CN113930346B

CN113930346B - 一种海洋来源曲霉菌及其发酵产物在抗芒果炭疽病菌中的应用

Info

Publication number: CN113930346B
Application number: CN202111243196.3A
Authority: CN
Inventors: 陈显强; 邢楠楠; 刘永宏; 高程海
Original assignee: Guangxi University of Chinese Medicine
Current assignee: Guangxi University of Chinese Medicine
Priority date: 2021-10-25
Filing date: 2021-10-25
Publication date: 2023-03-24
Anticipated expiration: 2041-10-25
Also published as: CN113930346A

Abstract

本发明提供一种海洋来源曲霉菌及其发酵产物在抗芒果炭疽病菌中的应用，该菌种命名为Aspergillus sp.GXIMD02003，专利保藏号为GDMCC NO:61920，保藏地点为广东省广州市广东省微生物保藏中心，保藏时间：2021年9月7日。该菌种的发酵产物主要含曲酸，含量高达79％。本发明专利通过高速逆流色谱技术快速制备菌株发酵产物的主成分曲酸。该菌株发酵产物能够提高嘧菌酯对芒果炭疽病菌的敏感性，可做为嘧菌酯的增敏剂，在生物农药的开发研制方面有很好应用前景。

Description

一种海洋来源曲霉菌及其发酵产物在抗芒果炭疽病菌中的应用

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体来说涉及一种海洋来源曲霉菌及其发酵产物在抗芒果炭疽病菌中的应用。

背景技术

曲酸具有抗氧化、抗菌、杀虫、抗肿瘤等广泛的生物活性，已在化妆品、食品和制药工业等领域广泛应用。曲霉属和青霉属真菌是产生曲酸的常见菌种。这些菌在曲酸生产中以葡萄糖、蔗糖和淀粉通常作为碳源，蛋白胨和酵母膏作为常用氮源。一些农工副产品也可作为曲酸发酵的培养基成分，如豆渣、黄浆水、木薯淀粉、白薯粉淀粉酶水解液、柑橘皮渣、豆饼粉、鲣油等。目前，曲酸生产在工业化生产采用液体培养基发酵，其所需设备和原料成本较高。

发酵液中曲酸的提取方法有乙酸乙酯萃取法、沉淀法、吸附法、浓缩结晶法等，这些方法操作繁琐、操作的要求较高、污染严重、不易获得纯度较高的曲酸发酵产物。目前曲酸生产工艺通常采用发酵液浓缩结晶法获得曲酸粗提物，再结合反复脱色、结晶技术获得高纯度的曲酸。发明专利(CN 105837543 B)将曲酸发酵液过滤除菌、阳离子交换树脂去除杂质阳离子、浓缩结晶、活性炭脱色和浓缩重结晶，得到曲酸产品。发明专利(CN 105112470B)将含有曲酸的发酵液浓缩至有少量晶体产生，将其置于温度为2℃条件下结晶，获得紫红色粗制曲酸结晶，而后采用活性炭脱色、离子去杂、结晶的方法获得高纯度的曲酸化合物。现有技术提供的曲酸纯化工艺流程复杂、污染严重、成本较高、曲酸回收率低。高速逆流色谱(HSCCC)是一种不使用固态支撑体或载体的液液分配色谱技术。它利用被分离物质在两相中的分配差异实现物质的高效分离，由于它的流动相和固定相均为液体，不需要固相载体，避免了样品的不可逆吸附、失活、污染等问题。高速逆流色谱因具有高效、稳定、环保、高回收率、成本低和制备量大的特点，广泛用于天然产物的分离纯化。本发明采用高速逆流色谱技术纯化曲酸，可以有效规避曲酸纯化工艺步骤繁多、污染重、曲酸损耗大、成本较高等问题。

中国是世界第二大杧果生产国和世界最大的杧果消费国。杧果炭疽病是杧果生长期和采后的主要病害之一，可引起杧果植株梢枯、叶枯、落花落果及采后果实大量腐烂，造成严重经济损失，是杧果产业持续健康发展的重要制约因。Colletotrichum asianum是杧果生长期和采后炭疽病的的主要病原菌，也是广西杧果炭疽病菌的优势种。芒果炭疽病以化学防治为主。常用的药剂主要包括有机硫类杀菌剂(如代森锰锌、代森锌、丙森锌等)、取代苯类杀菌剂(主要为百菌清)和无机铜素类杀菌剂(包括波尔多液、铜铵合剂、氧氯化铜等)；苯并咪唑类杀菌剂(如苯菌灵、多菌灵、甲基硫菌灵、噻菌灵等)；麦角甾醇生物合成抑制剂类杀菌剂(如咪鲜胺、苯醚甲环唑)；甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂(如嘧菌酯)等。虽然这些化学药剂能有效防止芒果炭疽病，但是长期高频、大量使用会造成环境污染，并且易造成芒果炭疽病菌抗药性。因此，降低化学药剂的使用量有助于芒果炭疽病长期有效地防治和环境保护。

本发明的真菌发酵产物和其中的主要成分曲酸作为增效剂提高嘧菌酯对芒果炭疽病的敏感性在国内外未见报道。因此，具有知识产权的抗芒果炭疽病菌增效剂对我国研发高效、环保的生物农药以及芒果产业持续健康的发展具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种海洋来源曲霉菌及其发酵产物在抗芒果炭疽病菌中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种海洋来源曲霉菌Aspergillus sp.GXIMD02003，该菌株已于2021年9月7日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:61920，其16s rRNA序列如序列表SEQ NO.1所述。

一种海洋来源曲霉菌的发酵产物，由所述曲霉菌Aspergillus sp.GXIMD02003发酵获得，其制备步骤如下：

步骤一、微生物发酵

(1)种子液制备：取马铃薯提取粉1g、葡萄糖2g、100mL海水置于500mL三角瓶，摇匀。在121℃下，高压灭菌20min，放冷后作为种子培养基。在生物安全柜中将菌种Aspergillus sp.GXIMD02003接种于种子培养基中，封口。在25℃、180rpm下培养72小时作为种子液。

(2)大规模发酵：称取100g大米、酵母提取粉2g，蛋白胨2g放入1000mL锥形瓶中，加入110mL海水，封口、摇匀。在121℃下，高压灭菌20min。取出放冷后，接入10mL种子液。在25-28℃下静置培养28-40天。

步骤二、发酵产物的提取

将发酵后的大米培养基搅碎、混匀，加入水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯任何一种溶剂，采用超声提取、浸提或回流提取法提取3-5次，过滤，合并过滤液。减压回收溶剂，得到提取物浸膏。

在上述技术方案中，在步骤二中，溶剂优选为水。

在上述技术方案中，在步骤二中，提取方法优选为超声提取。

在上述技术方案中，在步骤二中，最优提取条件为：以水为提取溶剂，料液比1:20，超声提取3次。

一种海洋来源曲霉菌的发酵产物在抗芒果炭疽病菌中的应用，所述曲霉菌Aspergillus sp.GXIMD02003的发酵产物与嘧菌酯联合用药可抑制芒果炭疽病菌，最小抑制浓度分别为40g/mL、5g/mL，所述曲霉菌Aspergillus sp.GXIMD02003的发酵产物与嘧菌酯联合用药的分数抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index，FICI)为0.313，其相互作用是协同作用，与单独用药相比，嘧菌酯在相同的抑菌效果时的用量显著减少。因此，上述发酵产物有望开发成与嘧菌酯联合使用的生物农药。

一种海洋来源曲霉菌的发酵产物在制备植物病菌农药增敏剂中的应用，本发明所述的发酵产物可以提高有机农药嘧菌酯对芒果炭疽病菌的敏感性，减少有机农药的使用量和环境污染，并且降低农业病菌的耐药性。

本发明的优点和有益效果为：

本发明公开了一种海洋来源曲霉菌Aspergillus sp.GXIMD02003，该真菌的保藏号为GDMCC NO:61920，保藏地点为广东省广州市广东省微生物保藏中心，保藏时间：2021年9月7日。

本发明公开了一种海洋来源真菌Aspergillus sp.GXIMD02003的发酵产物在提高嘧菌酯抑制芒果炭疽病菌的敏感性中应用。进一步地，本发明提供了嘧菌酯抑制芒果炭疽病菌的增敏剂，该增敏剂可用于制备生物农药，降低化学农药的使用量，减少农业病菌的化学耐药性。

附图说明

图1为发酵产物的HPLC谱图。

图2为高速逆流色谱制备所得曲酸的HPLC谱图。

图3为曲酸¹H-NMR图。

图4为曲酸¹³C-NMR图。

对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1：微生物发酵产物的制备

1、微生物发酵

种子液制备：取马铃薯提取粉1g、葡萄糖2g、100mL海水置于500mL三角瓶，摇匀。在121℃下，高压灭菌20min，放冷后作为种子培养基。在生物安全柜中将菌种Aspergillussp.GXIMD02003接种于种子培养基中，封口。在25℃、180rpm下培养72小时作为种子液。

大规模发酵：称取100g大米、酵母提取粉2g，蛋白胨2g放入1000mL锥形瓶中，加入110mL海水，封口、摇匀。在121℃下，高压灭菌20min。取出放冷后，接入10mL种子液。在25-28℃下静置培养28-40天。

2、发酵产物的提取

将发酵后的大米培养基搅碎、混匀，加入水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯任何一种溶剂提取3-5次，过滤，合并过滤液。减压回收溶剂，得到提取物浸膏。经初步实验结果表明，水作为提取溶剂，提取效果最佳。在超声提取、浸提、回流提取法中，超声提取效果最好，回流提取次之，浸提法效率最低。最佳提取条件为：以水为提取溶剂，料液比1:20，超声提取3次。

实施例2：高速逆流色谱制备曲酸

化合物分离：取乙酸乙酯-正丁醇-水(3:2:5，v/v)或正丁醇-水(5:5，v/v)充分混合，静置过夜后两相分离，超声脱气。上相作固定相，下相作流动相。将固定相以20-50mL/min的流速泵入螺旋管，再以800r/min正转，流动相流速设置为3-5mL/min，温度30℃。当流动相被置换出来时，将样品通过进样阀注入高速逆流色谱仪，检测波长268nm。根据色谱流出图收集样品，减压回收溶剂，获得高纯度的曲酸，纯度高达99.8％，回收率达98.5％。

HPLC法测曲酸含量测定方法：色谱柱：Inertsil ODS-SP(5μm，150×4.6mm)；流动相：2‰磷酸水溶液(A)/甲醇(B)(95:5)等度洗脱；流速：1.2mL/min；柱温：30℃；检测波长：269nm；进样体积：10μL。回归方程为Y＝24389.37X+2678.94，在8.44mg/L–135mg/L范围内线性良好，最终测定曲酸含量(m/m)为72-79％。

图1为发酵产物的HPLC谱图。图2为高速逆流色谱制备所得曲酸的HPLC谱图。图3为曲酸1H-NMR图。图4为曲酸13C-NMR图。

曲酸结构鉴定：化合物为白色针状晶体。¹H-NMR(700MHz,CD₃OD)δ:7.96(1H,s,H-6),6.50(1H,s,H-3),4.41(2H,s,H-4)；13C-NMR(175MHz,CD3OD)δ:170.4(C-2),110.7(C-3),176.9(C-4),147.4(C-5),141.0(C-6),61.2(C-7)。以上核磁数据与文献报道基本一致，因此化合物鉴定为曲酸。

实施例3：与嘧菌酯联合作用于芒果炭疽病菌的药敏实验

菌悬液制备：将芒果炭疽病菌Colletotrichum asianum菌株转种PDA培养基上，复苏活化后转种于PDB培养液中，在37℃条件下培养72h。调整菌悬液浓度至0.5×10⁴-5×10⁴CFU/mL备用。

药物储存液制备：将实施例1所得发酵产物、实施例2所得曲酸溶解在水中，嘧菌酯溶解在DMSO中，获得的储存浓度分别为25.6mg/mL、25.6mg/mL、1.6mg/mL的储存原液。

用PDB液体培养基将药物原液进行倍比稀释，得到4倍终浓度的药物工作液，50μL药物加入联合用药区的96孔培养板内。第2列到第9列的嘧菌酯终浓度分别为40μg/mL，20μg/mL，10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.625μg/mL。第2行到第8行曲酸的药物终浓度为1280μg/mL，640μg/mL，320μg/mL，160μg/mL，80μg/mL，40μg/mL，20μg/mL。第1列的2～9孔和第1行2～8孔为单独用药，加入2倍终浓度药物的倍比稀释液100μL，各药物单独应用时的终浓度为嘧菌酯0.625～40μg/mL、曲酸20～1280μg/mL。第10列为生长对照，加入不含药物的培养基100μL；A1孔为空白对照。接种菌悬液时除空白对照孔外其余各孔均加入100μL的2倍终浓度的菌悬液。药敏反应板置于25℃恒温培养箱中培养72h后观察结果。

培养72h后，记录单独用药及联合用药时，嘧菌酯、曲酸在100％生长抑制所对应的最低浓度，即最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。联合用药时各药的MIC值分别除以单独用药时MIC值的商的和即分数抑菌浓度指数(fractionalinhibitory concentration index，FICI)。按照以下公式计算分FICI。

当FICI≤0.50时为协同作用，当0.50＜FICI≤4为无关，FICI＞4为拮抗作用。

表1曲酸和嘧菌酯抗芒果炭疽病菌联合药敏实验的相互作用(μg/mL)

通过上述实验得到如下结果：曲酸与嘧菌酯联合应用于抑制芒果炭疽病菌Colletotrichum asianum的最小抑制浓度分别为160μg/mL、5μg/mL，分数抑菌浓度指数(FICI)为0.375。发酵产物与嘧菌酯联合应用于抑制芒果炭疽病菌Colletotrichumasianum的最小抑制浓度分别为40μg/mL、5μg/mL，分数抑菌浓度指数(FICI)为0.313。相对于曲酸，本实验中的发酵产物具有更低的最小抑制浓度，以及更好的协同作用，可作为嘧菌酯抑制芒果炭疽病菌的增敏剂，该增敏剂可用于制备生物农药，降低化学农药的使用量，减少农业病菌的化学耐药性。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西中医药大学

<120> 一种海洋来源曲霉菌及其发酵产物在抗芒果炭疽病菌中的应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 565

<212> DNA

<213> Aspergillus

<400> 1

gcggaaggat cattaccgag tgtagggttc ctagcgagcc caacctccca cccgtgttta 60

ctgtacctta gttgcttcgg cgggcccgcc attcatggcc gccgggggct ctcagccccg 120

ggcccgcgcc cgccggagac accacgaact ctgtctgatc tagtgaagtc tgagttgatt 180

gtatcgcaat cagttaaaac tttcaacaat ggatctcttg gttccggcat cgatgaagaa 240

cgcagcgaaa tgcgataact agtgtgaatt gcagaattcc gtgaatcatc gagtctttga 300

acgcacattg cgccccctgg tattccgggg ggcatgcctg tccgagcgtc attgctgccc 360

atcaagcacg gcttgtgtgt tgggtcgtcg tcccctctcc gggggggacg ggccccaaag 420

gcagcggcgg caccgcgtcc gatcctcgag cgtatggggc tttgtcaccc gctctgtagg 480

cccggccggc gcttgccgaa cgcaaatcaa tctttttcca ggttgacctc ggatcaggta 540

gggatacccg ctgaacttaa gcata 565

Claims

1.一种海洋来源曲霉菌，其特征在于：其名称为曲霉菌Aspergillus sp. GXIMD02003，该菌株已于2021 年9 月7 日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市先烈中路100 号大院59 号楼5 楼，保藏编号为GDMCC No: 61920。

2.一种如权利要求1所述的海洋来源曲霉菌的发酵产物，其特征在于，制备步骤如下：

步骤一、微生物发酵

（1）种子液制备：取马铃薯提取粉1g、葡萄糖2g、100 mL 海水置于500 mL 三角瓶，摇匀；在121 ℃下，高压灭菌20 min，放冷后作为种子培养基；在生物安全柜中将所述海洋来源曲霉菌接种于种子培养基中，封口；在25℃、180 rpm 下培养72 小时作为种子液；

（2）大规模发酵：称取100 g 大米、酵母提取粉2g，蛋白胨2g 放入1000 mL 锥形瓶中，加入110 mL 海水，封口、摇匀；在121℃下，高压灭菌20 min；取出放冷后，接入10 mL 种子液；在25-28 ℃下静置培养28-40 天；

步骤二、发酵产物的提取

将发酵后的大米培养基搅碎、混匀，加入水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯任何一种溶剂，采用超声提取、浸提或回流提取法提取3-5 次，过滤，合并过滤液；减压回收溶剂，得到提取物浸膏。

3.根据权利要求2 所述的一种海洋来源曲霉菌的发酵产物，其特征在于：在步骤二中，溶剂为水。

4.根据权利要求2 所述的一种海洋来源曲霉菌的发酵产物，其特征在于：在步骤二中，提取方法为超声提取。

5.根据权利要求2 所述的一种海洋来源曲霉菌的发酵产物，其特征在于：在步骤二中，提取条件为：以水为提取溶剂，料液比1:20，超声提取3 次。

6.一种如权利要求2所述的海洋来源曲霉菌的发酵产物在抗芒果炭疽病菌中的应用，其特征在于：所述海洋来源曲霉菌的发酵产物与嘧菌酯联合用药可抑制芒果炭疽病菌，最小抑制浓度分别为40 g/mL、5 g/mL，所述曲霉菌Aspergillus sp. GXIMD02003 的发酵产物与嘧菌酯联合用药的分数抑菌浓度指数为0.313。

7.一种如权利要求2所述的海洋来源曲霉菌的发酵产物在制备植物病菌农药增敏剂中的应用，其特征在于：所述海洋来源曲霉菌的发酵产物可以提高有机农药嘧菌酯对芒果炭疽病菌的敏感性，减少有机农药的使用量和环境污染，并且降低农业病菌的耐药性。