号为4283(CGMCC No.4283)。

2)发酵培养

按微生物培养的常规方法，从4℃冰箱保存的真菌PDA固体培养基(组成：葡萄糖2％、琼脂2％、NaCl 1.5％，用20％土豆的水煮液配制)试管斜面，用接种环刮取适量产紫青霉(Penicillium purpurogenum)G591DS600S，划线接种于新配制的PDA固体培养基上，28℃培养箱中活化培养3天。从活化培养3天的试管斜面，用接种环刮取孢子适量，分别接种于装有200ml液体发酵培养基(组成：葡萄糖2％、麦芽糖1％、甘露醇2％、谷氨酸1％、蛋白胨0.5％、酵母浸粉0.3％，用20％土豆的水煮液配制，pH 6.0)的10个500ml三角烧瓶中，28℃、200rpm摇床进行种子培养48h，得种子培养液。将该种子培养液按5％接种量，接种到150个分别装有200ml液体发酵培养基(组成：葡萄糖2％、麦芽糖1％、甘露醇2％、谷氨酸1％、蛋白胨0.5％、酵母浸粉0.3％，用20％土豆的水煮液配制，pH 6.0)的500ml三角烧瓶中，于28℃、200rpm摇床发酵培养13天，获得发酵物共计约30L。

2.提取处理与乙酸乙酯浸膏的制备

将全部发酵液(约30L)用6层纱布过滤，分为滤液和菌丝体。滤液(约28L)直接用等量乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩得滤液的乙酸乙酯萃取物；菌丝体用66％丙酮水溶液(约20L)超声2h，室温浸提12h后用6层纱布过滤，重复操作3次，合并滤液，减压浓缩至不含丙酮后，残余水层(约6L)用等量乙酸乙酯萃取3次，得菌丝体提取物的乙酸乙酯萃取物。薄层层析结果显示，上清液的乙酸乙酯萃取物与菌丝体的乙酸乙酯萃取物所含主要斑点相同，因此将该两部分萃取物合并后减压浓缩至干，得到乙酸乙酯总浸膏20g。

3.乙酸乙酯浸膏的柱层析分离与含有目标化合物的层析组分制备

将上述乙酸乙酯总浸膏(20g)用30ml二氯甲烷-甲醇(体积比9∶1)混合溶剂溶解并加30g硅胶(100-200目)吸附干燥，添加到装有100-200目硅胶100g的玻璃减压柱(柱床：6.0cm×14cm)上，再用二氯甲烷-甲醇(体积比为1∶0→0∶1)溶剂系统进行减压梯度洗脱，根据薄层层析检测结果，收集合并相应洗脱液浓缩，共获得4个组分：Fr-1(3.5g，二氯甲烷→二氯甲烷-甲醇体积比9∶1溶剂洗脱组分)、Fr-2(6.0g，二氯甲烷-甲醇体积比9∶1洗脱组分)、Fr-3(2.0g，二氯甲烷-甲醇体积比9∶1洗脱组分)、Fr-4(10.5g，二氯甲烷-甲醇体积比9∶1→甲醇洗脱组分)。经薄层检测，Fr-2中含有目标化合物。

将组分Fr-2(6.0g)，用15ml二氯甲烷-甲醇体积比1∶1混合溶剂溶解，湿法上用95％乙醇预装好的Sephadex LH-20柱(柱床：5.5cm×43cm)，并用95％乙醇进行洗脱，根据薄层检测结果收集洗脱液合并浓缩，按被洗脱先后顺序依次得到7个组分：Fr-21(0.3g)、Fr-22(1.8g)、Fr-23(2.5g)、Fr-24(0.5g)、Fr-25(0.2g)、Fr-26(0.1g)、Fr-27(0.6g)。其中组分Fr-24、Fr-25和Fr-26中均含有目标化合物，遂将其合并后减压浓缩至干，得到含有化合物I和化合物II的柱层析组分A(0.8g)。

4.含化合物I组分和含化合物II组分的分离制备

将含有化合物I和化合物II的组分A(0.8g)用3ml氯仿-甲醇体积比1∶1的混合溶剂溶解后，湿法上二氯甲烷-甲醇体积比1∶1溶剂中装好的Sephadex LH-20柱(柱床：130cm×2cm)上，用相同二氯甲烷-甲醇1∶1混合溶剂洗脱进行层析分离，根据薄层检测结果收集合并洗脱液并浓缩，按洗脱先后顺序得到4个组分：Fr-A1(0.4g)、Fr-A2(0.1g)、Fr-A3(0.2g)、Fr-A4(0.1g)。其中组分Fr-A3中含有化合物I和化合物II。将组分Fr-A3(0.2g)用0.5ml的二氯甲烷-甲醇体积比9∶1混合溶剂溶解后，用硅胶制备薄层层析(bp 60-90℃石油醚-丙酮体积比2∶1展开)进行分离，制备得到含有化合物I(R_f≈0.3)的组分Fr-A31(80mg)和含有化合物II(R_f≈0.5)的组分Fr-A32(50mg)。

5.化合物I的分离制备

1)化合物I的HPLC分离精制

将含有化合物I的组分Fr-A31(80mg)用2ml甲醇溶解，用0.45μm滤膜过滤后，用Waters 600型HPLC系统(Waters 600控制器、Waters600泵、Waters 2414RI检测器、Waters 2996PDA检测器、Empower色谱工作站)，利用Senshu pak RP-18半制备柱(8mm×250mm)进行室温HPLC分离(以甲醇-水体积分数60∶40为流动相，流速1.5ml/min，每次进样100μl，检测波长为254nm)，制得化合物I(保留时间t_R＝17min)纯品12mg。

2)化合物I的理化常数与波谱数据

化合物I为白色结晶性粉末，mp 81-83℃，易溶于氯仿，可溶于甲醇、乙醇，不溶于水，[α]_D ²⁰-103°(c 0.05，氯仿)。正离子ESI-MSm/z：460[M+H]⁺，482[M+Na]⁺，498[M+K]⁺；负离子ESI-MS m//z：458[M-H]^-，494[M+Cl]^-；548[M+89(草酸C₂H₂O₄-H)]^-。正离子HR-ESI-MS m/z：实测值460.2234[M+H]⁺，计算值460.2236(C₂₇H₃₀N₃O₄[M+H]⁺)；实测值482.2061[M+Na]⁺，计算值482.2056(C₂₇H₂₉N₃O₄Na[M+Na]⁺)；实测值498.1975[M+K]⁺，计算值498.1975(C₂₇H₂₉N₃O₄K[M+K]⁺)。UVλ_maxnm(logε)in MeOH：284(3.84)，274(3.92)，246(4.65)，215(4.84)。IR v_maxcm^-1(KBr)：3404，2968，2923，1675，1477，1419，1386，1340，1280，1254，1203，1134，1091，755，734，701。CD λ_maxnm(mdeg)inMeOH at 1.0mg/ml：283.5(-6.50557)，252.5(13.2190)，216.5(-91.1067)，205.5(13.9807)。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.13(1H，br d，J＝7.2，H-7)，7.39(1H，td，J＝7.2，1.6Hz，H-8)，7.13(1H，br t，J＝7.2，H-9)，7.10(1H，br d，J＝7.2，H-10)，7.01-6.88(5H，m，H-14～H-18)，6.55(1H，br s，H-2)，5.92(1H，br s，H-5a)，5.70(1H，dd，J＝17.2，10.8Hz，H-20)，5.10(1H，d，J＝10.8Hz，H_cis-21)，5.07(1H，d，J＝17.2Hz，H_trans-21)，4.53(1H，br s，3-OH)，3.15(1H，d，J＝13.4Hz，Ha-12)，2.94(1H，d，J＝13.4Hz，Hb-12)，2.66(3H，br s，H-23)，2.37(1H，dd，J＝10.9，5.5Hz，Hα-11)，2.32(1H，dd，J＝10.9，5.5Hz，H-11a)，2.16(1H，t，J＝10.9Hz，Hβ-11)，1.08(3H，s，H-19a)，0.89(3H，s，H-19b)。¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ：169.98(C-22)，166.77(C-1)，166.34(C-4)，143.13(2C，C-7a，20)，132.20(C-13)，131.31(C-10a)，130.10(2C，C-14，18)，129.09(C-8)，128.62(2C，C-15，17)，127.36(C-16)，124.56(C-10)，124.29(C-9)，119.22(C-7)，114.68(C-21)，83.23(C-3)，79.24(C-5a)，60.65(C-10b)，59.51(C-11a)，48.55(C-12)，40.25(C-19)，35.58(C-11)，23.51(C-23)，23.03(C-19b)，22.23(C-19a)。以上NMR数据根据DEPT、NOE差谱等一维谱以及¹H-¹H COSY、HMQC、HMBC、NOESY等二维谱解析结果予以归属。

6.化合物II的分离制备

1)化合物II的HPLC分离精制

将含有化合物II的组分Fr-A32(50mg)用1.5ml甲醇溶解，0.45μm滤膜过滤，用Waters 600型HPLC系统(Waters 600控制器、Waters600泵、Waters 2414RI检测器、Waters 2996PDA检测器、Empower色谱工作站)，利用Senshu pak RP-18半制备柱(8mm×250mm)进行室温HPLC分离(以甲醇-水体积分数60∶40为流动相，流速1.5ml/min，每次进样100μl，检测波长为254nm)，制得化合物II(保留时间t_R＝32min)纯品8mg。

2)化合物II的理化常数与波谱数据

化合物II为白色结晶性粉末，mp 92-94℃，易溶于氯仿，可溶于甲醇、乙醇，不溶于水，[α]_D ²⁰-115°(c0.1，甲醇)。正离子ESI-MS m/z：460[M+H]⁺，482[M+Na]⁺，498[M+K]⁺；负离子ESI-MS m/z：458[M-H]^-，494[M+Cl]^-；548[M+89(草酸C₂H₂O₄-H)]^-。正离子HR-ESI-MS m/z：实测值460.2237[M+H]⁺，计算值460.2236(C₂₇H₃₀N₃O₄[M+H]⁺)；实测值482.2073[M+Na]⁺，计算值482.2056(C₂₇H₂₉N₃O₄Na[M+Na]⁺)；实测值498.1971[M+K]⁺，计算值498.1975(C₂₇H₂₉N₃O₄K[M+K]⁺)。UVλ_max nm(logε)in MeOH：284(3.87)，276(3.94)，245(4.63)，215(4.88)。IRv_max cm^-1(KBr)：3378，2968，2927，1675，1479，1459，1402，1383，1286，1265，1135，1095。CDλ_max nm(mdeg)in MeOH at 1.0mg/ml：244.0(19.700)，216.0(-69.6483)，200.0(-8.74017)，193.5(-9.24908)。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.07(1H，br s，H-7)，7.40(1H，td，J＝7.7，1.4Hz，H-8)，7.37-7.31(3H，over l apped，H-10，15，17)，7.347.28(1H，overlapped，H-16)，7.20(1H，br t，J＝7.7Hz，H-9)，7.18(2H，br d，J＝6.8Hz，H-14，18)，5.99(1H，br s，H-5a)，5.77(1H，dd，J＝17.3，10.9Hz，H-20)，5.57(1H，s，H-2)，5.15(1H，d，J＝10.9Hz，H_cis-21)，5.12(1H，d，J＝17.3Hz，H_trans-21)，4.37(1H，dd，J＝11.5，3.6Hz，H-3)，3.60(1H，dd，J＝14.6，3.6Hz，Ha-12)，2.82(1H，d，2＝14.6Hz，Hβ-11)，2.71(1H，dd，J＝14.6，11.5Hz，Hb-12)，2.66(3H，br s，H-23)，2.62(1H，d，J＝14.6Hz，Hα-11)，1.13(3H，s，H-19a)，0.96(3H，s，H-19b)。¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ：170.06(C-22)，167.52(C-1)，166.78(C-4)，142.68(C-20)，142.26(C-7a)，135.22(C-13)，133.45(C-10a)，129.71(C-8)，129.41(2C，C-14，18)，128.99(2C，C-15，17)，127.73(C-16)，124.89(C-9)，124.58(C-10)，120.44(C-7)，115.03(C-21)，80.65(C-5a)，88.35(C-11a)，59.10(C-10b)，55.32(C-3)，41.44(C-11)，40.45(C-19)，35.68(C-12)，23.57(C-23)，22.90(C-19b)，22.28(C-19a)。以上NMR数据根据DEPT、NOE差谱等一维以及¹H-¹H COSY、HMQC、HMBC、NOESY等二维谱解析结果予以归属。

实施例2：其它式I化合物的制备

将实施例1中制备的化合物I和化合物II分别在适当催化剂催化下与碘甲烷(或硫酸二甲酯)反应可分别制得化合物I的甲基化产物(式I化合物，其中R₁＝β-H，R₂＝α-OCH₃)和化合物II的甲基化产物(式I化合物，其中R₁＝α-OCH₃，R₂＝β-H)。

也可以将化合物I和化合物II分别与碘乙烷(或硫酸二乙酯)反应制得化合物I的乙基化产物(式I化合物，其中R₁＝β-H，R₂＝α-OCH₂CH₃)和化合物I I的乙基化产物(式I化合物，其中R₁＝α-OCH₂CH₃，R₂＝β-H)。

此外，经化合物I和化合物II的乙酰化反应可分别制得化合物I的乙酰化产物(式I化合物，其中R₁＝β-H，R₂＝α-OCOCH₃)和化合物II的乙酰化产物(式I化合物，其中R₁＝α-OCOCH₃，R₂＝β-H)。

也可以与琥珀酸反应制得化合物I的琥珀酰化产物(式I化合物，其中R₁＝β-H，R₂＝α-琥珀酰氧基)和化合物II的琥珀酰化产物(式I化合物，其中R₁＝α-琥珀酰氧基，R₂＝β-H)。

还可以与亚油酸反应制得化合物I的亚油酰化产物(式I化合物，其中R₁＝β-H，R₂＝α-亚油酰氧基)和化合物II的亚油酰化产物(式I化合物，其中R₁＝α-亚油酰氧基，R₂＝β-H)。

实施例3：化合物I和化合物II及其衍生物的抗肿瘤活性测试

1.实验材料

1)被测样品溶液的配制

测试样品为上述实施例1中分离精制的纯品化合物I和化合物II、上述实施例2中制得的化合物I的甲基化产物和乙酰化产物以及化合物II的甲基化产物和乙酰化产物。精密称取适量样品，用甲醇配成所需浓度的溶液，供测试活性。

2)细胞系及细胞的继代培养

活性测试采用人髓性慢性白血病K562细胞系。K562细胞用含10％胎牛血清以及青霉素和链霉素各100μg/ml的RPMI-1640培养基常规传代，并于37℃通入5％二氧化碳的细胞培养箱中培养维护。

2.活性测试方法

样品抗肿瘤活性采用MTT法结合细胞形态学检测的方法进行测试。取对数生长期的K562细胞，用新鲜RPMI-1640培养基配制细胞密度为2×10⁵个/ml的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200μl，37℃培养1h后样品组每孔加样品液各2μl，空白对照组则每孔加甲醇各2μl，继续于37℃培养24h。培养结束后在光学显微镜下观察细胞形态变化，判断有无细胞凋亡或细胞坏死的形态特征，必要时拍照。每孔加预冷的5mg/ml的MTT溶液(用PBS溶液配制)各20μl，37℃孵育4h后，于4℃、2000rpm离心10min，吸去上清液，每孔各加150μl DMSO，置于酶标仪上充分振荡使MTT紫色产物完全溶解，测量每孔570nm处的OD值。实验中全部测试样品和空白对照组均分别设三个平行孔，取OD平均值，以空白对照组为100％按公式IR％＝(OD_空白-OD_样品)/OD_空白×100％计算抑制率(IR％)。

3.实验结果

1)MTT法测试结果

在MTT法测试中，化合物I和II对K562细胞均显示出抑制细胞增殖的抗肿瘤活性，其中化合物I的活性相对较弱，在100g/ml和50μg/ml浓度下对K562细胞的抑制率分别为34.8％和31.0％，而化合物II的抑制活性较强，在100μg/ml和50μg/ml浓度下对K562细胞的抑制率分别为88.2％和60.2％。

化合物I的甲基化产物和乙酰化产物以及化合物II的甲基化产物和乙酰化产物对K562细胞也均显示出一定的抑制作用，其在50μg/ml浓度下对K562细胞的抑制率分别分布在30％-50％的区间里。

2)细胞形态学检测结果

在光学倒置显微镜下观察到，K562细胞经100μg/ml和50μg/ml化合物I处理24h后，部分细胞呈未完成完整细胞分裂的短粗棒状或梭状等异型形态，而且高浓度处理组(100μg/ml)的该类异型细胞较低浓度处理组(50μg/ml)多，提示化合物I可能通过作用于细胞骨架蛋白上抑制细胞分裂从而发挥其抑制细胞增殖的抗肿瘤作用。而K562细胞经100μg/ml和50μg/ml化合物II处理24h后，视野中部分细胞呈胞体膨大、细胞质凝集等坏死性细胞形态，同时还有更多细胞则呈雪花状或尚未完全散开的碎片状等凋亡细胞的形态特征，尤其在100μg/ml化合物II处理组细胞中大多细胞呈凋亡形态特征，表明化合物II主要通过诱发细胞凋亡同时通过对K562细胞的坏死性细胞毒活性发挥其抑制细胞增殖的抗肿瘤作用。

4.结论

化合物I和化合物II均具有抗肿瘤活性，化合物I可通过作用于骨架蛋白上抑制细胞分裂从而发挥其抑制癌细胞增殖的抗肿瘤作用，化合物II则通过细胞凋亡诱导以及杀伤性细胞毒作用发挥其抑制癌细胞增殖的抗肿瘤作用，因此化合物I和化合物II可用作为细胞骨架蛋白抑制剂、细胞凋亡诱导剂、肿瘤细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂。

此外，化合物I的甲基化产物和乙酰化产物以及化合物II的甲基化产物和乙酰化产物对K562细胞也均具有细胞增殖抑制作用，因此也可以用作肿瘤细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.式I化合物，或其药学上可接受的盐，

式I

其中，

R₁和R₂各自独立地代表氢、羟基、C_1-10直链或支链烷氧基、C_2-10直链或支链烯基氧基、C_2-10直链或支链炔基氧基、C_6-10直链或支链芳基氧基、或C_2-18的饱和或不饱和脂肪酰氧基。

2.根据权利要求1所述的式I化合物，或其药学上可接受的盐，其中，

R₁和R₂各自独立地代表氢、羟基、甲氧基、乙氧基、乙酰氧基、琥珀酰氧基、或亚油酰氧基。

3.根据权利要求2所述的式I化合物，或其药学上可接受的盐，其中，

R₁代表β-H，R₂代表α-OH、α-OCH₃、或α-OCOCH₃；或者

R₁代表α-OH、α-OCH₃、或α-OCOCH₃，R₂代表β-H。

4.产紫青霉G591DS600S，其保藏编号为CGMCC No.4283，保藏日期为2010年11月1日，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。

5.权利要求1至3中任一项所述的式I化合物的制备方法，包括如下步骤：

将权利要求4所述的产紫青霉进行发酵培养，获得含有式I化合物的发酵物，将发酵物进行分离纯化，得到式I化合物。

6.根据权利要求5所述的方法，包括如下步骤：

1)将权利要求4所述的产紫青霉进行发酵培养，获得发酵液；

2)将发酵液过滤，得到滤液和菌丝体；

3)将滤液用乙酸乙酯萃取得到滤液的乙酸乙酯萃取物；将菌丝体用丙酮水溶液浸提后过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，得到菌丝体的乙酸乙酯萃取物；将该两部分萃取物合并后减压浓缩至干，得到乙酸乙酯总浸膏；

4)将乙酸乙酯总浸膏用体积比为9∶1的二氯甲烷-甲醇的混合溶剂溶解，用100-200目硅胶柱分离，用二氯甲烷-甲醇溶剂系统进行减压梯度洗脱，得到含有所述化合物的洗脱组分，再将该洗脱组分用Sephadex LH-20柱经用95％乙醇进行洗脱分离，得到含有所述化合物的柱层析组分；

5)将柱层析组分进一步进行Sephadex LH-20柱分离和硅胶制备薄层层析分离，得到含有所述化合物的层析组分；

6)将层析组分进行HPLC分离，得到所述化合物。

7.权利要求4所述的产紫青霉在制备权利要求1至3中任一项所述的式I化合物中的用途。

8.一种组合物，其含有权利要求1至3中任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐，可选地，还含有一种或多种药用载体或赋形剂。

9.权利要求1至3中任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐在制备细胞骨架蛋白抑制剂、细胞凋亡诱导剂、或肿瘤细胞增殖抑制剂中的用途。

10.权利要求1至3中任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的用途，具体地，所述肿瘤为白血病、乳腺癌、肺癌、肝癌、或肠癌。