CN111334500A - 一种高产他克莫司的链霉菌株诱变制备方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种高产他克莫司的链霉菌株诱变制备方法，本发明先用亚硝基胍(NTG)诱变育种，再以活性物质韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A作为选择压，以达到他克莫司产量增加目的；本发明以活性物质韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A协同作为选择压制备的他克莫司产量比单一选择压的诱变育种产量明显高。以活性物质韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A协同作为选择压制备的筑波链霉菌具有烯丙基丙二酰辅酶A活性高和脂肪酶活性高的特性，这两者活性高能提高他克莫司产量，减少副产物生成，两者共同使用比单一选择压的诱变育种产量明显高。

Description

一种高产他克莫司的链霉菌株诱变制备方法
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，具体为一种高产他克莫司的链霉菌株诱变制备方法。
【背景技术】
他克莫司(Tacrolimus)又名FK-506，是1979年从日本筑波地区土壤中一种链霉菌株发酵产物中分离出来的23环大环内酯类抗生素(红霉素族)，用于肝脏和肾脏移植后的免疫排斥，可由多种链霉菌产生。其免疫抑制疗效是环孢素A的10～100倍，但不良反应更小。其作用机制与环孢菌素相似，通过抑制钙调磷酸酶活性以减少由白介素-2产生的T-细胞介导的免疫反应，但其作用效果比环孢菌素强10～100倍。近年，FK506在免疫抑制剂市场的销售额已经占据全球20％以上。除此之外还用于特异性皮炎等自身免疫性疾病，保护神经以及神经再生等方面的治疗。他克莫司的化学合成效率低、成本高，因此考虑采用微生物发酵法制备。
FK506生物合成开始于4,5-二羟基-1-烯基环己烷羧酸(DHCHC)，经过10个聚酮链延伸循环，随后由哌可酸闭合23元环，内酯环进一步羟基甲基化。
由于他克莫司的重要医用价值，很多人尝试着用培养基优化的方法提高他克莫司的产量。Singh等研究了外源添加花生油、大豆油、棉籽油和氨基酸对于菌种Streptomycesspp.MA6858 B3178合成他克莫司的影响，外源添加30g/L大豆油和0.2g/L的赖氨酸，发酵5d时产量由85.8mg/L提高到103.1mg/L(Singh B P，Behera B K.Regulation of tacrolimusproduction by altering primary source of carbons and amino acids[J].Lettersin Applied Microbiology，2009，49(2):254－259)。Jung等通过逐渐提高培养基中他克莫司的浓度(600～1 600mg/L)来增加菌株对产物的耐受性，最终获得的菌株产量达到972mg/L(Jung S，Moon S，Lee K，et al.Strain development of Streptomyces sp.fortacrolimus production using sequential adaptation[J].Journal of IndustrialMicrobiology and Biotechnology，2009，36(12):1 467－1 471)。
目前，国内研究他克莫司主要围绕自然筛选，原始菌株诱变筛选，优化发酵培养基和发酵操作条件等。李玲等采用抑菌圈法初筛得到71株能抑制白色假丝酵母生长的菌株，高效液相色谱法检测代谢产物复筛，获得一株他克莫司产生菌株(李玲，陈林，杨文革，等.一株他克莫司产生菌的筛选及鉴定[J].食品与生物技术学报，2010，29(3):416－420)。
在某一特定酶催化的代谢物过程中，如果存在酶抑制剂，那么酶活性低的或者受酶抑制剂影响不能产他克莫司的微生物会出现低产或者不产产物的现象，只有那些酶活性高的微生物不受影响。筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)在合成他克莫司过程中，还伴随着副产物子囊霉素的产生。他克莫司插入的烯丙基丙二酰辅酶A被乙基丙二酰辅酶A替换时生成产物为子囊霉素，提高烯丙基丙二酰辅酶A的活性能够增加目标产物产量。
【发明内容】
本发明针对现有技术的不足，提供一种生物诱变育种方法提高他克莫司的产量。本发明先用亚硝基胍(NTG)诱变育种，再以活性物质韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A作为选择压，以达到他克莫司产量增加目的。
本发明解决其技术问题所采用了一种高产他克莫司的链霉菌株诱变制备方法，其特征在于，在用亚硝基胍(NTG)诱变链霉菌获得高产他克莫司菌株的条件下，分别以活性物质韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A作为选择压，再将两者共同作为选择压。
作为优选，所述的通过亚硝基胍(NTG)在诱变体系中的浓度为0.9mg/mL亚硝基胍，处理25min。
作为优选，所述的活性物质韧革菌素的浓度为6mg·L-1～30mg·L-1。
作为优选，所述的乙基丙二酰辅酶A的浓度为6mg·L-1～30mg·L-1。
作为优选，：所述活性物韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A协同作为选择压的比例为1：3～3：1。
所述高产他克莫司的链霉菌株诱变制备方法，诱变链霉菌和发酵培养的方法如下：
S1:斜面和分离琼脂培养基：在容器中加入麦芽浸出汁2％，酵母浸出汁0.5％，葡萄糖1％和琼脂1.5％混合，在灭菌前调节pH值为7.2；
S2:种子培养基:容器中加入甘油1.2％，可溶性淀粉1.1％，葡萄糖0.5％，酵母粉0.5％，玉米浆0.5％和碳酸钙0.1％，在灭菌前调节pH值为7；
S3:发酵培养基:容器中加入糊精4％，可溶性淀粉2％，干酵母粉1％，玉米浆1％，赖氨酸0.1％，磷酸氢二钾0.2％和碳酸钙0.05％混合，油酸甲酯0.01％，丙酸钠0.1％，灭菌前调节pH值为7；
S4:不同选择压的母液配制:韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A分别用生理盐水配成6mg/mL～12mg/mL的母液，然后用0.8mol/L氢氧化钠溶液把母液调中性,接着将中性母液进行无菌过滤，保存在6℃条件下备用；
S5:琼脂平板的制备:S4中的韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A母液分别用二倍稀释法进行稀释,加入熔化并冷却至60℃的S1制备的分离培养基中,充分混匀,制成琼脂平板。
S6:斜面培养基上的筑波链霉菌孢子用生理盐水洗并制成孢子悬液，采用0.9mg/mL NTG处理25min，用生理盐水进行系列稀释的稀释液涂布在S5制备的琼脂平板上，30℃培养8天，挑选发酵筛选后存活的高产菌株；
S7:将S6中挑选到的高产菌株的斜面孢子培养物洗下并制成106/mL的孢子悬液,，取适量稀释后的孢子悬液分别涂布含一定剂量韧革菌素或乙基丙二酰辅酶A溶液的分离琼脂平板上，在琼脂平板上，30℃培养8天；
S8：将S7中的斜面孢子用8mL的10％灭菌甘油水洗并制成悬浮液，在装有100mL种子培养基(500mL三角瓶)中接种0.2mL悬液，30℃、260r/min振荡培养3天；装有100mL发酵培养基(500mL三角瓶)用20％的种子量接入，30℃、260r/min振荡培养8天，获得含他克莫司的培养液。
本发明提高筑波链霉菌生产他克莫司的产量，制备筑波链霉菌高产他克莫司的菌株。高的脂肪酶活性是筑波链霉菌合成他克莫司过程的重要因子，活性物质韧革菌素对脂肪酶具有抑制作用，因此选择活性物质韧革菌素或者其他脂肪酶抑制剂作为选择压，筛选存活的脂肪酶高活性的高产菌株；他克莫司插入的烯丙基丙二酰辅酶A被乙基丙二酰辅酶A替换时生成产物为子囊霉素，烯丙基丙二酰辅酶A和乙基丙二酰辅酶A为竞争关系，选择乙基丙二酰辅酶A作为选择压，筛选出烯丙基丙二酰辅酶A竞争活性强的高产菌株。
本发明所涉及的方法操作简单、生产成本低，采用的选择压诱变育种，能显著提高合成他克莫司重要途径的脂肪酶活性以及合成他克莫司所需的烯丙基丙二酰辅酶A的竞争活性。韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A对筑波链霉菌协同作为选择压，经过亚硝基胍诱变明显获得高产他克莫司菌株。
具体实施方式：
下面结合具体实施例，对本发明作进一步的解释说明。应理解，这些实施例是本发明优选出的实施方案，仅用于具体说明。根据以上论述和这些实施例，本领域技术人员可确定本发明的必要特征，在不偏离于本发明的宗旨和技术范围内，可对本发明进行各种变化和修改，以使其适应各种用途和条件。
另外，各实施例中的“mg”为重量单位“毫克”；“min”为时间单位“分钟”；“mL”为体积单位“毫升”；“mg/mL”为浓度单位“毫克每毫升”；“r/min”为转速每分钟所旋转的圈；“μg/mL”为浓度单位“微克每毫升”。
实施例1
斜面培养基上的筑波链霉菌No.9993(S.tsukubaensis No.9993)孢子用生理盐水洗并制成孢子悬液，采用0.9mg/mL NTG处理25min，用生理盐水进行系列稀释的稀释液涂布在离琼脂平板上，30℃培养8天，挑选发酵筛选后存活的高产菌株；将高产菌株的斜面孢子培养物洗下，制成106/mL的孢子悬液,，取稀释液涂布含3mg/mL韧革菌素溶液的分离琼脂平板上，在琼脂平板上，30℃培养8天；斜面孢子用8mL的10％灭菌甘油水洗并制成悬浮液，在装有100mL种子培养基(500mL三角瓶)中接种0.2mL悬液，30℃、260r/min振荡培养3天。装有100mL发酵培养基(500mL三角瓶)用20％的种子量接入，30℃、260r/min振荡培养8天；
HPLC测定他克莫司含量，其中分析条件为：LC-10ATvp型高效液相色谱仪(岛津)，C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈:水:磷酸(600:400:1)；流速1mL/min；检测波长215nm；柱温60℃。
实施例2
选择韧革菌素为8mg/mL作为选择压，同上述实施例1操作步骤。
实施例3
选择革菌素浓度为12mg/mL作为选择压，同上述实施例1操作步骤。
实施例4
选择乙基丙二酰辅酶A浓度为5mg/mL作为选择压，其它同上述实施例1操作步骤。
实施例5
乙基丙二酰辅酶A浓度为10mg/mL作为选择压，其它同上述实施例1操作步骤。
实施例6
乙基丙二酰辅酶A浓度为15mg/mL作为选择压，其它同上述实施例1操作步骤。
实施例7
韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A协同作为选择压，二者比例为1：3，其它同上述实施例1操作步骤。
实施例8
韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A协同作为选择压，二者比例为1：1，其它同上述实施例1操作步骤。
实施例9
活性物质韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A协同作为选择压，二者比例为3：1，其它同上述实施例1操作步骤。
空白组1
筑波链霉菌斜面孢子用生理盐水洗，制成106/mL的孢子悬液,，取稀释液涂布分离琼脂平板上，在琼脂平板上，30℃培养8天；斜面孢子用8mL的10％灭菌甘油水洗并制成悬浮液，在装有100mL种子培养基(500mL三角瓶)中接种0.2mL悬液，30℃、260r/min振荡培养3天。装有100mL发酵培养基(500mL三角瓶)用20％的种子量接入，30℃、260r/min振荡培养8天；
Figure BDA0002421156330000081
由表可知，以活性物质韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A协同作为选择压制备的他克莫司产量比单一选择压的诱变育种产量明显高。以活性物质韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A协同作为选择压制备的筑波链霉菌具有烯丙基丙二酰辅酶A活性高和脂肪酶活性高的特性，这两者活性高能提高他克莫司产量，减少副产物生成，两者共同使用比单一选择压的诱变育种产量明显高。
以上所述仅为本发明的较佳实例，并不用以限制本发明，凡在本发明的原则之上所作的任何修改、替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.高产他克莫司的链霉菌株诱变制备方法，其特征在于，在用亚硝基胍(NTG)诱变链霉菌获得高产他克莫司菌株的条件下，分别以活性物质韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A作为选择压，再将两者共同作为选择压。
2.如权利要求1所述的高产他克莫司的链霉菌株诱变制备方法，其特征在于：所述的通过亚硝基胍(NTG)在诱变体系中的浓度为0.9mg/mL亚硝基胍，处理25min。
3.如权利要求1所述的高产他克莫司的链霉菌株诱变制备方法，其特征在于：所述的活性物质韧革菌素的浓度为6mg·L-1～30mg·L-1。
4.如权利要求1所述的高产他克莫司的链霉菌株诱变制备方法，其特征在于：所述的乙基丙二酰辅酶A的浓度为6mg·L-1～30mg·L-1。
5.如权利要求1所述的高产他克莫司的链霉菌株诱变制备，其特征在于：所述活性物韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A协同作为选择压的比例为1：3～3：1。
6.如权利要求1所述高产他克莫司的链霉菌株诱变制备方法，其特征在于，所述诱变链霉菌和发酵培养的方法如下：
S1:斜面和分离琼脂培养基：在容器中加入麦芽浸出汁2％，酵母浸出汁0.5％，葡萄糖1％和琼脂1.5％混合，在灭菌前调节pH值为7.2；
S2:种子培养基:容器中加入甘油1.2％，可溶性淀粉1.1％，葡萄糖0.5％，酵母粉0.5％，玉米浆0.5％和碳酸钙0.1％，在灭菌前调节pH值为7；
S3:发酵培养基:容器中加入糊精4％，可溶性淀粉2％，干酵母粉1％，玉米浆1％，赖氨酸0.1％，磷酸氢二钾0.2％和碳酸钙0.05％混合，油酸甲酯0.01％，丙酸钠0.1％，灭菌前调节pH值为7；
S4:不同选择压的母液配制:韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A分别用生理盐水配成6mg/mL～12mg/mL的母液，然后用0.8mol/L氢氧化钠溶液把母液调中性,接着将中性母液进行无菌过滤，保存在6℃条件下备用；
S5:琼脂平板的制备:S4中的韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A母液分别用二倍稀释法进行稀释,加入熔化并冷却至60℃的S1制备的分离培养基中,充分混匀,制成琼脂平板。
S6:斜面培养基上的筑波链霉菌孢子用生理盐水洗并制成孢子悬液，采用0.9mg/mLNTG处理25min，用生理盐水进行系列稀释的稀释液涂布在S5制备的琼脂平板上，30℃培养8天，挑选发酵筛选后存活的高产菌株；
S7:将S6中挑选到的高产菌株的斜面孢子培养物洗下并制成106/mL的孢子悬液,，取适量稀释后的孢子悬液分别涂布含一定剂量韧革菌素或乙基丙二酰辅酶A溶液的分离琼脂平板上，在琼脂平板上，30℃培养8天；
S8：将S7中的斜面孢子用8mL的10％灭菌甘油水洗并制成悬浮液，在装有100mL种子培养基(500mL三角瓶)中接种0.2mL悬液，30℃、260r/min振荡培养3天；装有100mL发酵培养基(500mL三角瓶)用20％的种子量接入，30℃、260r/min振荡培养8天，获得含他克莫司的培养液。
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