CN101921817A - 安莎霉素发酵产量提高方法 - Google Patents

安莎霉素发酵产量提高方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101921817A
CN101921817A CN 201010274799 CN201010274799A CN101921817A CN 101921817 A CN101921817 A CN 101921817A CN 201010274799 CN201010274799 CN 201010274799 CN 201010274799 A CN201010274799 A CN 201010274799A CN 101921817 A CN101921817 A CN 101921817A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fermentation
ansamycin
meant
raising method
seed
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN 201010274799
Other languages
English (en)
Inventor
钟建江
贾永亮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Jiaotong University
Original Assignee
Shanghai Jiaotong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Jiaotong University filed Critical Shanghai Jiaotong University
Priority to CN 201010274799 priority Critical patent/CN101921817A/zh
Publication of CN101921817A publication Critical patent/CN101921817A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

一种生物工程技术领域的安莎霉素发酵产量提高方法，通过采用甘油融化接种于种子培养基并进行培养操作，并经二次培养后得到二级种子，然后通过对二级种子进行摇瓶培养并将浓度为1M的硫酸镁水溶液添加至发酵摇瓶中进行发酵处理，然后将发酵摇瓶经摇床培养后实现发酵生产。本发明发酵水平高，操作简单且成本低，便于大规模生产。

Description

安莎霉素发酵产量提高方法
技术领域
本发明涉及的是一种生物工程技术领域的方法，具体是一种安莎霉素发酵产量提高方法。
背景技术
安莎霉素(Ansamitocin)是珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)产生的美登素衍生物，其母核为19-C的大环内酰胺环，C-3连接不同长度的碳链，主要活性成份安莎霉素AP-3(AP-3)，其侧链为异丁酰基，在低浓度下可抑制非白血性白血病细胞系及人类固体肿瘤。由于肠胃副效应及神经毒性，其研究还停留在临床二阶段。然而，由于Ansamitocin可在临床一期中作为抗体毒素结合物及免疫结合物，有重要的应用潜力。
安莎霉素的生物合成途径共包括48个基因(分散在两个基因簇)，其中asm2，8，18，29，31，34，39和asm40为调节基因；asm22-24和asm43-47负责安莎霉素起始单位的合成，asm13-17负责延伸单位methoxymalonyl-ACP的合成。研究表明，敲除或过表达asm2均能提高安莎霉素活性成份AP-3的产量，另外，过表达asm39也能有效地提高AP-3产量。敲除结构基因asm14，15，19和asm24等检测不到产物AP-3。在安莎霉素发酵方面，Bandi等报道了利用响应面法(RSM)优化野生型和asm2突变株的发酵培养基，最大AP-3产率分别为5mg/(L.d)和8.7mg/(L.d)。
目前，已报道的野生型珍贵橙色束丝放线菌产Ansamitocin主要为液体发酵，产量在12mg/L-60mg/L之间。
金属离子对微生物的生长发酵具有巨大的影响，参与生物体内许多酶活力的调节，例如镁离子是糖代谢过程中许多关键酶的辅因子。
经过对现有技术的检索发现，目前考虑提高AP-3的产量的方法主要集中在氮源和碳源，例如通过PB设计、响应面法及中心组合法优化的氮源有蛋白胨和酵母粉，碳源有蔗糖和糊精。氮源是用来构成菌体蛋白质、核酸等含氮物质，以及抗生素等含氮代谢产物。但是该技术成本高，培养基组分复杂，成分不确定，重复性差，且给研究机理带来了困难，对后续分离提取带来了很大的困难。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种安莎霉素发酵产量提高方法，通过在培养基中添加镁离子使安莎霉素的发酵产量获得显著提高。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：
第一步、首先配置种子培养基，采用甘油融化接种于种子培养基并进行培养操作，获得一级种子，经二次培养得到二级种子；
所述的种子培养基的组分及重量百分比为：酵母提取物0.4％、麦芽糖1％、葡萄糖0.4％，加入98.2％蒸馏水并搅拌后调节pH值为7.45。
所述的甘油融化接种是指按0.5％-1.0％接种量，采用-70℃保存的甘油管经融化后融化接种于种子培养基。
所述的培养操作是指：在25-32℃环境下培养24-60h。
所述的二次培养是指：取一级种子按1.0-3.0％的接种量接种于种子培养基并进行培养操作。
第二步、配置发酵培养基，并将二级种子进行摇瓶培养；
所述的配置发酵培养基是指：配取组分及质量百分比分别为：酵母提取物1％、玉米粉滤液2％、葡萄糖0.5％、甘油4％、磷酸氢二钾0.05％、七水和硫酸亚铁0.0002％以及碳酸钙0.5％，加入91.498％蒸馏水并搅拌后调节pH值为7.45。
所述的摇瓶培养是指：将二级种子按1.0-3.0％接种量接种于含有发酵培养基的发酵摇瓶中。
第三步、将浓度为1M的硫酸镁水溶液添加至发酵摇瓶中进行发酵处理，然后将发酵摇瓶经摇床培养后实现发酵生产。
所述的发酵处理是指：发酵后的发酵摇瓶中镁离子浓度为0.1-20mM。
所述的摇床培养是指：将发酵摇瓶转入摇床并在25-32℃，150-300rpm条件下培养5-12天。
本发明与现有技术相比，发酵水平高，已明显超过原工艺的水平；操作简单且成本低，便于大规模生产。
附图说明
图1为实施例中以玉米粉滤液为碳源的效果示意图。
图2为实施例中以荞麦粉滤液为碳源的效果示意图。
图3为实施例中以玉米粉滤液为碳源的效果比较图。
图4为实施例中以荞麦粉滤液为碳源的效果比较图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
采用的菌种：珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum ATCC31565)，该菌种通过美国马里兰洲洛克菲勒的美国标准生物品收藏中心(ATCC)购得。
种子培养：种子培养基成份为酵母提取物质0.4％、麦芽糖1％、葡萄糖0.4％。甘油管接种于一级种子培养基，25-32℃培养24-60h，按1.0-3.0％接种量接种于二级种子培养基，25-32℃培养24-60h。
发酵培养：发酵培养基为酵母提取物1％、玉米粉滤液2％、葡萄糖0.5％、甘油4％、磷酸氢二钾0.05％、七水和硫酸亚铁0.0002％、碳酸钙0.5％，然后配置1M的硫酸镁水溶液并添加至上述发酵液中进行发酵，投入到摇瓶中的镁离子浓度为0.1-20mM。按1.0-3.0％接种量接种于发酵摇瓶中，150-300r/min，25-32℃旋转式摇床进行发酵，培养5-12d。
样品处理及检测方法：发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，然后经过浓缩，溶于甲醇，过滤后低温保存或直接HPLC检测。
如图1所示，结果表明当不同浓的镁离子添加后安莎霉素产量与对照相比均有较大提高，当镁离子添加浓度为2mM时效果最好，最高可达65mg/L，与对照相比提高近4倍。
实施例2
采用的菌种：同实施例1；
种子培养：同实施例1；
发酵培养：同实施例1，玉米粉滤液改为荞麦粉滤液，将一定量的镁离子溶液添加初始料中进行发酵，投入到摇瓶中后的镁离子浓度为0.1-20mM。；
样品处理及检测方法：同实施例1。
如图2所示，结果表明当不同浓度的镁离子添加后安莎霉素产量与对照相比均有较大提高，当镁离子添加浓度为2mM时效果最好，最高可达85mg/L，与对照相比提高近3倍。
实施例3
采用的菌种：同实施例1；
种子培养：同实施例1；
发酵培养：同实施例1，分别在0，24，48，72h添加2mM镁离子。
样品处理及检测方法：同实施例1。
如图3所示，结果表明在第0h添加镁离子效果最显著。
实施例4
采用的菌种：同实施例1；
种子培养：同实施例1；
发酵培养：同实施例1，玉米粉滤液改为荞麦粉滤液分别在0，24，48，72h添加2mM镁离子；
样品处理及检测方法：同实施例1。
如图4所示，结果表明在第0h添加镁离子效果最显著。
从上述实施例可见，玉米粉滤液为碳源的发酵液中添加2mM镁离子后，效价提高了近4倍，最高可达60mg/L，荞麦粉滤液为碳源的发酵液中添加2mM镁离子后与对照相比提高近3倍，最高可达85mg/L。综上所述，通过将荞麦粉滤液作为碳源，AP-3产量由原来的15mg/L提高到30mg/L，提高了一倍；进一步添加1M的硫酸镁水溶液后能够有效提高发酵效价。

Claims (9)

1.一种安莎霉素发酵产量提高方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步、首先配置种子培养基，采用甘油融化接种于种子培养基并进行培养操作，获得一级种子，经二次培养得到二级种子；
第二步、配置发酵培养基，并将二级种子进行摇瓶培养；
第三步、将浓度为1M的硫酸镁水溶液添加至发酵摇瓶中进行发酵处理，然后将发酵摇瓶经摇床培养后实现发酵生产。
2.根据权利要求1所述的安莎霉素发酵产量提高方法，其特征是，所述的种子培养基的组分及重量百分比为：酵母提取物0.4％、麦芽糖1％、葡萄糖0.4％，加入98.2％蒸馏水并搅拌后调节pH值为7.45。
3.根据权利要求1所述的安莎霉素发酵产量提高方法，其特征是，所述的甘油融化接种是指按0.5％-1.0％接种量，采用-70℃保存的甘油管经融化后融化接种于种子培养基。
4.根据权利要求1所述的安莎霉素发酵产量提高方法，其特征是，所述的培养操作是指：在25-32℃环境下培养24-60h。
5.根据权利要求1所述的安莎霉素发酵产量提高方法，其特征是，所述的二次培养是指：取一级种子按1.0-3.0％的接种量接种于种子培养基并进行培养操作。
6.根据权利要求1所述的安莎霉素发酵产量提高方法，其特征是，所述的配置发酵培养基是指：配取组分及质量百分比分别为：酵母提取物1％、玉米粉滤液2％、葡萄糖0.5％、甘油4％、磷酸氢二钾0.05％、七水和硫酸亚铁0.0002％以及碳酸钙0.5％，加入91.498％蒸馏水并搅拌后调节pH值为7.45。
7.根据权利要求1所述的安莎霉素发酵产量提高方法，其特征是，所述的摇瓶培养是指：将二级种子按1.0-3.0％接种量接种于含有发酵培养基的发酵摇瓶中。
8.根据权利要求1所述的安莎霉素发酵产量提高方法，其特征是，所述的发酵处理是指：发酵后的发酵摇瓶中镁离子浓度为0.1-20mM。
9.根据权利要求1所述的安莎霉素发酵产量提高方法，其特征是，所述的摇床培养是指：将发酵摇瓶转入摇床并在25-32℃，150-300rpm条件下培养5-12天。
CN 201010274799 2010-09-07 2010-09-07 安莎霉素发酵产量提高方法 Pending CN101921817A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201010274799 CN101921817A (zh) 2010-09-07 2010-09-07 安莎霉素发酵产量提高方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201010274799 CN101921817A (zh) 2010-09-07 2010-09-07 安莎霉素发酵产量提高方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101921817A true CN101921817A (zh) 2010-12-22

Family

ID=43337032

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 201010274799 Pending CN101921817A (zh) 2010-09-07 2010-09-07 安莎霉素发酵产量提高方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101921817A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102732581A (zh) * 2012-07-18 2012-10-17 上海交联药物研发有限公司 一种高表达安丝菌素p-3的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4228239A (en) * 1977-11-18 1980-10-14 Takeda Chemical Industries, Ltd Method for producing antibiotic C-15003 P-3
US4356265A (en) * 1979-12-28 1982-10-26 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of antibiotic C-15003 P-3
CN101103120A (zh) * 2005-01-19 2008-01-09 免疫基因公司 用于制备安丝菌素的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4228239A (en) * 1977-11-18 1980-10-14 Takeda Chemical Industries, Ltd Method for producing antibiotic C-15003 P-3
US4356265A (en) * 1979-12-28 1982-10-26 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of antibiotic C-15003 P-3
CN101103120A (zh) * 2005-01-19 2008-01-09 免疫基因公司 用于制备安丝菌素的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《Bioresource Technology》 20110822 Yongliang Jia et al Enhanced production of ansamitocin P-3 by addition of Mg2+ in fermentation of Actinosynnema pretiosum 10147-10150 第102卷, *
《J Ind Microbiol Biotechnol》 20091231 Daniel Ng et al Constitutive overexpression of asm2 and asm39 increases AP-3 production in the actinomycete Actinosynnema pretiosum 1345-1351 第36卷, *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102732581A (zh) * 2012-07-18 2012-10-17 上海交联药物研发有限公司 一种高表达安丝菌素p-3的方法
CN102732581B (zh) * 2012-07-18 2014-07-16 上海交联药物研发有限公司 一种高表达安丝菌素p-3的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109439701B (zh) 生物合成制备麦角硫因的方法和发酵培养基
CN102796673A (zh) 一株阿魏酸酯酶生产菌株及应用该菌株生产阿魏酸酯酶的方法
CN112831421B (zh) 一种头孢菌素类化合物生产菌株及其应用
CN100532536C (zh) 一株高产核酸酶p1的桔青霉菌及其选育方法
CN103882080A (zh) 一种制备阿维菌素的有效方法
CN103451133A (zh) 一种环状芽孢杆菌及其在制备阿魏酸脱羧酶中的应用
CN112094750B (zh) 一种用于生产麦角硫因的米根霉
CN106010980A (zh) 一种内生真菌巴西类壳小圆孢菌株及其应用
CN108823110B (zh) 一株产灰黄霉素的菌株及其应用
CN108841889B (zh) 利用微生物发酵生产松刚霉素主份——灰黄霉素的方法
CN102417890B (zh) 一株草木樨中华根瘤菌及应用其发酵产锰过氧化物酶的方法
CN104277989A (zh) 一株面包酵母及其在发酵生产辅酶i中的应用
CN101851591B (zh) 一种纤维堆囊菌生产埃坡霉素b的发酵方法及发酵培养基
Phaff Industrial microorganisms
CN116200286B (zh) 一株高效糖化纤维素的热纤梭菌及其应用
CN110885764A (zh) 一种冠突散囊菌富硒菌株及驯化和发酵方法
CN105505798A (zh) 一种产麦角甾醇内生真菌及其应用
CN101921817A (zh) 安莎霉素发酵产量提高方法
CN101319241B (zh) 安丝菌素的固体发酵方法
CN104278070A (zh) 一种提高桑黄液体发酵产物中麦角甾醇含量的方法
CN101717789B (zh) 一种高效产红色素培养基的制备方法
CN101955890B (zh) 一株镉盐抗性面包酵母及其应用
CN102154137A (zh) 一株温度耐受性酿酒酵母及其应用
CN110923152A (zh) 一种冠突散囊菌富锌菌株及驯化和发酵方法
CN103740781B (zh) 一种培养游动放线菌获取雷帕霉素发酵液的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20101222