CN105037396B - 一类二硫桥二酮哌嗪类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类二硫桥二酮哌嗪类化合物及其制备方法和用途。本发明从菌株青霉Penicillium sp.HDN13‑309中生产出一类新的二硫桥二酮哌嗪类化合物。经实验证实，该类化合物可作为细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂。

Description

一类二硫桥二酮哌嗪类化合物及其制备方法和用途

技术领域：

本发明涉及用一株青霉Penicillium sp.HDN13-309(保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101保藏编号：CGMCC 9429保藏日期：2014年7月9日)生产含二硫桥二酮哌嗪类化合物的方法；本发明还涉及该类化合物在抗肿瘤方面的用途。

背景技术：

本发明人从菌株青霉Penicillium sp.HDN13-309(保藏编号是：CGMCC 9429)液体发酵产物中分离出一类含二硫桥二酮哌嗪类化合物。研究发现所示化合物具有抗肿瘤活性，目前尚未见该化合物的化学结构及细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此有关的药物。

发明内容：

本发明旨在提供一种结构新颖的具有高抗肿瘤活性的新化合物。其结构式是

本发明的式I和II化合物可通过微生物发酵培养来获取含有该类化合物的发酵物，然后从发酵物中采用Sephadex LH20凝胶柱层析，中压MPLC，半制备HPLC等方法分离纯化得到。本发明的下述实施例中列举了利用青霉Penicillium sp.HDN13-309(保藏编号是：CGMCC 9429)制备本发明式I和II化合物的实例。

具体实施方式：

在如下的实施例中所指的化合物I和II的化学结构(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位)是：

实施例1化合物I和II的发酵生产及分离精制

1发酵生产

生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取菌株青霉Penicilliumsp.HDN13-309(保藏编号是：CGMCC 9426)适量，接种到PDA固体斜面培养基上，在28摄氏度培养箱中培养5天。

取斜面培养5天的菌株青霉Penicillium sp.HDN13-309适量，接种到装有300mL培养基[培养基组成(克/升)：麦芽糖20.0，葡萄糖10.0，甘露醇20.0，味精10.0，酵母膏3.0，玉米浆1.0，KH₂PO₄0.5，MgSO₄·7H₂O 0.3，pH调节至6.5]的1000mL锥型瓶中，在28摄氏度条件下静置培养30天，获得发酵产物。

2浸膏的获得

用纱布将发酵液和菌丝体分离。将菌丝体用丙酮浸提三次，减压浓缩至无丙酮，所得水相用等量乙酸乙酯萃取三次。发酵液直接用等量乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相，减压浓缩，得粗浸膏，共8克。

3化合物的分离精制

浸膏(8克)用甲醇溶解后，以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂进行正相硅胶分离，分为6个组分，然后组分4以甲醇为溶剂进行LH20柱层析，分为5个流份。组分5先以C-18ODS中压柱层析，以甲醇-水为溶剂进行梯度洗脱，最后经反相半制备高效液相色谱(甲醇∶水＝55∶45)得化合物I(10mg)和II(4mg)。

化合物I白色固体，分子式C₁₉H₁₆N₂O₅S₂，HR-ESI-MS m/z：417.0582[M+H]⁺，计算值417.0573。IR(KBr)v_max 3512，1661，1625，1606，1426，1384，1098，1030，709，670，652cm^-1。¹H和¹³C-NMR数据见表1。

化合物II白色固体，分子式C₁₉H₁₆N₂O₆S₂，HR-ESI-MS m/z：433.0535[M+H]⁺，计算值433.0523。IR(KBr)v_max 3520，1667，1630，1601，1438，1383，1095，1035，709，677，655cmm^-1。¹H和¹³C-NMR数据见表1

表1化合物I(in CD₃OD)和II(in d₆-DMSO)的¹H和¹³C NMR数据(500和125MHz)^a

a)本表信号归属基于DEPT、HMQC及HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)表示。

实施例2化合物的抗肿瘤活性测试

1实验样品及实验方法

被测样品溶液的配制测试样品为上述实施例1中分离精制的化合物I和II纯品。精密称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液，供测活性。

SRB法：取对数生长期的Hela、HCT116、HO-8910和MGC803细胞用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升2×10⁵个细胞的细胞悬液，按每孔200微升接种于96孔板中，每孔加入2μL不同浓度的样品或空白溶液，37℃下培养72小时。取药物作用下培养后的细胞，首先在光学显微镜下观察药物处理引起的形态学变化，判断有无细胞周期抑制，细胞凋亡或细胞坏死的形态学特征。每孔细胞中加入80％三氯醋酸50μL，置于4℃固定1小时，用水冲洗5次并空气干燥。每孔加入0.4％SRB的醋酸溶液50μL并在室温静置30分钟。用1％醋酸水清洗4次，除去未结合的游离SRB染料。每孔加入150μL Tris缓冲液(10mmol/L，pH10.5)溶解蛋白结合染料并利用MD公司产SPECTRA MAX Plus型酶标仪测定每孔在520nm处的光密度(OD)值。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔，另设三孔空白对照和无细胞调零孔(如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零)。各孔OD值先做相应无细胞调零，再取三孔平均OD值按IR％＝(OD_空白对照-OD_样品)/OD_空白对照×100％式计算每个浓度下的 细胞增殖抑制率(IR％)，并采用bliss法计算出半数抑制率IC₅₀。

MTT法：取对数生长期的HL-60和K562肿瘤细胞，将细胞密度调至每毫升2×10⁵个细胞，按每孔200μL加到96孔细胞培养板中，于37℃通入5％CO₂的培养箱中培养4h。样品分别设定5个浓度梯度，每个浓度设3个平行样，同时设阳性、阴性对照，每孔加样品液或空白液各2μL，培养72h，然后每孔加MTT液10μL，继续培养4小时，37℃、2000转/分钟离心8分钟，吸去上清。每孔加入DMSO各100μL，在微量振荡器上振荡15分钟，至结晶完全溶解后，酶标仪测定每孔570nm处的吸光值(OD值)。取三孔平均OD值按IR％＝(OD_空白对照-OD_样品)/OD_空白对照×100％式计算样品对细胞增殖的抑制率(IR％)，并采用bliss法计算出半数抑制率IC₅₀。

2实验结果

表2化合物I和II对多种肿瘤细胞的体外细胞毒活性

3结论

化合物I和II具有较好的抗肿瘤活性，对多种肿瘤细胞模型均有抑制活性，这为开发新型抗癌药提供了化合物基础。

Claims (4)

1.化合物结构如下式所示

2.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征是发酵培养青霉Penicillium sp.HDN13-309，获取含有上述化合物的发酵物，然后从发酵物中分离纯化出该类化合物。

3.权利要求2所述的制备方法，其中将所述发酵物经Sephadex LH20凝胶柱层析，甲醇为溶剂，再经反相中压MPLC及反相半制备HPLC分离纯化得该类化合物。

4.权利要求1所述化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。