CN101103120A - 用于制备安丝菌素的方法 - Google Patents
用于制备安丝菌素的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101103120A CN101103120A CNA2005800468716A CN200580046871A CN101103120A CN 101103120 A CN101103120 A CN 101103120A CN A2005800468716 A CNA2005800468716 A CN A2005800468716A CN 200580046871 A CN200580046871 A CN 200580046871A CN 101103120 A CN101103120 A CN 101103120A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ansamitocin
- technology
- water
- fermentation culture
- crystallization
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 4
- PVNFMCBFDPTNQI-UIBOPQHZSA-N [(1S,2R,5S,6S,16E,18E,20R,21S)-11-chloro-21-hydroxy-12,20-dimethoxy-2,5,9,16-tetramethyl-8,23-dioxo-4,24-dioxa-9,22-diazatetracyclo[19.3.1.110,14.03,5]hexacosa-10,12,14(26),16,18-pentaen-6-yl] acetate [(1S,2R,5S,6S,16E,18E,20R,21S)-11-chloro-21-hydroxy-12,20-dimethoxy-2,5,9,16-tetramethyl-8,23-dioxo-4,24-dioxa-9,22-diazatetracyclo[19.3.1.110,14.03,5]hexacosa-10,12,14(26),16,18-pentaen-6-yl] 3-methylbutanoate [(1S,2R,5S,6S,16E,18E,20R,21S)-11-chloro-21-hydroxy-12,20-dimethoxy-2,5,9,16-tetramethyl-8,23-dioxo-4,24-dioxa-9,22-diazatetracyclo[19.3.1.110,14.03,5]hexacosa-10,12,14(26),16,18-pentaen-6-yl] 2-methylpropanoate [(1S,2R,5S,6S,16E,18E,20R,21S)-11-chloro-21-hydroxy-12,20-dimethoxy-2,5,9,16-tetramethyl-8,23-dioxo-4,24-dioxa-9,22-diazatetracyclo[19.3.1.110,14.03,5]hexacosa-10,12,14(26),16,18-pentaen-6-yl] propanoate Chemical compound CO[C@@H]1\C=C\C=C(C)\Cc2cc(OC)c(Cl)c(c2)N(C)C(=O)C[C@H](OC(C)=O)[C@]2(C)OC2[C@H](C)[C@@H]2C[C@@]1(O)NC(=O)O2.CCC(=O)O[C@H]1CC(=O)N(C)c2cc(C\C(C)=C\C=C\[C@@H](OC)[C@@]3(O)C[C@H](OC(=O)N3)[C@@H](C)C3O[C@@]13C)cc(OC)c2Cl.CO[C@@H]1\C=C\C=C(C)\Cc2cc(OC)c(Cl)c(c2)N(C)C(=O)C[C@H](OC(=O)C(C)C)[C@]2(C)OC2[C@H](C)[C@@H]2C[C@@]1(O)NC(=O)O2.CO[C@@H]1\C=C\C=C(C)\Cc2cc(OC)c(Cl)c(c2)N(C)C(=O)C[C@H](OC(=O)CC(C)C)[C@]2(C)OC2[C@H](C)[C@@H]2C[C@@]1(O)NC(=O)O2 PVNFMCBFDPTNQI-UIBOPQHZSA-N 0.000 claims abstract description 217
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 81
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 81
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 114
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 50
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 46
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 44
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 42
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 42
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 39
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 39
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 37
- 239000003849 aromatic solvent Substances 0.000 claims description 35
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 claims description 34
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 34
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 33
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N butyl acetate Chemical compound CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 24
- 241000108463 Hygrophila <snail> Species 0.000 claims description 21
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 21
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 21
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 21
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 20
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 claims description 19
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 18
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 18
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 claims description 18
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 16
- -1 tretolite Chemical compound 0.000 claims description 14
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N Propionic aldehyde Chemical compound CCC=O NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 11
- 150000002148 esters Chemical group 0.000 claims description 11
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical group ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 10
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 230000003311 flocculating effect Effects 0.000 claims description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 8
- AMIMRNSIRUDHCM-UHFFFAOYSA-N Isopropylaldehyde Chemical compound CC(C)C=O AMIMRNSIRUDHCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 claims description 8
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 claims description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 7
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 7
- ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N isobutanol Chemical compound CC(C)CO ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims description 7
- YGHRJJRRZDOVPD-UHFFFAOYSA-N 3-methylbutanal Chemical compound CC(C)CC=O YGHRJJRRZDOVPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical group CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims description 6
- 239000011260 aqueous acid Substances 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 229940043265 methyl isobutyl ketone Drugs 0.000 claims description 6
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 claims description 6
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 6
- 238000002679 ablation Methods 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 5
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 claims description 4
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 claims description 4
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 claims description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N N-Pentanol Chemical compound CCCCCO AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N acetic acid trimethyl ester Natural products COC(C)=O KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 3
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 claims description 3
- HGBOYTHUEUWSSQ-UHFFFAOYSA-N pentanal Chemical compound CCCCC=O HGBOYTHUEUWSSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 3
- 241000123663 Actinosynnema Species 0.000 claims description 2
- 241000143227 Actinosynnema pretiosum Species 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 2
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910021485 fumed silica Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims 3
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 claims 3
- 238000010926 purge Methods 0.000 claims 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical group OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 7
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 7
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 6
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- OPQNCARIZFLNLF-UHFFFAOYSA-N ansamitocin P-3 Natural products CN1C(=O)CC(OC(=O)C(C)C)C2(C)OC2C(C)C(OC(=O)N2)CC2(O)C(OC)C=CC=C(C)CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 OPQNCARIZFLNLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OPQNCARIZFLNLF-JBHFWYGFSA-N ansamitocin P3 Chemical compound CO[C@@H]([C@@]1(O)C[C@H](OC(=O)N1)[C@@H](C)[C@@H]1O[C@@]1(C)[C@@H](OC(=O)C(C)C)CC(=O)N1C)\C=C\C=C(C)\CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 OPQNCARIZFLNLF-JBHFWYGFSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002635 aromatic organic solvent Substances 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940093916 potassium phosphate Drugs 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000003021 water soluble solvent Substances 0.000 description 2
- QWPXBEHQFHACTK-KZVYIGENSA-N (10e,12e)-86-chloro-12,14,4-trihydroxy-85,14-dimethoxy-33,2,7,10-tetramethyl-15,16-dihydro-14h-7-aza-1(6,4)-oxazina-3(2,3)-oxirana-8(1,3)-benzenacyclotetradecaphane-10,12-dien-6-one Chemical compound CN1C(=O)CC(O)C2(C)OC2C(C)C(OC(=O)N2)CC2(O)C(OC)\C=C\C=C(C)\CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 QWPXBEHQFHACTK-KZVYIGENSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LCPVQAHEFVXVKT-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-difluorophenoxy)pyridin-3-amine Chemical compound NC1=CC=CN=C1OC1=CC=C(F)C=C1F LCPVQAHEFVXVKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100313763 Arabidopsis thaliana TIM22-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 244000024675 Eruca sativa Species 0.000 description 1
- 235000014755 Eruca sativa Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- QWPXBEHQFHACTK-UHFFFAOYSA-N Maytansinol Natural products CN1C(=O)CC(O)C2(C)OC2C(C)C(OC(=O)N2)CC2(O)C(OC)C=CC=C(C)CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 QWPXBEHQFHACTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100412856 Mus musculus Rhod gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021536 Zeolite Inorganic materials 0.000 description 1
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229940043232 butyl acetate Drugs 0.000 description 1
- 125000004063 butyryl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 description 1
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006298 dechlorination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006837 decompression Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound [Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000011552 falling film Substances 0.000 description 1
- 239000010408 film Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 1
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 1
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-M hexanoate Chemical compound CCCCCC([O-])=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N isobutyric acid Chemical compound CC(C)C(O)=O KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 235000012204 lemonade/lime carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 239000012454 non-polar solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 238000000247 postprecipitation Methods 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 125000001501 propionyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 239000012487 rinsing solution Substances 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- CHQMHPLRPQMAMX-UHFFFAOYSA-L sodium persulfate Substances [Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O CHQMHPLRPQMAMX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960003339 sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000006104 solid solution Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000007669 thermal treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
- 125000003774 valeryl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000010457 zeolite Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
一种大规模发酵高产安丝菌素的菌株的工艺。一种用于分离粗安丝菌素的方法。一种用于纯化安丝菌素的方法。
Description
技术领域
[01]
本发明涉及用于制备安丝菌素的工艺。安丝菌素是指具有不同的C-3酯侧链的安丝菌素的混合物。安丝菌素能转变成C-3美登木醇(maytansinol)。
背景技术
[02]
安丝菌素是微生物比如珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)发酵产生的高细胞毒性的化合物。安丝菌素已被化学转变成含硫醇的美登木素生物碱(maytansinoids)，该生物碱以细胞结合剂-美登木素生物碱偶联物的形式体现出的医疗用途已经被报道(美国专利Nos.5,208,020、5,416,064、6,333,410、以及6,441,163)。
[03]
用束丝放线菌(Actinosynnema spp)菌株如珍贵橙色束丝放线菌的发酵工艺制备多个在C-3处具有不同的酯取代基的安丝菌素品种(图1)。制备的各种C-3酯包括P-3(异丁酰)、P-3’(正丁酰)、P-2(丙酰)、P-4(异戊酰)、P-4’(正戊酰)。所有这些酯均可以被还原分解成C-3美登木醇(P-0)，该醇是用于合成含硫醇美登木素生物碱的前体。此外，还生成了少量的不希望有的安丝菌素，该安丝菌素在其他位置例如N-脱甲基、20-O-脱甲基以及19-脱氯处被修饰。在还原性脱酰作用下，这些安丝菌素不生成美登木醇。
[04]
通过发酵束丝放线菌制备安丝菌素的工艺已经被报道(美国专利Nos.4,162,940、4,450,234、4,228,239、4,331,598以及4,356,265)。安丝菌素的产量一般在12mg/L～100mg/L范围内随滴度而变化。典型地，通过多步骤工艺来回收并提纯安丝菌素，该工艺包括向整个发酵培养液中添加助滤剂和有机溶剂，接着用石油醚浓缩有机层和沉淀物。用硅层析和析晶进一步提纯沉淀物，接着通过重结晶或层析进一步纯化。
[05]
因此，该工艺是繁琐的，并且包括多个其中剧毒材料必须被处理的步骤。于是，采用这种工艺进行大规模生产非常困难。此外，在各个工艺步骤中还必须确保操作人员的安全。
[06]
最近的申请(US 2002/0015984 A1)要求保护用于安丝菌素制备工艺中的改进技术。据报道，在发酵培养液中的安丝菌素的滴度是65～86mg/L。要求保护的改进技术包括使培养液在75℃下热灭活、萃取到芳香烃溶剂比如甲苯中、通过开口硅柱层析、以及析晶。为降低制备安丝菌素的成本，已经培养了新的束丝放线菌菌株，其比先前描述的那些菌株具有显著提高的滴度(在发酵器中高达400mg/L)。先前描述的用于制备安丝菌素的工艺有几个缺点，从而不适用于新开发的高产菌株。例如，培养液在75℃下热灭活导致安丝菌素发生部分降解，从而损失10％～20％的产量。用芳香烃萃取包含较高含量安丝菌素的发酵培养液效率低且不完全，这是因为安丝菌素在这种溶剂中的溶解度不高。在开口的自填充硅柱(self-packed silicacolumn)上纯化安丝菌素有两个缺点：1)在纯化和回收中的批次变化，以及2)较高的人员暴露风险所产生的安全问题。因此，目前需要高产量地制备安丝菌素，并提供一种用于高效率分离和纯化安丝菌素的工艺，同时最小化工人暴露于高毒性药物的几率。
发明内容
[07]
本发明的目的之一是提供一种用于大规模发酵产安丝菌素的微生物的工艺，该工艺尤其适用于新的能高产安丝菌素的菌株。
[08]
本发明的另一目的是提供一种用于分离粗安丝菌素和用于制备精制安丝菌素的方法，包括如下步骤：
1)任选的使培养液失活，例如将培养液加热到约50～55℃或添加1％体积的氯仿，2)用非芳香族有机溶剂萃取，3)浓缩萃取物，4)在硅柱或氧化铝柱上，优选在预填充硅筒柱柱(pre-packed silica cartridge column)上纯化浓缩物，以及5)产物的析晶。
[09]
本发明的其他目的包括如下内容：
一种用于制备精制安丝菌素的工艺，其包括如下步骤：
1)在液体培养基中培养产安丝菌素的微生物；
2)用不相溶于水的非芳香族溶剂从培养基中萃取安丝菌素；
3)浓缩萃取的安丝菌素；以及
4)通过a)、b)、c)和d)中的任何一个来纯化安丝菌素：
a)在硅胶或氧化铝上吸附层析，
b)析晶，
c)先在硅胶或氧化铝上吸附层析，然后析晶，以及
d)先析晶，然后在硅胶或氧化铝上吸附层析。
[10]
一种用于制备精制安丝菌素的工艺，其包括如下步骤：
1)在液体培养基中培养产安丝菌素的微生物；
2)用不相溶于水的非芳香族溶剂从培养基中萃取安丝菌素；
3)浓缩萃取的安丝菌素；以及
4)通过a)、b)、c)和d)中的任何一个来纯化安丝菌素：
a)在硅胶或氧化铝上吸附层析，
b)析晶，
c)先在硅胶或氧化铝上吸附层析，然后析晶，以及
d)先析晶，然后在硅胶或氧化铝上吸附层析。
[11]
一种用于制备精制安丝菌素的工艺，其包括如下步骤：
1)在液体培养基中培养产安丝菌素的微生物；
2)用不相溶于水的非芳香族溶剂从培养基中萃取安丝菌素；
3)浓缩萃取的安丝菌素；以及
4)通过先在硅胶或氧化铝上吸附层析，然后析晶来纯化安丝菌素。
[12]
一种用于制备精制安丝菌素的工艺，其包括如下步骤：
1)在液体培养基中培养产安丝菌素的微生物；
2)用不相溶于水的非芳香族溶剂从培养基中萃取安丝菌素；
3)过滤以除去固体，从而允许有机相分离；
4)从有机相中浓缩安丝菌素；以及
5)通过a)、b)、c)和d)中的任何一个来纯化安丝菌素：
a)在硅胶或氧化铝上吸附层析，
b)析晶，
c)先在硅胶或氧化铝上吸附层析，然后析晶，以及
d)先析晶，然后在硅胶或氧化铝上吸附层析。
[13]
一种用于制备精制安丝菌素的工艺，其包括如下步骤：
1)在液体培养基中培养产安丝菌素的微生物；
2)采用各种离心技术，用不相溶于水的非芳香族溶剂从培养基中萃取安丝菌素；
3)浓缩萃取的安丝菌素；以及
4)通过a)、b)、c)和d)中的任何一个来纯化安丝菌素：
a)在硅胶或氧化铝上吸附层析，
b)析晶，
c)先在硅胶或氧化铝上吸附层析，然后析晶，以及
d)先析晶，然后在硅胶或氧化铝上吸附层析。
[14]
一种用于制备精制安丝菌素的工艺，其包括如下步骤：
1)在液体培养基中产制备安丝菌素的微生物；
2)在有一种或多种水溶性有机溶剂存在的情况下，将培养液离心以除去固体，同时在溶液中保留安丝菌素。
3)添加不相溶于水的非芳香族溶剂，从而允许将安丝菌素萃取至有机层中。在萃取过程中，还可以视需要任选地向有机相中添加各种盐或其他组分。
4)浓缩萃取的安丝菌素；以及
5)通过a)、b)、c)和d)中的任何一个来纯化安丝菌素：
a)在硅胶或氧化铝上吸附层析，
b)析晶，
c)先在硅胶或氧化铝上吸附层析，然后析晶，以及
d)先析晶，然后在硅胶或氧化铝上吸附层析。
[15]
一种用于制备精制安丝菌素的工艺，其包括如下步骤：
1)在液体培养基中培养产安丝菌素的微生物；
2)任选地处理培养基以促进安丝菌素的萃取；
3)从培养基中将安丝菌素固相萃取到树脂上；
4)使用一种或多种有机溶剂，或者使用一种或多种含水的有机溶剂，从树脂中等度洗脱或梯度洗脱安丝菌素；
5)浓缩萃取的安丝菌素；以及
6)任选地通过a)、b)、c)和d)中的任何一个来进一步纯化安丝菌素：
a)在硅胶或氧化铝上吸附层析，
b)析晶，
c)先在硅胶或氧化铝上吸附层析，然后析晶，以及
d)先析晶，然后在硅胶或氧化铝上吸附层析。
[16]
在这些实施方式中，本发明可以任选地包括如下步骤：
(i)化学灭活或热灭活发酵培养液中的微生物；
(ii)在步骤2之前，处理培养基以促进溶剂萃取安丝菌素；或者
(iii)在沉淀前或沉淀后，进行洗涤步骤，其中用水、盐的水溶液、酸水溶液或碱水溶液以任何顺序组合方式洗涤有机溶剂中的粗安丝菌素溶液。该步骤可以在各个纯化阶段中进行。
[17]
一种用于从发酵培养液中萃取安丝菌素的工艺，所述工艺包括：
1)任选地使发酵培养液中产安丝菌素的微生物失活；以及
2)用不相溶于水的非芳香族溶剂从发酵培养液中萃取安丝菌素。
[18]
上述工艺还可以包括，在步骤2之前处理培养基以促进溶剂萃取安丝菌素。
[19]
一种用于从发酵培养液中萃取安丝菌素的工艺，所述工艺包括：
1)用不相溶于水的非芳香族溶剂从发酵培养液中萃取安丝菌素，以及
2)过滤以除去固体，允许有机相分离。
上述工艺可以任选地包括：
(i)化学灭活或热灭活发酵培养液中的微生物；和/或
(ii)在步骤2之前，处理培养基以促进溶剂萃取安丝菌素。
[20]
一种用于从发酵培养液中萃取安丝菌素的工艺，所述工艺包括：通过各种离心技术，用不相溶于水的非芳香族溶剂从培养基中萃取安丝菌素。
[21]
上述工艺可以任选地包括：
(i)化学灭活或热灭活发酵培养液中的微生物；和/或
(ii)在离心之前或在离心期间，处理培养基以促进溶剂萃取安丝菌素。
[22]
一种用于从发酵培养液中除去固体残余物的工艺，所述工艺包括：
1)在有水溶性有机溶剂存在的情况下，离心发酵培养液以除去固体，同时在溶液中保留安丝菌素。
[23]
上述工艺可以任选地包括：
(i)化学灭活或热灭活发酵培养液中的微生物；和/或
(ii)在离心之前或在离心期间，处理培养基以促进溶剂萃取安丝菌素。
[24]
在上述方法中，优选产安丝菌素的微生物是束丝放线菌，进一步优选是珍贵橙色束丝放线菌。产安丝菌素的微生物还可以是珍贵橙色束丝放线菌ATCC 31565或其衍生菌株，或者是珍贵橙色束丝放线菌PF4-4(ATCC PTA-3921)或其衍生菌株。如美国专利No.4,450,234所述，珍贵橙色束丝放线菌ATCC 31565被保藏在如下单位：(i)发酵研究所，Osalca，17-85，Juso-honmachi 2-chome，Yodogawa-ku，大阪532-8686，日本，1979年8月20日，保藏编号IFO 13963；(ii)日本国家生命科学和人类技术研究所(先前的发酵研究所)，Agency ofIndustrial Science and Technology，国际贸易与工业部，1-3，higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305，日本，1979年8月29日，保藏编号FERM-P NO.5185；以及(iii)美国典型培养物保藏中心，10801 University Blvd.，Manassas，弗吉尼亚20110-2209，美国，1979年9月11日，保藏编号ATCC 31565。此外，珍贵橙色束丝放线菌PF4-4按布达佩斯条约被保藏在下述单位：美国典型培养物保藏中心，10801 University Blvd.，Manassas，弗吉尼亚201 10-2209，美国，2001年12月11日，保藏编号No.ATCC PTA-3921。
附图说明
[25]
图1所示为通过发酵制备的各种安丝菌素C-3酯、以及C-3醇、美登木醇(P-0)的结构。
具体实施方式
[26]
本发明提供用于在大容量发酵器中用液体培养基培养高产安丝菌素的微生物的方法。还提供用于将安丝菌素从培养液和微生物中萃取到不相溶于水的非芳香族有机溶剂中的方法，其中安丝菌素可高度溶解于该有机溶剂；以及视需要使安丝菌素通过硅柱或氧化铝柱，优选这些柱是预填充筒柱，然后析晶产物来纯化安丝菌素的方法。必要时，在萃取步骤之前，可以通过热处理或用氯仿处理使微生物失活。
[27]
可以用还原剂处理包含多种C-3酯混合物的精制安丝菌素，其中C-3酯比如是安丝菌素P-3、P-3’、P-4、P-4’、P-2和P-1(图1)，以获得预期的C-3羟基化合物、美登木醇(P-0)。精制安丝菌素典型地仅包含少量的不希望有的安丝菌素，该安丝菌素不在C-3位置修饰而在分子的其他位置修饰。优选产安丝菌素的菌株是束丝放线菌。进一步优选微生物是珍贵橙色束丝放线菌。微生物还可以是珍贵橙色束丝放线菌PF4-4(ATCC PTA-3921)和其衍生物、以及珍贵橙色束丝放线菌ATCC 31565和其衍生物。通过本技术领域技术人员所熟知的发酵培养技术，用此处描述的特定培养基或用本领域中描述的任何其他的培养基可以培养上述微生物(美国专利Nos.4,162,940、4,450,234、4,228,239、4,331,598、以及4,356,265)。
[28]
本发明方法的一个实施方式是在液体培养基中培养微生物。菌株PF4-4的生长在控制条件下进行，可以采用多种培养基和生长条件。例如，PF4-4可以如同美国专利Nos.4,137,230、4,162,940、4,331,598、4,356,265、和4,450,234描述的ATCC 31565或ATCC 31281那样、以及如同Hatano等在Agric.Biol.Chem.48，1721-1729，1984中的描述，在相似的条件下用类似的培养基培养。因此，菌株PF4-4容许采用多种碳源，这也有助于发酵制备安丝菌素。生长用培养基的例子如表1和2所示。表1所示为有助于用产安丝菌素的微生物例如珍贵橙色束丝放线菌PF4-4来生产安丝菌素的培养基，表2所示为适于珍贵橙色束丝放线菌PF4-4、以及其他产安丝菌素微生物的繁殖和/或生长的培养基。
表1生产培养基配方(全部为％w/v)
| FM27-44 | FM112-37 | FM4-4 | FM4-6 | FM4-7 | |
| 糊精(Lodex-5) | 6 | 6 | 5 | 5 | 5 |
| 麦芽糖(Difco) | 4 | 4 | 2 | 2 | 2 |
| Proflo(Traders) | 2.0 | 2.5 | 2.75 | ||
| 大豆粉(ADM) | 1.5 | 2.0 | |||
| 药用培养基(Traders) | 0.5 | ||||
| CSP(Roguette) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.15 | 0.15 |
| P.干酵母(Difco) | 0.25 | ||||
| MgSO4·7H2O(Wako) | 0.05 | ||||
| CaCO3(Hayashi) | 0.5 | 0.5 | 0.6 | ||
| (NH4)2SO4(Wako) | 0.05 | ||||
| KH2PO4(Wako) | 0.05 | 0.04 | |||
| K2HPO4(Wako) | 0.05 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | |
| CaCl2·2H2O(Wako) | 0.5 | 0.5 | |||
| NaHCO3(Wako) | 0.2 | ||||
| 沸石 | 0.1 | ||||
| FeSO4·7H2O(Wako) | 0.0002 | 0.0002 | 0.0002 | 0.0002 | 0.0002 |
| ZnSO4·7H2O | 0.0002 | ||||
| CoCl2·6H2O(Baker) | 0.001 | 0.0005 | 0.0005 | ||
| 尼克酸 | 0.0002 | ||||
| MnSO4·H2O | 0.0002 | ||||
| 异丁醇(Tedoa) | 0.1 | 0.5 | 0.5 | 0.3 | 0.3 |
| SAG471(Witco) | 0 | 0.06 | 0.04 | 0.04 | |
| pH | 6.8 | 6.8 | 6.8 | 7.2 | 7.35 |
在121℃下灭菌20分钟。最后添加。
表2相关培养基
斜面培养基和平板培养基，CM4-1琼脂
(％，w/v)
酵母提取物(Difco) 0.3
麦芽提取物(Difco) 0.3
Soytone(Difco) 0.5
甘油(Difco) 1.0
Bacto琼脂(Difco) 2.0
在灭菌前将pH调节到6.5；灭菌：121℃，20分钟
种子培养基，VM4-1’
(％，w/v)
可溶性淀粉(BDH) 2.0
葡萄糖(Shuling) 1.0
大豆粉(ADM) 1.0
玉米浆(Solulys) 0.5
Soytone(Difco) 0.5
NaCl(Wako) 0.3
CaCO3(Hayashi) 0.5
pH6.8；灭菌：121℃，20分钟
通过菌株PF4-4发酵制备安丝菌素的优选方法进一步如下面的实施例1和2所述。
发酵
[29]
培养可以在如下培养条件下进行，比如静置、振荡、通气浸没或任何其他的培养条件。为在大容量槽发酵器中较好地培养安丝菌素并实现高产量，优选通气浸没培养。通过在发酵期间补加营养物，可以进一步提高安丝菌素的产量。例如，当在FM4-6培养基中培养微生物时，在发酵持续期间额外地补加葡萄糖或大约在发酵初始的24～72小时内，优选大约在初始的48小时内额外地补加葡萄糖，接着补加葡萄糖和蛋白质营养物比如棉籽粉(例如来自Trader’s Protein，Memphis，TN的Proflo或药用培养基)或大豆粉、以及额外地添加醇类或醛类，比如异丁醇、异丁醛、正丁醇、正丁醛、正丙醇、正丙醛、异丙醇、异丙醛、戊醇、戊醛、异戊醇、异戊醛，以促进形成C-3酯侧链，直至发酵结束，可以使安丝菌素的产量翻倍。因为培养条件取决于采用的培养基和生产规模，故通常优选在pH为5～9的范围内进行发酵，优选初始pH约为6.5～8.0。进一步优选pH约为7～8，更进一步优选pH约为7～7.4，最优选pH约为7.2。温度范围约为15～35℃，优选范围约为25～30℃。进一步优选温度约为28℃。发酵持续进行，直到累积的安丝菌素达到最大值。培养时间可以改变，并取决于如下几个因素：培养方法、培养基配方、以及温度。典型地，发酵时间范围为96～336h。
安丝菌素的分析：
[30]
在美国专利Nos.4,331,598和4,450,234中，作为产生如下两种类型安丝菌素的亲代菌株ATCC 31565被公开，这两类安丝菌素的特殊之处在于在C-14处存在甲基基团或羟甲基基团(见图1)。在这两类安丝菌素中，多种不同的安丝菌素被制备，它们的区别在于这些安丝菌素以各自的酰基侧链与C-3氧原子结合，并且在于是否在C-14处携带有甲基基团或羟甲基基团(或随后研究中的N-脱甲基)。此处用于被取代的化合物的名称参照图1进行定义。
[31]
安丝菌素P-3是PF4-4和亲代菌株ATCC 31565在一定生长条件下的主要产物。如果细菌在有缬氨酸或异丁酸(见美国专利No.4,228,239)或异丁醇或异丁醛(见美国专利No.4,356,265)存在的条件下生长，那么仅存在少量的其他安丝菌素化合物。当PF4-4菌株在不同的都含有异丁醇的发酵培养基(如表1中所示的FM)中生长时，安丝菌素P-3是主要的安丝菌素产物。在一种测定安丝菌素的量的方法中，先用乙醇或乙腈稀释发酵培养液的试样，接着强烈摇动，最后离心。然后测定上层清夜以确定安丝菌素P-3的含量。
[32]
优选用反相高效液相色谱法(HPLC)使安丝菌素各组分分开并分析各安丝菌素，但可以使用任何合适的技术，比如MALDI-TOF或薄层层析。在一种方法中，用有机溶剂比如乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿萃取发酵培养液，通过HPLC，用反相C18或C8柱确定有机溶剂中P-3的含量。
安丝菌素的萃取
[33]
通过常用于回收次级代谢产物的方法可以从发酵培养液中萃取安丝菌素。由于安丝菌素较容易溶于非芳香族溶剂，故很容易通过混合搅拌不相溶于水的非芳香族溶剂，比如烷基乙酸酯、二烃基酮以及卤化溶剂来萃取，烷基乙酸酯内烷基链是线性的或分支的，并具有1～5个碳原子。合适的烷基乙酸酯的例子包括乙酸正丁酯、乙酸乙酯、以及乙酸甲酯。合适的二烃基酮的例子是甲基异丁基酮。合适的卤化溶剂的例子是二氯甲烷。优选用乙酸正丁酯萃取。优选发酵培养液与不相溶于水的非芳香族溶剂的体积比是1∶1。
[34]
还可以将发酵培养液中的安丝菌素吸附在如下各种树脂上，比如购自罗门哈斯公司的Amberlite XAD-4、XAD-16、购自Mitsubishi化学品工业有限公司的Diaion HP20、HP21、Sepabeads SP825、SP850、SP70、SP700。这些例子不是对所用树脂范围的限制，本技术领域技术人员所熟知的其他树脂也可以用于上述目的。树脂也可以用作二级结构比如磁性材料或高密度材料上的涂层，从而使聚合物因磁性或通过依赖于吸附剂密度的方法比如膨胀床层析而从培养液中回收。一旦安丝菌素被吸附在树脂上，就可以用一种或多种有机溶剂等度洗脱或梯度洗脱。在一个实施方式中，树脂可以被直接添加到培养液中以萃取安丝菌素。
[35]
可以用多种方法从树脂中回收安丝菌素。在一个实施方式中，可以通过过滤回收树脂。在第二个实施方式中，可以通过离心回收树脂，接着用一种或多种有机溶剂或一种或多种含水的有机溶剂洗脱固体颗粒。在第三个实施方式中，可以通过膨胀床层析从树脂中除去水相和固体残余物。接着可以在膨胀床柱中压缩树脂，然后用一种或多种有机溶剂或一种或多种含水的有机溶剂等度洗脱或梯度洗脱树脂。在第四个实施方式中，当通过半透膜使树脂与发酵培养液分离时，安丝菌素可以被萃取到树脂中。例如，可以将用树脂填充的透析膜与发酵培养液、水混合一起搅拌，使低分子组分透过该膜，从而使安丝菌素粘结到树脂上。然后从培养液中除去透析袋，从而可以按如上所述洗脱回收的树脂。
[36]
在萃取之前，视需要可以通过在约50～55℃下使发酵培养液在空气中缓慢受热30分钟～2小时，或者通过添加1％(v/v)的氯仿(Tom Hasegawa等，Im.J.Syst.Bacteriol.，33：314-320，1983)，使发酵培养液中的微生物失活。
[37]
在萃取之前或在萃取期间，该工艺还可以包括处理培养基以促进溶剂萃取安丝菌素。该处理可以包括但不限于加热、调节pH、或酶催化处理或化学处理，比如添加聚硫酸铁、脱乳化剂、气相法二氧化硅、助溶剂比如丙酮或醇类比如甲醇。
[38]
就有机相萃取而言，萃取在pH2.0～13.0之间进行，优选pH约为6.0～7.0，进一步优选pH约为6.5～7.0，并且优选用乙酸正丁酯萃取。为提高萃取效率，在萃取过程中，培养液的温度可以保持在5～80℃之间，优选在30～45℃之间。
[39]
萃取时间取决于如下几个因素：培养液组分、培养液和萃取溶剂的温度、混合培养液和溶剂的方法以及用于萃取的溶剂。萃取时间为1～120小时，具体取决于萃取方法。例如，当选择快速萃取和过滤法时，萃取时间可以在1～12小时之间。
[40]
在过滤期间可以使用助滤剂。这种助滤剂包括但不限于Celpure P1000、Celatom FW-80、Hyflo Super Cel和硅藻土。在过滤期间，视需要可以将助滤剂直接添加到培养液中。视需要还可以用助滤剂预涂覆滤膜。能用于该工艺中的过滤方法包括但不限于切面流超滤(tangentialflow filtration)、助滤剂涂层刮鼓过滤(filter aid coated scraping drum filtration)或分批过滤。
[41]
如果在pH靠近两端情况下如pH1～pH5或pH8～pH13，或者在较高温度比如60℃～90℃下进行萃取，那么萃取应在安丝菌素不发生过度分解的速率下进行。必要时，还可以通过连续离心，非常快速地进行萃取。在此情况下，发酵培养液的pH或温度可以调节成与培养液进入离心机时的相同，从而避免其长时间暴露在苛刻条件下。已经用于发酵工艺并且可用于萃取安丝菌素的离心设备的例子包括但不限于离心式分离机和堆叠式盘状离心机(stacked disc centrifuge)。然后减压浓缩保留的有机溶剂萃取物以获得含有安丝菌素的残留物。此外，可以将水溶性溶剂与发酵培养液混合并对其进行离心以除去固体，从而获得单相、不含固体的溶液。然后可以按如下步骤处理溶液，例如，添加不相溶于水的溶剂使有机物与水相分离，接着浓缩有机相。
水洗溶液中的安丝菌素。
[42]
在不相溶于水的有机溶剂的溶液中的安丝菌素可以用水、酸水溶液、碱水溶液、部分饱和或完全饱和的盐水或任何描述的洗涤剂水溶液的组合洗涤。酸水溶液的例子包括但不限于pH在1～6.9之间的盐酸、硫酸、乙酸、甲酸、以及磷酸的水溶液。在本发明中，酸水溶液还包括酸性缓冲水溶液体系。酸性缓冲液体系的例子包括但不限于磷酸钠、磷酸钾、乙酸铵、以及甲酸铵，各个溶液的pH值均调节到适于各自的酸性缓冲液范围。碱水溶液的例子包括但不限于pH在7.1～13之间的碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化铵、以及磷酸钠的水溶液。在本发明中，碱水溶液还包括碱性缓冲水溶液体系。碱性缓冲液体系的例子包括但不限于磷酸钠、磷酸钾、硼酸钠、以及碳酸铵，各个溶液的pH值均调节到适于各自的碱性缓冲液范围。
[43]
酸性洗涤或碱性洗涤必须在不明显改变安丝菌素分解程度的pH内进行。必要时，可以通过离心技术进行非常快速地萃取。部分饱和或完全饱和的盐水的例子包括但不限于不同饱和度的氯化钠水溶液、不同饱和度的硫酸钠水溶液、以及不同饱和度的氯化钾水溶液。还可以用完全饱和或部分饱和的盐水溶液的混合物与碱水溶液或酸水溶液组合进行水洗。
在萃取之前进行过滤：
[44]
在萃取之前，还可以通过过滤或离心分离出含有发酵培养液的安丝菌素中的固体。通过用溶剂比如乙醇、含水的乙醇、或其他的有机溶剂，比如乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷或丙酮洗涤可以回收固体细胞团块中的安丝菌素，该方法是本技术领域为人所熟知的常用方法之一。如另一申请所描述的那样，通过用已知的芳香族有机溶剂萃取可以回收滤液中的安丝菌素。
安丝菌素的纯化：
[45]
可以对粗产物进行纯化处理，比如在硅胶或氧化铝上吸附层析，接着视需要进行重结晶。优选在预填充柱比如Biotage层析系统的Biotage硅胶筒柱上进行层析。通过溶剂的浓度梯度可以从柱中洗脱预期的安丝菌素，该溶剂初始为乙酸乙酯和正己烷的混合物，通过不断增加甲醇的量来形成浓度梯度。接着合并并浓缩含有预期安丝菌素的洗脱组分。视需要可以通过析晶进一步纯化安丝菌素，该方法中先用溶剂比如乙酸乙酯溶解产物，接着添加非极性溶剂比如庚烷或正己烷以结晶析出纯的产物。此处使用的术语“析晶”也包含术语“沉淀”，这是因为从溶液中形成的固体可以是无定形的，也可以有确定结构。
细胞结合试剂/美登木素生物碱复合体：
[46]
本发明的工艺可以用于制备用作激活肿瘤前体药物的细胞结合试剂/美登木素生物碱复合体。用本发明的工艺制备的安丝菌素可以被还原分裂成美登木醇，该美登木醇可以如美国专利Nos.5,203,020、5,416,064、6,333,410和6,441,163中所描述的那样用于生成包含美登木素生物碱衍生物的N-甲基-L-丙氨酸。这些衍生物接着经各种连接体比如含有二硫化物的连接体偶联于细胞结合试剂，优选偶联于抗体。
实施例
[47]
现在结合非限制性实施例对本发明进行说明。
实施例1：安丝菌素的制备：
[48]
初级接种：包含2％可溶性淀粉、1％葡萄糖、1％大豆粉、0.5％玉米浆、(Roquette公司)0.5％Soytone、0.3％氯化钠、和0.5％碳酸钙的种子培养基VM4-1’(400ml/烧瓶容积)被分别注入到11个2L容积的锥形烧瓶中。在灭菌后，各个烧瓶用PF4-4(ATCC PTA-3921)培养物接种。烧瓶在定轨摇床上以230rpm的转速在28℃下培养48h。
[49]
二级接种：然后合并初级接种烧瓶中的物质。在300L的发酵罐中加入100L的VM4-1’种子培养基。在灭菌后，发酵罐用4L经合并的初级种子培养物接种。发酵罐保持28℃，以80rpm的转速搅拌。视需要通过鼓气及增强搅拌来使溶解氧的饱和度保持在30％以上。在培养24h后，二级种子培养物可被转接到生产容器中。
[50]
生产：两个300L生产用的发酵罐各自加入250L生产用培养基FM4-6(见表1)。在灭菌后，发酵罐各自用15L的二级种子培养物接种。发酵罐保持28℃，以107±5rpm的转速搅拌，鼓气速率为0.4vvm。两天后，通过将搅拌速度增加到170±5rpm的极大值，并将鼓气速率增加到1vvm的极大值，使溶解氧的含量保持在30％以上。通过从发酵培养液中取样并用乙醇稀释，接着通过HPLC定量分析对安丝菌素的滴度进行每日测定。发酵持续进行，直到第10天，安丝菌素的生长量在该点达到稳定为止。两个发酵罐中的安丝菌素在第10天的滴度分别是251mg/L和244mg/L。通过添加磷酸，将发酵培养液的pH调节到6.5。发酵罐加热到55℃，并在该温度下保持1 h以使微生物失活。然后将发酵罐冷却到室温以促进用有机溶剂萃取。
实施例2：采用分批补料工艺生产安丝菌素
[51]
1500L生产用的发酵罐中加入900L生产用的培养基FM4-6(见表1)。在灭菌后，发酵罐用54L如上所述制备的二级种子培养物接种。发酵罐保持28℃，搅拌速度为107±5rpm，鼓气速率为0.4vvm。在初始的0～48小时内，以0.39mL/L/h的速率注入28.5％的葡萄糖水溶液。从48h到288h的发酵期间，改成以0.51mL/L/h的速率注入包含21.5％葡萄糖、7.1％Proflo和7.1％异丁醇的储备液。两天后，通过将搅拌速度增加到170±5rpm的极大值，并将鼓气速率增加到1vvm的极大值，使溶解氧的含量保持在20％以上。通过从发酵培养液中取样并用乙醇稀释，接着通过HPLC定量分析对安丝菌素的滴度进行每日测定。发酵持续进行，直到第13天，安丝菌素的生长量在该点达到稳定为止。发酵罐中的安丝菌素在第13天的滴度为304mg/L。通过添加磷酸，将发酵培养液的pH调节到6.5。
[52]
热灭活。发酵罐加热到55℃，并在该温度下保持1h以使微生物失活。然后将发酵罐冷却到30～40℃之间以促进用有机溶剂萃取。
实施例3：安丝菌素的萃取和层析纯化
[53]
将实施例2中的发酵培养液与等体积的乙酸正丁酯混合。混合物保持在30～40℃到45℃之间，缓慢搅拌混合物使得这两个相的混合正好发生在溶剂界面处。萃取持续进行5天以上，直到有机层的HPLC分析显示高于80％的安丝菌素已经被萃取。接着用降膜蒸发器分离并蒸发有机层，使溶液的最终体积在20～50L之间。经浓缩的萃取物被转移到装有2.2kg硅胶的烧瓶中。通过减压操作旋转蒸发器，蒸去溶剂，将粗安丝菌素涂覆在硅胶上。然后将涂层硅胶转移到Biotage有限公司、Charlotesville、VA的进样组件(SIM)中。用环己烷与正己烷(2∶1v/v)的混合物清洗SIM，接着将SIM连接到配有硅胶筒体的Biotage 150M系统中。用乙酸乙酯∶正己烷∶甲醇的混合物(29.4∶68.6∶2.0，v/v/v)从柱中洗脱预期产物。合并含有安丝菌素的洗脱组分，接着减压蒸发溶剂。在高真空下，进一步将产物干燥24h。
实施例4：安丝菌素的重结晶
[54]
将上述步骤中获得的干燥产物溶解在热的乙酸乙酯(23mL/g的残留物)中。混合物保持在60～75℃之间，直到安丝菌素完全溶解。当混合料的温度保持在60～75℃之间时，缓慢地添加庚烷(80mL/g的残留物)。在添加完所有的庚烷后，将混合料冷却到室温。通过过滤回收晶体，接着在高真空下干燥以获得221克纯的安丝菌素。
实施例5：通过过滤萃取发酵培养液
[55]
将如实施例2所述制备的发酵培养液(200ml)与200mL的乙酸正丁酯强力混合搅拌5分钟，获得乳化液。接着添加Cellatom FW-80助滤剂(20g)，然后用预先涂有Cellatom FW-80助滤剂的布氏漏斗真空过滤混合物。用40 mL的乙酸正丁酯洗涤滤饼。将不含固体夹杂物、仅含澄清的有机物层和水层的滤液转移到分液漏斗中。排出水相。保留含有安丝菌素的有机相。
实施例6：通过离心用不相溶于水的溶剂萃取发酵培养液
[56]
将1部分如实施例2所述制备的发酵培养液的与1部分乙酸正丁酯强力混合搅拌2分钟。将获得的乳化液离心1分钟，接着分离出含有安丝菌素但不含固体夹杂物的有机层。
实施例7：通过离心用水溶性溶剂萃取发酵培养液
[57]
将1部分如实施例2所述制备的发酵培养液的与1部分丙酮强力混合搅拌。将混合物离心1分钟以粒化固体。分离出上层清夜，并将其与1/2部分的正己烷混合。分离水层后，留下澄清的含有安丝菌素的有机相。
实施例8：用XAD-16疏水微球固相萃取安丝菌素
[58]
将如实施例2所述制备的1L发酵培养液与10克XAD-16微球混合搅拌6小时。然后离心混合物，接着除去上层清液。将固体颗粒转移到小柱中，先用去离子水洗脱，再用90∶10的去离子水∶乙腈洗脱。将含有安丝菌素的洗脱组分合并，接着蒸发溶剂，获得112mg的浓缩萃取物。HPLC分析表明萃取物含有50mg的安丝菌素。
虽然本发明已用具体的实施方式进行了详细的描述，但对本技术领域的熟练人员来说，可在不脱离本发明宗旨和范围的前提下做各种改进和变动。
[60]
此处提及的所有公开文件均可参照文献。
Claims (73)
1.一种用于制备精制安丝菌素的工艺，其包括如下步骤：
1)在液体培养基中培养产安丝菌素的微生物；2)用不相溶于水的非芳香族溶剂从培养基中萃取安丝菌素；
3)浓缩萃取的安丝菌素；以及
4)通过a)和b)中的任何一个纯化安丝菌素：
a)析晶，和
b)先析晶，然后在硅胶或氧化铝上吸附层析。
2.一种用于制备精制安丝菌素的工艺，其包括如下步骤：
1)在液体培养基中培养产安丝菌素的微生物；
2)处理培养基以促进溶剂萃取安丝菌素；
3)用不相溶于水的非芳香族溶剂从培养基中萃取安丝菌素；
4)浓缩萃取的安丝菌素；以及
5)通过a)和b)中的任何一个来纯化安丝菌素：
a)析晶，和
b)先析晶，然后在硅胶或氧化铝上吸附层析。
3.一种用于制备精制安丝菌素的工艺，其包括如下步骤：
1)在液体培养基中培养产安丝菌素的微生物；
2)用不相溶于水的非芳香族溶剂从培养基中萃取安丝菌素；
3)过滤以除去固体，从而允许有机相分离；
4)从有机相中浓缩安丝菌素；以及
5)通过a)、b)、c)和d)中的任何一个来纯化安丝菌素：
a)在硅胶或氧化铝上吸附层析，
b)析晶，
c)先在硅胶或氧化铝上吸附层析，然后析晶，以及
d)先析晶，然后在硅胶或氧化铝上吸附层析。
4.如权利要求3所述的工艺，其特征在于，还包括在过滤期间使用助滤剂。
5.一种用于制备精制安丝菌素的工艺，其包括如下步骤：
1)在液体培养基中培养产安丝菌素的微生物；
2)采用离心技术，用不相溶于水的非芳香族溶剂从培养基中萃取安丝菌素；
3)浓缩萃取的安丝菌素；以及
4)通过a)、b)、c)和d)中的任何一个来纯化安丝菌素：
a)在硅胶或氧化铝上吸附层析，
b)析晶，
c)先在硅胶或氧化铝上吸附层析，然后析晶，以及
d)先析晶，然后在硅胶或氧化铝上吸附层析。
6.一种用于制备精制安丝菌素的工艺，其包括如下步骤：
1)在液体培养基中培养产安丝菌素的微生物；
2)在有水溶性有机溶剂存在的情况下，离心培养基以除去固体；
3)添加不相溶于水的非芳香族溶剂，将安丝菌素萃取至有机层中；
4)浓缩萃取的安丝菌素；以及
5)通过a)、b)、c)和d)中的任何一个来纯化安丝菌素：
a)在硅胶或氧化铝上吸附层析，
b)析晶，
c)先在硅胶或氧化铝上吸附层析，然后析晶，以及
d)先析晶，然后在硅胶或氧化铝上吸附层析。
7.如权利要求6所述的工艺，其特征在于，在萃取期间将盐添加到所述有机相中。
8.一种用于制备精制安丝菌素的工艺，其包括如下步骤：
1)在液体培养基中培养产安丝菌素的微生物；
2)通过固相萃取，将安丝菌素从培养基中萃取到树脂上；
3)使用有机溶剂或混有水的有机溶剂，从树脂中等度洗脱或梯度洗脱安丝菌素；
4)浓缩经洗脱的安丝菌素；以及
5)任选通过a)、b)、c)和d)中的任何一个来纯化安丝菌素：
a)在硅胶或氧化铝上吸附层析，
b)析晶，
c)先在硅胶或氧化铝上吸附层析，然后析晶，以及
d)先析晶，然后在硅胶或氧化铝上吸附层析。
9.如权利要求1～8中任一项所述的工艺，其特征在于，所述产安丝菌素的微生物是束丝放线菌Actinosynnema spp。
10.如权利要求1～8中任一项所述的工艺，其特征在于，所述产安丝菌素的微生物是珍贵橙色束丝放线菌Actinosynnema pretiosum。
11.如权利要求1～8中任一项所述的工艺，其特征在于，所述产安丝菌素的微生物是珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565或其衍生菌株。
12.如权利要求1～8中任一项所述的工艺，其特征在于，所述产安丝菌素的微生物是珍贵橙色束丝放线菌PF4-4(ATCC PTA-3921)或其衍生菌株。
13.如权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述处理包括通过加热发酵培养液或通过向发酵培养液添加氯仿来使微生物失活。
14.如权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述处理包括加热、调节pH、酶催化处理或化学处理。
15.如权利要求14所述的工艺，其特征在于，所述化学处理包括添加聚硫酸铁、脱乳化剂、气相法二氧化硅或助溶剂。
16.如权利要求14所述的工艺，其特征在于，通过将所述培养液加热到约50～55℃，使所述微生物失活。
17.如权利要求1～8中任一项所述的工艺，其特征在于，所述萃取在pH约为6～7处进行。
18.如权利要求1～8中任一项所述的工艺，其特征在于，所述萃取在温度约为30～45℃处进行。
19.如权利要求1～7中任一项所述的工艺，其特征在于，所述不相溶于水的非芳香族溶剂选自于由烷基乙酸酯、二烃基酮、以及卤化溶剂所构成的组，所述烷基乙酸酯中的烷基链是线性的或分支的并具有1～5个碳原子。
20.如权利要求1～7中任一项所述的工艺，其特征在于，所述不相溶于水的非芳香族溶剂选自于由乙酸正丁酯、乙酸乙酯、以及乙酸甲酯所构成的组。
21.如权利要求1～7中任一项所述的工艺，其特征在于，所述不相溶于水的非芳香族溶剂是甲基异丁基酮。
22.如权利要求1～7中任一项所述的工艺，其特征在于，所述不相溶于水的非芳香族溶剂是二氯甲烷。
23.如权利要求1～7中任一项所述的工艺，其特征在于，所述不相溶于水的非芳香族溶剂是乙酸正丁酯。
24.如权利要求1～7中任一项所述的工艺，其特征在于，所述萃取在温度约为30～45℃处进行，所述不相溶于水的非芳香族溶剂是乙酸正丁酯。
25.如权利要求1～7中任一项所述的工艺，其特征在于，所述培养基与所述不相溶于水的非芳香族溶剂的体积比为1∶1。
26.如权利要求19所述的工艺，其特征在于，所述培养基与所述不相溶于水的非芳香族溶剂的体积比是1∶1。
27.如权利要求1～8中任一项所述的工艺，其特征在于，在生产用培养基中进行的所述培养在pH约为6.5～8处进行。
28.如权利要求27所述的工艺，其特征在于，pH约为7～7.4。
29.如权利要求28所述的工艺，其特征在于，pH约为7.2。
30.如权利要求27所述的工艺，其特征在于，温度约为15～35℃。
31.如权利要求27所述的工艺，其特征在于，温度约为25～30℃。
32.如权利要求27所述的工艺，其特征在于，温度约为28℃。
33.如权利要求32所述的工艺，其特征在于，温度约为28℃，pH约为7.2。
34.如权利要求1～8中任一项所述的工艺，其特征在于，在所述培养期间，至少添加一种额外的营养物。
35.如权利要求34所述的工艺，其特征在于，所述额外的营养物是碳源。
36.如权利要求34所述的工艺，其特征在于，所述额外的营养物开始是碳源，后来是碳源和蛋白质营养物。
37.如权利要求34所述的工艺，其特征在于，在所述培养期间，额外地添加醇类或醛类以促进安丝菌素的C-3酯侧链的形成。
38.如权利要求35所述的工艺，其特征在于，在所述培养期间，额外地添加醇类或醛类以促进安丝菌素的C-3酯侧链的形成。
39.如权利要求36所述的工艺，其特征在于，在所述培养期间，额外地添加醇类或醛类以促进安丝菌素的C-3酯侧链的形成。
40.如权利要求35所述的工艺，其特征在于，所述碳源是葡萄糖。
41.如权利要求36所述的工艺，其特征在于，所述碳源是葡萄糖。
42.如权利要求36所述的工艺，其特征在于，所述蛋白质营养物是棉籽粉或大豆粉。
43.如权利要求38所述的工艺，其特征在于，所述醛类或醇类选自于由异丁醇、异丁醛、正丁醇、正丁醛、正丙醇、正丙醛、异丙醇、异丙醛、戊醇、戊醛、异戊醇、以及异戊醛所构成的组。
44.如权利要求39所述的工艺，其特征在于，所述醛类或醇类选自于由异丁醇、异丁醛、正丁醇、正丁醛、正丙醇、正丙醛、异丙醇、异丙醛、戊醇、戊醛、异戊醇、以及异戊醛所构成的组。
45.如权利要求34所述的工艺，其特征在于，所述培养在pH约为6.5～8处进行。
46.如权利要求34所述的工艺，其特征在于，所述培养在pH约为7～7.4处进行。
47.如权利要求34所述的工艺，其特征在于，所述培养在pH约为7.2处进行。
48.如权利要求34所述的工艺，其特征在于，所述培养在温度约为15～35℃处进行。
49.如权利要求34所述的工艺，其特征在于，所述培养在温度约为25～30℃处进行。
50.如权利要求34所述的工艺，其特征在于，所述培养在温度约为28℃处进行。
51.如权利要求34所述的工艺，其特征在于，所述培养在温度约为28℃、pH约为7.2处进行。
52.如权利要求1～8中任一项所述的工艺，其特征在于，还包括如下一个或多个步骤：
(i)通过化学灭活或热灭活使所述培养基中的所述微生物失活；
(ii)在步骤2之前，处理所述培养基以促进溶剂萃取安丝菌素；以及
(iii)在能够在纯化过程中进行的沉淀之前或之后洗涤，其中用水、盐的水溶液、酸的水溶液或碱的水溶液以任何顺序组合方式洗涤有机溶剂中的粗安丝菌素溶液。
53.一种细胞结合剂美登木素生物碱复合体，所述复合体通过将如权利要求1～8中任一项所述的工艺制备的安丝菌素衍生的美登木素生物碱与细胞结合剂连接而制得。
54.如权利要求53所述的细胞结合剂美登木素生物碱复合体，其特征在于，所述细胞结合剂是一种抗体。
55.一种用于从发酵培养液中萃取安丝菌素的工艺，所述工艺包括：
1)使发酵培养液中产安丝菌素的微生物失活；以及
2)用不相溶于水的非芳香族溶剂从发酵培养液中萃取安丝菌素。
56.如权利要求55所述的工艺，其特征在于，所述失活通过加热发酵培养液或通过向发酵培养液添加氯仿来实现。
57.如权利要求55所述的工艺，其特征在于，所述失活通过将发酵培养液加热到约50～55℃来实现。
58.如权利要求55所述的工艺，其特征在于，所述萃取在pH约为6～7处进行。
59.如权利要求55所述的工艺，其特征在于，所述萃取在温度约为30～45℃处进行。
60.如权利要求55所述的工艺，其特征在于，所述不相溶于水的非芳香族溶剂选自于由烷基乙酸酯、二烃基酮、以及卤化溶剂所构成的组，所述烷基乙酸酯中的烷基链是线性的或分支的并具有1-5个碳原子。
61.如权利要求55所述的工艺，其特征在于，所述不相溶于水的非芳香族溶剂选自于由乙酸正丁酯、乙酸乙酯、以及乙酸甲酯所构成的组。
62.如权利要求55所述的工艺，其特征在于，所述不相溶于水的非芳香族溶剂是甲基异丁基酮。
63.如权利要求55所述的工艺，其特征在于，所述不相溶于水的非芳香族溶剂是二氯甲烷。
64.如权利要求55所述的工艺，其特征在于，所述不相溶于水的非芳香族溶剂是乙酸正丁酯。
65.如权利要求55所述的工艺，其特征在于，所述萃取在温度约为30～45℃处进行，所述不相溶于水的非芳香族溶剂是乙酸正丁酯。
66.如权利要求55所述的工艺，其特征在于，所述发酵培养液与所述不相溶于水的非芳香族溶剂的体积比为1∶1。
67.如权利要求55所述的工艺，其特征在于，还包括在步骤2之前处理所述发酵培养液以促进溶剂萃取安丝菌素。
68.一种用于从发酵培养液中萃取安丝菌素的工艺，所述工艺包括：
1)用不相溶于水的非芳香族溶剂从发酵培养液中萃取安丝菌素；以及
2)过滤以除去固体，从而允许有机相分离。
69.如权利要求68所述的工艺，其特征在于，还包括如下一个或两个步骤：
(i)通过化学方法或加热方法使所述发酵培养液中的所述微生物失活；以及
(ii)在步骤1之前，处理所述发酵培养液以促进溶剂萃取安丝菌素。
70.一种用于从发酵培养液中萃取安丝菌素的工艺，所述工艺包括：通过离心，用不相溶于水的非芳香族溶剂从发酵培养液中萃取安丝菌素，
71.如权利要求70所述的工艺，其特征在于，所述萃取工艺还包括如下一个或两个步骤：
(i)通过化学方法或加热方法使所述发酵培养液中的所述微生物失活；以及
(ii)在离心之前或在离心期间，处理所述发酵培养液以促进溶剂萃取安丝菌素。
72.一种用于从发酵培养液中除去固体残余物的工艺，所述工艺包括：
在有水溶性有机溶剂存在的情况下，离心发酵培养液以除去固体，同时在溶液中保留安丝菌素。
73.如权利要求72所述的工艺，其特征在于，所述用于从发酵培养液中除去固体残余物的工艺还包括如下一个或两个步骤：
(i)通过化学方法或加热方法使所述发酵培养液中的所述微生物失活；以及
(ii)在离心之前或在离心期间，处理所述发酵培养液以促进溶剂萃取安丝菌素。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510127907.9A CN104745655A (zh) | 2005-01-19 | 2005-12-12 | 用于制备安丝菌素的方法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11/037,104 US7432088B2 (en) | 2003-05-08 | 2005-01-19 | Methods for the production of ansamitocins |
| US11/037,104 | 2005-01-19 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510127907.9A Division CN104745655A (zh) | 2005-01-19 | 2005-12-12 | 用于制备安丝菌素的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101103120A true CN101103120A (zh) | 2008-01-09 |
Family
ID=36692550
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2005800468716A Pending CN101103120A (zh) | 2005-01-19 | 2005-12-12 | 用于制备安丝菌素的方法 |
| CN201510127907.9A Pending CN104745655A (zh) | 2005-01-19 | 2005-12-12 | 用于制备安丝菌素的方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510127907.9A Pending CN104745655A (zh) | 2005-01-19 | 2005-12-12 | 用于制备安丝菌素的方法 |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7432088B2 (zh) |
| EP (2) | EP1838863A4 (zh) |
| JP (1) | JP5106120B2 (zh) |
| KR (3) | KR20070099576A (zh) |
| CN (2) | CN101103120A (zh) |
| AU (1) | AU2005325166B2 (zh) |
| BR (1) | BRPI0519624B8 (zh) |
| CA (2) | CA2834033C (zh) |
| CR (1) | CR9228A (zh) |
| CY (1) | CY1121372T1 (zh) |
| DK (1) | DK2514828T3 (zh) |
| EA (1) | EA012524B1 (zh) |
| ES (1) | ES2710875T3 (zh) |
| HK (1) | HK1211985A1 (zh) |
| HU (1) | HUE042312T2 (zh) |
| IL (2) | IL183918A (zh) |
| LT (1) | LT2514828T (zh) |
| MX (1) | MX2007008069A (zh) |
| NO (1) | NO342876B1 (zh) |
| NZ (2) | NZ555437A (zh) |
| PL (1) | PL2514828T3 (zh) |
| PT (1) | PT2514828T (zh) |
| SG (1) | SG158905A1 (zh) |
| SI (1) | SI2514828T1 (zh) |
| TR (1) | TR201901647T4 (zh) |
| WO (1) | WO2006078368A1 (zh) |
| ZA (1) | ZA200704918B (zh) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101921817A (zh) * | 2010-09-07 | 2010-12-22 | 上海交通大学 | 安莎霉素发酵产量提高方法 |
| CN101319241B (zh) * | 2008-07-17 | 2011-03-30 | 上海交通大学 | 安丝菌素的固体发酵方法 |
| CN103255184A (zh) * | 2012-02-15 | 2013-08-21 | 百奥泰生物科技(广州)有限公司 | 生产安丝菌素的发酵培养基 |
| CN103805648A (zh) * | 2012-11-13 | 2014-05-21 | 百奥泰生物科技(广州)有限公司 | 高产安丝菌素发酵工艺 |
| CN105907681A (zh) * | 2016-05-30 | 2016-08-31 | 苏州康聚生物科技有限公司 | 一种高产安丝菌素p-3的突变株及安丝菌素p-3的制备方法 |
| CN108276427A (zh) * | 2018-01-14 | 2018-07-13 | 常州大学 | 一种安丝菌素p-3的提取与分离纯化方法 |
| CN108330113A (zh) * | 2018-03-08 | 2018-07-27 | 山东省医药生物技术研究中心（山东省病毒研究所） | 一株高底物专一性酰基转移酶的珍贵束丝放线菌及其应用 |
| CN115477658A (zh) * | 2022-10-12 | 2022-12-16 | 道中道（菏泽）制药有限公司 | 一种有效降低安丝菌素p-3杂质的结晶方法 |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7589180B2 (en) | 2001-05-11 | 2009-09-15 | Abbott Laboratories Inc. | Specific binding proteins and uses thereof |
| US20100056762A1 (en) | 2001-05-11 | 2010-03-04 | Old Lloyd J | Specific binding proteins and uses thereof |
| US20070095203A1 (en) * | 2005-10-07 | 2007-05-03 | Paris Henry G | Method to Remove an Agent Using a Magnetic Carrier from the Gaseous Phase of a Process |
| US20070135629A1 (en) * | 2005-12-08 | 2007-06-14 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Isolation of ansamitocins |
| US20080023046A1 (en) * | 2006-07-10 | 2008-01-31 | Ermenegildo Restelli | Apparatus for the separation of a resin from a reaction mixture |
| CN100420754C (zh) * | 2006-10-26 | 2008-09-24 | 浙江海正药业股份有限公司 | 一种制备蒽莎姆菌素的方法 |
| CN104013956B (zh) | 2007-01-25 | 2018-12-18 | 达娜-法勃肿瘤研究所公司 | 抗egfr抗体在治疗egfr突变体介导的疾病中的用途 |
| AU2008227123B2 (en) | 2007-03-15 | 2014-03-27 | Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. | Treatment method using EGFR antibodies and src inhibitors and related formulations |
| CR20190516A (es) | 2007-07-16 | 2020-02-18 | Genentech Inc | ANTICUERPOS ANTI-CD79B E INMUNOCONJUGADOS (Divisional 2015-0040) |
| PE20090481A1 (es) | 2007-07-16 | 2009-05-18 | Genentech Inc | Anticuerpos anti-cd79b e inmunoconjugados humanizados y metodos de uso |
| CA2696360C (en) | 2007-08-14 | 2018-11-20 | Ludwig Institute For Cancer Research | Monoclonal antibody targeting the egfr receptor and uses thereof |
| CN101981055B (zh) | 2008-01-31 | 2016-03-09 | 健泰科生物技术公司 | 抗cd79b抗体和免疫偶联物及使用方法 |
| EP3692988A3 (en) | 2008-03-18 | 2020-10-14 | Genentech, Inc. | Combinations of an anti-her2 antibody-drug conjugate and 5-fu, anti-vegf antibody, carboplatin or abt-869 and methods of use |
| CA2757382A1 (en) | 2009-04-01 | 2010-10-21 | Kristi Elkins | Anti-fcrh5 antibodies and immunoconjugates |
| TW201129380A (en) | 2009-12-04 | 2011-09-01 | Genentech Inc | Methods of treating metastatic breast cancer with trastuzumab-MCC-DM1 |
| EP2640727B1 (en) | 2010-11-17 | 2015-05-13 | Genentech, Inc. | Alaninyl maytansinol antibody conjugates |
| US8852435B2 (en) * | 2011-11-29 | 2014-10-07 | Therapeutics Proteins International, LLC | Purification and separation treatment assembly (PASTA) for biological products |
| US10208125B2 (en) | 2013-07-15 | 2019-02-19 | University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education | Anti-mucin 1 binding agents and uses thereof |
| TWI541022B (zh) | 2013-12-18 | 2016-07-11 | 應克隆公司 | 針對纖維母細胞生長因子受體－３（ｆｇｆｒ３）之化合物及治療方法 |
| TW201711702A (zh) | 2015-06-04 | 2017-04-01 | 應克隆公司 | 使用針對纖維母細胞生長因子受體３（ｆｇｆｒ３）之化合物的療法 |
| SI3319995T1 (sl) | 2015-07-07 | 2019-07-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Kombinirana terapija s konjugatom protitelo anti-HER-2 in zdravilo ter zaviralcem bcl-2 |
| CN113444106A (zh) * | 2020-03-25 | 2021-09-28 | 重庆乾泰生物医药有限公司 | 一种高纯度安丝菌素的制备方法 |
| CN112630368A (zh) * | 2020-12-18 | 2021-04-09 | 卓和药业集团有限公司 | 安丝菌素含量的高效液相色谱检测分析方法 |
| CN117597450A (zh) * | 2021-06-18 | 2024-02-23 | 杭州中美华东制药有限公司 | 安丝菌素p-3的提纯方法 |
Family Cites Families (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2241418A1 (de) | 1972-08-23 | 1974-03-07 | S Morris Kupchan | Antileukaemische ansamakrolide |
| JPS53124692A (en) | 1977-04-01 | 1978-10-31 | Takeda Chem Ind Ltd | Preparation of maytansinol, maytansine, and maytansinol, propionate |
| JPS6010718B2 (ja) | 1977-03-31 | 1985-03-19 | 武田薬品工業株式会社 | メイタンシノ−ル，メイタナシンおよびメイタンシノ−ル・プロピオネ−トの製造法 |
| US4151042A (en) | 1977-03-31 | 1979-04-24 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Method for producing maytansinol and its derivatives |
| JPS6034556B2 (ja) * | 1977-03-31 | 1985-08-09 | 武田薬品工業株式会社 | 抗生物質ｃ−１５００３ |
| JPS53130495A (en) * | 1977-04-01 | 1978-11-14 | Takeda Chem Ind Ltd | Antibiotic substance c-15003 |
| US4162940A (en) | 1977-03-31 | 1979-07-31 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Method for producing Antibiotic C-15003 by culturing nocardia |
| US4137230A (en) | 1977-11-14 | 1979-01-30 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Method for the production of maytansinoids |
| JPS6016236B2 (ja) | 1977-11-18 | 1985-04-24 | 武田薬品工業株式会社 | 抗生物質ｃ―１５００３ ｐ―３の製造法 |
| US4307016A (en) | 1978-03-24 | 1981-12-22 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Demethyl maytansinoids |
| JPS5529972A (en) | 1978-08-24 | 1980-03-03 | Takeda Chem Ind Ltd | Preparation of maytansinol |
| JPS55102583A (en) | 1979-01-31 | 1980-08-05 | Takeda Chem Ind Ltd | 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound |
| JPS55162791A (en) | 1979-06-05 | 1980-12-18 | Takeda Chem Ind Ltd | Antibiotic c-15003pnd and its preparation |
| JPS5645483A (en) | 1979-09-19 | 1981-04-25 | Takeda Chem Ind Ltd | C-15003phm and its preparation |
| JPS56102793A (en) * | 1979-12-28 | 1981-08-17 | Takeda Chem Ind Ltd | Preparation of antibiotic c-15003 p-3 |
| JPS57192389A (en) | 1981-05-20 | 1982-11-26 | Takeda Chem Ind Ltd | Novel maytansinoid |
| CA2006408A1 (en) | 1988-12-27 | 1990-06-27 | Susumu Iwasa | Bispecific monoclonal antibody, its production and use |
| US5208020A (en) | 1989-10-25 | 1993-05-04 | Immunogen Inc. | Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use |
| DE10012120A1 (de) | 2000-03-13 | 2001-09-27 | Ktb Tumorforschungs Gmbh | Therapeutische und diagnostische Ligandensysteme mit Transportmolekülbindenden Eigenschaften und diese enthaltende Arzneimittel |
| US6573074B2 (en) * | 2000-04-12 | 2003-06-03 | Smithkline Beecham Plc | Methods for ansamitocin production |
| AU2001266853B2 (en) | 2000-06-14 | 2005-02-17 | Medarex, Inc. | Prodrug compounds with an oligopeptide having an isoleucine residue |
| US6333410B1 (en) | 2000-08-18 | 2001-12-25 | Immunogen, Inc. | Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids |
| US20020156274A1 (en) | 2001-03-16 | 2002-10-24 | Terfloth Gerald J. | Process for preparing maytansinol |
| US6441163B1 (en) | 2001-05-31 | 2002-08-27 | Immunogen, Inc. | Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents |
| US6790954B2 (en) * | 2002-01-29 | 2004-09-14 | Immunogen, Inc. | Mutant Actinosynnema pretiosum strain with increased maytansinoid production |
| WO2005020883A2 (en) * | 2003-05-08 | 2005-03-10 | Immunogen, Inc. | Methods for the production of ansamitocins |
| US7276497B2 (en) | 2003-05-20 | 2007-10-02 | Immunogen Inc. | Cytotoxic agents comprising new maytansinoids |
-
2005
- 2005-01-19 US US11/037,104 patent/US7432088B2/en active Active
- 2005-12-12 CN CNA2005800468716A patent/CN101103120A/zh active Pending
- 2005-12-12 TR TR2019/01647T patent/TR201901647T4/tr unknown
- 2005-12-12 ZA ZA200704918A patent/ZA200704918B/xx unknown
- 2005-12-12 KR KR1020077014650A patent/KR20070099576A/ko not_active Application Discontinuation
- 2005-12-12 WO PCT/US2005/044783 patent/WO2006078368A1/en active Application Filing
- 2005-12-12 NZ NZ555437A patent/NZ555437A/en unknown
- 2005-12-12 EP EP05853651A patent/EP1838863A4/en not_active Withdrawn
- 2005-12-12 EP EP12002069.8A patent/EP2514828B1/en active Active
- 2005-12-12 HU HUE12002069A patent/HUE042312T2/hu unknown
- 2005-12-12 CN CN201510127907.9A patent/CN104745655A/zh active Pending
- 2005-12-12 ES ES12002069T patent/ES2710875T3/es active Active
- 2005-12-12 AU AU2005325166A patent/AU2005325166B2/en active Active
- 2005-12-12 SG SG201000399-4A patent/SG158905A1/en unknown
- 2005-12-12 BR BRPI0519624A patent/BRPI0519624B8/pt active IP Right Grant
- 2005-12-12 MX MX2007008069A patent/MX2007008069A/es active IP Right Grant
- 2005-12-12 CA CA2834033A patent/CA2834033C/en active Active
- 2005-12-12 SI SI200532244T patent/SI2514828T1/sl unknown
- 2005-12-12 DK DK12002069.8T patent/DK2514828T3/en active
- 2005-12-12 LT LTEP12002069.8T patent/LT2514828T/lt unknown
- 2005-12-12 KR KR1020127016486A patent/KR20120099734A/ko active Search and Examination
- 2005-12-12 CA CA2595024A patent/CA2595024C/en active Active
- 2005-12-12 PL PL12002069T patent/PL2514828T3/pl unknown
- 2005-12-12 KR KR1020137010509A patent/KR101515873B1/ko active IP Right Grant
- 2005-12-12 PT PT12002069T patent/PT2514828T/pt unknown
- 2005-12-12 EA EA200701310A patent/EA012524B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2005-12-12 JP JP2007552126A patent/JP5106120B2/ja active Active
- 2005-12-12 NZ NZ583446A patent/NZ583446A/en unknown
-
2007
- 2007-06-14 IL IL183918A patent/IL183918A/en active IP Right Grant
- 2007-07-04 CR CR9228A patent/CR9228A/es unknown
- 2007-08-17 NO NO20074222A patent/NO342876B1/no unknown
-
2011
- 2011-10-10 IL IL215686A patent/IL215686A/en active IP Right Grant
-
2015
- 2015-12-29 HK HK15112783.9A patent/HK1211985A1/zh unknown
-
2019
- 2019-02-13 CY CY20191100195T patent/CY1121372T1/el unknown
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101319241B (zh) * | 2008-07-17 | 2011-03-30 | 上海交通大学 | 安丝菌素的固体发酵方法 |
| CN101921817A (zh) * | 2010-09-07 | 2010-12-22 | 上海交通大学 | 安莎霉素发酵产量提高方法 |
| CN103255184A (zh) * | 2012-02-15 | 2013-08-21 | 百奥泰生物科技(广州)有限公司 | 生产安丝菌素的发酵培养基 |
| CN103255184B (zh) * | 2012-02-15 | 2016-01-27 | 百奥泰生物科技(广州)有限公司 | 生产安丝菌素的发酵培养基 |
| CN103805648A (zh) * | 2012-11-13 | 2014-05-21 | 百奥泰生物科技(广州)有限公司 | 高产安丝菌素发酵工艺 |
| CN105907681A (zh) * | 2016-05-30 | 2016-08-31 | 苏州康聚生物科技有限公司 | 一种高产安丝菌素p-3的突变株及安丝菌素p-3的制备方法 |
| CN105907681B (zh) * | 2016-05-30 | 2019-11-19 | 苏州康聚生物科技有限公司 | 一种高产安丝菌素p-3的突变株及安丝菌素p-3的制备方法 |
| CN108276427A (zh) * | 2018-01-14 | 2018-07-13 | 常州大学 | 一种安丝菌素p-3的提取与分离纯化方法 |
| CN108330113A (zh) * | 2018-03-08 | 2018-07-27 | 山东省医药生物技术研究中心（山东省病毒研究所） | 一株高底物专一性酰基转移酶的珍贵束丝放线菌及其应用 |
| CN115477658A (zh) * | 2022-10-12 | 2022-12-16 | 道中道（菏泽）制药有限公司 | 一种有效降低安丝菌素p-3杂质的结晶方法 |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101103120A (zh) | 用于制备安丝菌素的方法 | |
| EP2123765B1 (en) | Method for production of microbial fermentation product | |
| JP2728406B2 (ja) | 抗性物質ａ／１６６８６複合体の製造方法 | |
| JP2628119B2 (ja) | 抗生物質の製造方法 | |
| WO1997006128A1 (en) | Selective process for the deacylation of acylated compounds | |
| EP0028511B1 (en) | Cephalosporins, processes for their preparation and microorganisms capable of their production | |
| WO2005020883A2 (en) | Methods for the production of ansamitocins | |
| AU2012201869B2 (en) | Methods for the production of ansamitocins | |
| US5126254A (en) | Process for preparation of streptovaricin | |
| CA2580123A1 (en) | Process for isolation of macrolide compounds | |
| JPH10508476A (ja) | 抗生物質ｇｅ２２７０因子ｄ▲下２▼を得るための微生物変換法 | |
| AU654382B2 (en) | Recovery process for antibiotics LL-E19020 alpha and beta | |
| JPH03219887A (ja) | ストレプトバリシンの製造方法 | |
| JP2001292790A (ja) | 新規な４−ハロゲン化−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法 | |
| JPH05211881A (ja) | ストレプトバリシンの発酵生産方法 | |
| GB1585661A (en) | Clavam derivatives |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1108920 Country of ref document: HK |
|
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 128 Sydney street, Cambridge, Massachusetts, USA Applicant after: Immunogen Inc. Address before: 128 Sydney street, Cambridge, Massachusetts, USA Applicant before: Immunogen Inc. |
|
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20080109 |
|
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: WD Ref document number: 1108920 Country of ref document: HK |