CN103255184A - 生产安丝菌素的发酵培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种包含铵离子和乙酸根或者包含乙酸铵的高效产生抗生素安丝菌素AP3的发酵新培养基，优选地，该发酵新培养基中乙酸铵的量为0.1-1.0w/v%。以及利用该发酵新培养基高效生产安丝菌素AP3的发酵生产的方法。

Description

生产安丝菌素的发酵培养基

技术领域

本发明涉及到一种改进的生产安丝菌素的发酵培养基，属于生物工程与技术领域。

背景技术

安丝菌素（Ansamitocin）是珍贵束丝放线菌（Actinosynnemapretiosum）产生的美登素类（Maytansinoid）抗肿瘤抗生素。其母核为19-C的大环内酰胺环（安莎类）或I型多聚酮类，C-3侧链连接有不同长度的碳链，主要成分为AP3，其侧链为异丁酰基（本说明书中用AP3代指安丝菌素P3）。AP3的分子量为635.2，分子式为C₃₂H₄₃ClN₂O₉，难溶于水（纯水中溶解度20mg/L，室温常压），易溶于甲醇、乙醇，丙酮，氯仿，乙腈等溶剂。AP3分之式见附图1。安丝菌素具有很强的真核细胞毒性和抗肿瘤活性，作用机理是覆盖微管的长春花碱结合点，从而阻止了微管的聚合。

无论临床前、临床研究还是最终药物生产，都需要足够的安丝菌素原料，因此大规模高产工艺也是研究的重点之一。目前报道的安丝菌素AP3最高产量是，使用的是基因突变株Actinosynnema pretiosumPF4-4（ATCC PTA-3921）在900L发酵罐规模中304mg/L，20mL/250-mL摇床中435mg/L（专利CN 101103120A，WO 03/064610A2）。对于常用的标准菌种Actinosynnema Pretiosum Ssp.Aurantium（ATCC 31565）,报道的最高产量是86mg/L，最大规模是1100L（CN 1432068A）；摇床阶段，标准菌种的400多例的摇瓶统计学效价为61±35mg/L，极大值最高不超过221mg/L（WO 03/064610A2）。

在中国，安丝菌素的发酵技术研究文献很少，主要是采用固体发酵（CN 101319241A，2008；CN 1490322A,2003，没有效价报道和效价低于40mg/L）。最近的文献是摇瓶液体发酵效价68mg/L（韩国配方）（JINXIA LIN，2010）。

对AP3发酵配方的研究，文献（CN 101103120A，2005；WO03/064610 A2，2003）列举了很多配方，其主要培养基组分是：糊精、麦芽糖、Proflo（棉籽粉）、大豆粉、玉米浆蛋白等，并公开部分突变株在各种配方中的AP3效价表现，但没有详述各组分的最佳浓度范围。韩国有几篇文献（BANDI等，2005，2006）公开了培养基配方组份筛选的研究过程。韩国2005年发表的论文中，作者先用Plackett-Burman法筛选因子，11个组分入选：葡萄糖、麦芽糖、糊精、蔗糖、酵母抽提物、豆饼粉、酸水解酪素、Polypeptone（多聚肽粉）、玉米浆、棉籽粉、豆胨。从中选出四个：蔗糖、糊精、多聚肽粉、酵母抽提物，经过2轮RSM CCD（响应曲面法中心组合设计）筛选出最佳浓度范围：4.5%蔗糖、4.5%糊精、0.16%多聚肽粉和0.86%酵母抽提物。摇瓶30mL/250mL使用ATCC 31565标准菌种的表达效价是45.2mg/L。韩国2006年发表的论文中，使用了突变改造的asm-菌种，用2轮RSMCCD筛选出最佳浓度范围：糊精6.0%、麦芽糖3.0%、棉籽粉0.53%和酵母抽提物0.45%。30mL/250mL摇瓶asm-菌种AP3效价最高点79.0mg/L。而韩国（Ychang,2004）在更早的时候还发表了会议论文，有显著影响的培养基成分是葡萄糖、酵母抽提物、麦芽抽提物、乳糖、KH₂PO₄和CaCO₃，没有报道实际的AP3效价。

总的来看，培养基的主要C源是糊精、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖；而主要N源则很多：棉籽粉、大豆粉、玉米浆、多聚肽粉、酵母抽提物。明显，C源成分比较稳定，而N源都是有机复合物，成分复杂，不同来源和批号的N源很难保持发酵原料质量的稳定。珍贵束丝放线菌也能代谢硝酸盐（USP 4356265,1982）和铵盐。专利（WO 03/064610A2，2003）中一个配方也含有(NH₄)₂SO₄0.05%w/v。然而，林锦霞等（JINXIA LIN，2010）研究了培养基中铵离子对AP3产率、关键酶活和转录活率的影响。其结论是铵离子能显著降低AP3效价，但对生物量、糖耗、异丁醇的消耗影响不大。

发明内容

本发明的目的是探索一种安丝菌素AP3高产、稳产的发酵培养基，其中包含简单氮源。具体是指含乙酸铵的培养基，此乙酸铵可在发酵的前中期加入。而单独的氨（铵根）对AP3起抑制作用，而单独使用其他乙酸盐不能显著提高产量，但是两者结合却能显著提高AP3效价。本发明的基础培养基经过优化后，平均效价能达到100到220mg/L，显著高于现有技术采用标准菌种发酵所能达到的效价（86mg/L）。

本发明的第一方面提供一种生产安丝菌素的发酵培养基，所述培养基包含铵根离子和乙酸根离子。

在一个实施方案中，所述培养基包含乙酸铵。在一个优选实施方案中，所述培养基包含0.35w/v%的乙酸铵。

在一个实施方案中，所述培养基包含硫酸铵和乙酸钠。在一个优选实施方案中，所述培养基包含0.22w/v%的硫酸铵和0.07w/v%的乙酸钠。

在一个实施方案中，所述培养基还包含以下组分：麦芽糊精、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、玉米蛋白、CaCO₃、NaOH、K₂HPO₄.3H₂O和异丁醇，其中异丁醇在接种之前加入。在一个优选实施方案中，麦芽糊精的量为0.1-1.5w/w%、可溶性淀粉的量为0.1-1.0w/w%、蔗糖的量为0.1-1.0w/w%、葡萄糖的量为0.1-1.5w/w%、麦芽糖的量为0.5-10.0w/w%、玉米蛋白的量为0.5-10.0w/w%、CaCO₃的量为0.1-1.0w/w%、NaOH的量为0.01-0.4w/w%、K₂HPO₄·3H₂O的量为0.01-0.4w/w%，异丁醇的量为0.01-0.60v/v%。

本发明的第二方面提一种生产安丝菌素的方法，其特征在于，包含以下步骤：

1）挑取标准菌种Actinosynnema Pretiosum Ssp.Aaurantium（ATCC 31565）的平板种子培养为种子液；

2）将种子液在包含本发明第一方面培养基的发酵罐中培养；

3）收获发酵液；

4）纯化、精制得到安丝菌素。

在一个实施方案中，使用的菌种为标准菌种ActinosynnemaPretiosum Ssp.Aaurantium（ATCC 31565）。

以下实例仅是列举典型情况，同领域的专家应能扩展和延伸其发酵条件。

附图说明

图1安丝菌素的分子结构。

图2显示的是摇瓶中各种铵盐和乙酸盐各自单独添加对AP3发酵效价的影响。

图3显示的是5-L发酵的AP3生产曲线。

图4显示的是10-L发酵的AP3生产曲线。

图5是AP3参照品的三波长HPLC图谱。这也是最后纯化、精制的AP3纯品。

图6是10-L发酵收获的发酵液HPLC图谱。

具体实施方式

本发明使用的菌株是标准菌种Actinosynnema PretiosumSsp.Aurantium（ATCC 31565）。菌株用甘油冻存管-20℃保存。使用3级菌种库保存，保存方法参见文献（SENCHI TANIDA,1980）。

菌种复苏和扩增使用的是种子培养基（BANDI等，2005，2006），见表1。种子培养是摇瓶接种后培养2-3天，转接。培养条件同摇瓶发酵条件。

表1.种子培养VT肉汤培养基

序号	名称	%w/w
			1	酵母抽提(OXOID)	0.3
2	麦芽抽提(OXOID)	0.3
			3	蛋白胨（OXOID)	0.5
4	甘油（AR级）	1.0
			5	消前pH	6.8±0.2
序号	名称	%w/w
			6	分装	30g/100mL或100g/500mL

7

灭菌条件

121℃30min

如果不特别说明，发酵的默认的条件是：发酵摇瓶使用100mL摇瓶，装液量30g。接种量每瓶3mL。培养条件是：28℃,液体培养基220rpm震荡培养10天后收获。发酵的基础培养基配方见表2。

本发明的培养基就是在表2基础培养基中，消前加入乙酸铵。此乙酸铵不仅仅指直接加入乙酸铵，也是指含乙酸根的盐与含铵根的盐联合加入。

发酵收获前灭活，采用巴氏消毒法，调pH6.5-7.5，55℃加热1小时。

表2发酵培养基的基础培养基配方

序号	名称	%w/w
			1	麦芽糊精	0.40
2	可溶性淀粉	0.20
			3	蔗糖	0.50
4	葡萄糖	0.50
			5	麦芽糖	3.00
6	玉米蛋白	2.50
			7	CaCO3	0.50
8	NaOH	0.12
			9	K2HPO4·3H2O	0.10
10	消前pH	7.4±0.2
			11	分装	30g/100-mL
12	灭菌条件	121℃30min

注：消前加入乙酸铵（含乙酸根的盐与含铵根的盐），接种前加入适量异丁醇

发酵效价的测定采用HPLC法：取发酵液2.5mL或者5mL，加入95%乙醇到体积10mL，混合，震荡10min后，水平转子8000rpm离心5min，取上清，用0.45um滤膜过滤后，进行HPLC分析。HPLC采用反相C18柱，5um，250×4.6mm，前置过滤柱。流动相采用含0.1%TFA的乙腈(ACN):水。洗脱速度1mL/min，分析波长252nm。进样20uL。针对不同的目的和要求，HPLC洗脱方法有2种。其一线形法，为了质量研究，线性洗脱20min，ACN浓度从5%到95%，在此分析条件下，AP3的保留时间在17min附近，分析1个样品要1小时，参见附图5；其二等梯度法，方便快速检测，ACN恒定70%，AP3的保留时间在4.4min附近，每样分析时间6min，参见附图6。所有方法都采用外标法定量，AP3在浓度范围10mg/L到250mg/L之间与HPLC峰面积呈线性关系，稀释液都采用95%v/v乙醇，参照品采用3次层析并脱盐的、冻干3天以上的AP3纯品（HPLC纯度98%以上，参见附图5）。

发酵检测的其他参数：pH值，采用台式pH计测定；PCV，压缩的细胞体积比，是指发酵液经过水平转子8000rpm离心5min后，沉淀所占体积的百分比。

实施例

现在用有限的实施例对本发明进行具体的说明。

实施例1：各种铵盐和乙酸盐对AP3发酵效价的影响

在表2的基础培养基中加入各种铵盐和乙酸盐，并加入0.33%v/v的异丁醇，100mL摇瓶发酵培养10天，结果数据图请见附图2。在0.05%到0.35%w/v的浓度范围内，乙酸铵在0.35%w/v附近，AP3的发酵效价有个极大值320±47mg/L；而硫酸铵、氯化铵、柠檬酸铵、硝酸铵、碳酸氢铵、硝酸钠、硝酸钾各试剂单独加入培养基中，AP3的发酵效价随浓度提高而下降，其中硝酸盐强烈抑制发酵产物AP3的生产。乙酸钠、乙酸钾在此浓度范围内对AP3发酵效价没有影响。

实施例2：乙酸铵和异丁醇浓度对AP3发酵效价的影响

按两因素的响应曲面RSM CCD试验设计原理，在表2的发酵基础培养基中加入表3所列的添加物。100-mL摇瓶发酵培养10天，数据处理总揽见表4，获得的经验公式见公式1。

表3.乙酸铵、麦芽糊精、异丁醇和缬氨酸的4因素RSM CCD设计表

注：中心点重复21次，其他点重复3次。

表4.乙酸铵、麦芽糊精、异丁醇和缬氨酸的4因素RSM CCD误差分析表

注：收获时候有4瓶靠近风口，挥发量大，虽然初测AP3效价达605mg/L，也只能舍去。

公式1：从乙酸铵、麦芽糊精、异丁醇和缬氨酸的4因素RSM CCD获得的经验公式为:

从结果分析，在实验的浓度范围内，乙酸铵和异丁醇起主要作用。其中，乙酸铵的最佳浓度在0.27%w/w附近。各试验组合至少重复3次，中心点重复21次。结果中有6瓶人为因素被排除。最后，AP3效价范围的平均值和标准差是264.6和58.15mg/L。

实施例3：硫酸铵和乙酸钠浓度对AP3发酵效价的影响

按两因素的响应曲面RSM CCD试验设计原理，在表2的发酵基础培养基中加入表5所列的添加物。100-mL摇瓶发酵培养10天，数据处理总揽见表6，获得的经验公式见公式2。

表5.硫酸铵、乙酸钠的2因素RSM CCD设计表

因子

名称

单位

类型

低真实值

高真实值

低编号

高编号

A

乙酸钠

%w/w

数值

0.1

0.3

-1

1

B

硫酸铵

%w/w

数值

0.1

0.3

-1

1

注：Alpha=1.414，中心点试验点10个，非中心点16个。

公式2：从硫酸铵、乙酸钠的2因素RSM CCD获得的经验公式为：

表6.硫酸铵、乙酸钠的2因素RSM CCD试验的误差分析表：

注：AP3效价的范围是150到245mg/L，平均值和标准差分别是200.8和16.7mg/L。

从附图3可看出，最佳的因素条件是硫酸铵0.22%w/v，乙酸钠0.07%w/v。

实施例4：5L发酵的AP3生产

种子培养：甘油保存管的种子1.8mL一支，接种于表1中的VT肉汤培养基100mL/500mL瓶，28℃，230rpm振荡培养2天后，再平分种子到VT肉汤培养基100mL/500mL瓶，28℃，230rpm振荡培养5天后，合并种子液，HPLC分析，AP3的效价为22.4mg/L。

使用NBS BioFlo 3000的6.6L发酵罐，按配表2中的发酵配方配制培养基4.7L，其中含乙酸铵0.30%w/v，121℃灭菌40分钟，冷却到28℃后，加0.33%v/v的异丁醇，接以上VT种子培养物300mL。培养条件：28℃，控制转速在100到400rpm，通气1到4SLPM，使溶氧浓度恒定在DO 20-60%进行发酵。从第3天开始补料，共补400mL。8天结束培养，55℃灭活后，收获5.2L发酵液，HPLC得发酵的最终效价172mg/L。发酵的pH、生物量PCV和AP3效价变化曲线见附图3。

实施例5：10L发酵的AP3生产

种子培养：平板种子接种于表1中的VT肉汤培养基30mL/100mL，28℃，300rpm振荡培养2天后，再平分种子到VT/FM各一半的肉汤培养基100mL/500mL，28℃，300rpm振荡培养5天后，再接种到含FM培养基100mL/500mL的摇瓶中。28℃，300rpm振荡培养5天。合并种子液得300mL，HPLC分析，AP3的效价为10.4mg/L。

使用NBS BioFlo 3000的14L发酵罐，按表2中的发酵配方配制培养基9.7L，其中含乙酸铵0.30%w/v，121℃灭菌40分钟，冷却到28℃后，加0.33%v/v的异丁醇，接以上VT种子培养物300mL。培养条件：28℃，控制转速在100到500rpm，通气1到5.4SLPM（最大读数），溶氧浓度维持在10-70%。从第3天开始补料，第8天时，共补400mL。HPLC检测此时发酵的效价为196mg/L。收获时AP3发酵效价716.3mg/L（此为收获时效价，高于发酵第8天的效价，背景技术中指出的现有技术的效价是指发酵第8天的效价）。发酵的pH、生物量PCV和AP3效价变化曲线见附图4。

参考文献

1.Higashide,E.,M.Asai,K.Ootsu,S.Tanida,Y.Kozai,T.Hasegawa,T.Kishi,Y.Sugino,and M.Yoneda.1977.Ansamitocin,a group of novelmaytansinoid antibiotics with antitumour properties from Nocardia.Nature(London)270:721-722.

2.Naoto Hashimoto et al.Method for the production of maytansinoids.US Patent 4,137,230,1979.

3.E Higashide,M Asai....Method for producing Antibiotic C-15003 byculturing nocardia.US Patent 4,162,940,1979.

4.S TANIDA,T HASEGAWA,K HATANO.Ansamitocins,Maytansinoid antitumor antibiotics producing organism,fermentation,and antimicrobial activities.Antibiot(Tokyo).1980 Feb;33(2):192-8.

5.Izawa M,Tanida S,Asai M.Ansamitocin analogs from a mutantstrain of Nocardia.II.Isolation and structure.J Antibiot(Tokyo).1981May;34(5):496-506.

6.Osamu Miyashita,Osaka;Hiroshi Akimoto,Nishinomiya.MAYTANSINOIDS.United States Patent Miyashita et al.[45]4,309,428 Jan.5,1982.

7.J CHUNG.Mutant Actinosynnema pretiosum strain with increasedmaytansinoid production.US Patent App.10/057,561,2002.US Patent7,192,750,2007.WO Patent WO/2003/064,610,2003.

8.JM Cassady,KK Chan,HG Floss.Recent developments in themaytansinoid antitumor agents.Chem Pharm Bull (Tokyo).2004Jan;52(1):1-26.

9.鲁春华;沈月毛;郝小江;甘烦远;赵沛基.安丝菌素苷类化合物及其药物组合物,其制备方法及其应用.中国发明专利,申请号:03135603.6.2006年11月.

10.辛西亚·郭,格雷厄姆·S·宾,韦恩·C·威德森.用于制备安丝菌素的方法.中国发明专利公开号:101103120.专利申请日2005-12-12.METHODS FOR THE PRODUCTION OFANSAMITOCINS.US20050170475A1.

11.钟建江,林锦霞,安丝菌素的固体发酵方法,中国专利申请号200810040688.0申请日2008-12-10.

12.Bandi,S.,Y.J.Kim,S.O.Sa,and Y.-K.Chang.2005.Statisticalapproach to development of culture medium for ansamitocin P-3production with Actinosynnema pretiosum ATCC 31565.J.Microbiol.Biotechnol.15:930-937.

13.蒋世春,许玉丽,白骅.一种制备蒽莎姆菌素的方法.申请号CN200610150763.X.申请日:2007-5-2.

14.马克·富尔斯顿,安娜·斯特范斯卡,简·瑟克特，柄型菌素的生产方法.申请号/专利号:01810371申请日:2001-04-10.

15.Bandi Srinivasulu,Yoonjung Kim,Yongkeun Chang,et al.Construction of asm2 Deletion Mutant of Actinosynnema pretiosum andMedium Optimization for Ansamitocin P-3 Production Using StatisticalApproach[J].J Microbiol Biotechnol,2006,16(9):1338-1346.

16.Jinxia Lin,Linquan Bai,Zixin Deng and Jian-Jiang Zhong.Effect ofammonium in medium on ansamitocin P-3 production by Actinosynnemapretiosum.Biotechnology and Bioprocess Engineering Volume 15,Number 1,119-125，2010.

17.El-Tayeb,O.M.,Hussein,M.M.M.,Salama,A.A.and El-Sedawy,H.F.Optimization of industrial production of rifamycin B byAmycolatopsis mediterranei.II.The role of gene amplification andphysiological factors in productivity in shake flasks。African Journal ofBiotechnology Vol.3(5),pp.273-280,May 2004.

18.Yu T W,Bai L,Clade D,et al.The biosynthetic gene cluster of themaytansinoid antitumor agent ansamitocin from Actinosynnemapretiosum[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(12):7968~7973.

19.Floss,Heinz G.Yu,Tin-wein,Leistner,Eckhard.United StatesPatent Application 20060084141.

20.A.Kirschning et al.,The chemistry and biology of the maytansinoidantitumor agents，C.R.Chimie 11(2008)1523-1543.

Claims (9)

1.一种生产安丝菌素的发酵培养基，其特征在于，所述培养基包含铵离子和乙酸根。

2.权利要求1的培养基，其特征在于，所述培养基包含乙酸铵。

3.权利要求1或2的培养基，其特征在于，所述培养基包含0.1-1.0w/v%的乙酸铵。

4.权利要求1的培养基，其特征在于，所述培养基包含硫酸铵和乙酸钠。

5.权利要求4的培养基，其特征在于，所述培养基包含0.1-1.0w/v%的硫酸铵和0.1-1.0w/v%的乙酸钠。

6.权利要求1-5任一项的培养基，其特征在于，所述培养基还包含以下组分：麦芽糊精、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、玉米蛋白、CaCO₃、NaOH、K₂HPO₄.3H₂O和异丁醇，其中异丁醇在接种之前加入。

7.权利要求6的培养基，其特征在于，麦芽糊精的量为0.1-1.5w/w%、可溶性淀粉的量为0.1-1.0w/w%、蔗糖的量为0.1-1.0w/w%、葡萄糖的量为0.1-1.5w/w%、麦芽糖的量为0.5-10.0w/w%、玉米蛋白的量为0.5-10.0w/w%、CaCO3的量为0.1-1.0w/w%、NaOH的量为0.01-0.4w/w%、K₂HPO₄.3H₂O的量为0.01-0.4w/w%，异丁醇的量为0.01-0.60v/v%。

8.一种生产安丝菌素的方法，其特征在于，包含以下步骤：

1）将发酵菌种培养为种子液；

2）将种子液接种于包含权利要求1-6任一项的培养基的发酵罐中培养；

3）收获发酵液；

4）纯化、精制得到安丝菌素。

9.权利要求8的方法，其特征在于，使用的发酵菌种为标准菌种Actnosynnema Pretiosum Ssp.Aurantium（ATCC 31565）。

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