CN102732581B - 一种高表达安丝菌素p-3的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高表达安丝菌素P-3的方法，属于微生物发酵技术领域。通过珍贵橙色束丝放线菌表达的安丝菌素总量一般在10-50mg/L，AP-3一般占比不到50%。本发明的目的在于提供一种珍贵橙色束丝放线菌发酵产生安丝菌素的方法，该方法可以高表达安丝菌素P-3。本发明通过合理的发酵培养基成分的配比、发酵温度、溶氧和pH的控制实现安丝菌素的高表达和单一成分安丝菌素P-3占比的提升，使安丝菌素P-3的表达量达到100mg/L以上，其中安丝菌素P-3占全部安丝菌素比例在70%以上。

Description

一种高表达安丝菌素P-3的方法

技术领域

本发明涉及一种微生物发酵技术领域，具体涉及一种从珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素P-3的方法。

背景技术

安丝菌素(Ansamitocin)是一种微管蛋白抑制剂。它通过与微管蛋白的结合从而拮抗微管蛋白组装，其作用位点与长春花碱相同。他的细胞毒性传统化疗药物长春新碱、甲氨蝶呤和柔红霉素的100-1000倍。安丝菌素的母核是大环内酯类美登醇，其同系物包括植物来源的美登素和美登普林等。

已发现几种放线菌可以表达安丝菌素，包括珍贵橙色束丝放线菌，主要产物为6种安丝菌素同系物，包括安丝菌素P-0、P-1、P-2、P-3、P-3'、P-4、P-4’，结构如下式所示：

主要区别为C-3位羟基上酯基的不同，通常作为前体化合物用于合成其他美登木素化合物，如美登素1（DM1）。美登木素类化合物因其强细胞毒性而在肿瘤治疗领域受到极大关注，但是因为强烈的毒副作用临床失败。目前临床上通过交联技术将美登木素生物碱（maytansinoids）与抗体交联靶向治疗取得了积极的疗效和较低的毒副作用。美登木素类物质在植物中的含量极低，植物提取的效率低、成本高；美登素的结构复杂，全合成的收率低、成本高，不具备实际应用价值；因此需要通过生物发酵分离其前体化合物，再进一步合成美登木素。安丝菌素P-2、P-3通常是所有安丝菌素中表达较高的，安丝菌素P-3结构稳定、疏水性强易于萃取，是合成美登素的最佳前体，安丝菌素P-3的选择性高表达有利于降低美登素的制备成本，同时减少杂质的产生，利用药品制备。

通过珍贵橙色束丝放线菌(CPCC260982、ATCC31281，属名:Actinosynnema,)制备安丝菌素的工艺已经有研究。美国专利US4331598和US4450234中，珍贵橙色束丝放线菌发酵产生的安丝菌素主要是AP-1、AP-2、AP-3、AP-3′、AP-4和AP-4'，都可以通过化学转变成美登木素生物碱，用于医疗用途。通常珍贵橙色束丝放线菌表达的安丝菌素总量一般在10-50mg/L，AP-3一般占比不到50%。且由于表达物为多种安丝菌素混合物，还有不少不希望产生的安丝菌素，如N-脱甲基、20-O-脱甲基以及19-脱氯处被修饰的产物，在还原性脱酰作用下这些安丝菌素不会变成美登木醇。不利于将来进行化学改造成美登木生物碱。

安丝菌素的总产量一般在10-50mg/L范围，产量低、生产成本高，且为多种安丝菌素同系物的混合物，不易分离。典型地，通过多步骤工艺回收并提纯安丝菌素，如AP-3，往往需要经过有机物萃取、重结晶、硅胶/氧化铝层析和析晶进一步提纯获得。

安丝菌素分离纯化工艺繁琐且涉及诸多的有毒的有机溶剂步骤，进行大规模的生产非常困难，且成本较高，因此提高最终目标物，安丝菌素，特别是主要产物AP-3的表达量，具有十分重要的经济意义。寻找高表达的菌株或通过发酵工艺改进提高安丝菌素的总表达量以及单一安丝菌素的占比对于安丝菌素的生产具有重要现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种珍贵橙色束丝放线菌(CPCC260982)发酵产生安丝菌素的方法，该方法可以高表达安丝菌素P-3。

本发明的主要技术方案是，选用珍贵橙色束丝放线菌，通过合理的发酵培养基成分的配比、发酵温度、溶氧和pH的控制实现安丝菌素的高表达和单一成分安丝菌素P-3占比的提升，使安丝菌素P-3的表达量达到100mg/L以上，其中安丝菌素P-3占全部安丝菌素比例在70%以上。

本发明提供一种珍贵橙色束丝放线菌发酵产生安丝菌素P-3的方法，包括如下步骤：

用珍贵橙色束丝放线菌（CPCC260982）在液体发酵培养基中培养，液体发酵培养基中含有2-10%的碳源、1-5%的氮源和0.1-2%的短链脂肪醇；发酵过程的pH值为6.5-7.5；温度为26-30℃；溶氧控制20%以上；

所述的碳源选自葡萄糖、果糖、淀粉、蔗糖、麦芽糖、麦芽提取物或甘油中的一种或两种以上。

所述的氮源选自蛋白胨、牛肉汤、酵母提取物、KNO₃、大豆粉、大豆胨、玉米浆、棉籽饼粉或棉籽饼浸出粉中的一种或两种以上。

所述的短链脂肪醇选自正丙醇、异丙醇、正丁醇或异丁醇。

所述的在液体发酵培养基中培养，培养条件是静止、振荡、通气浸没等。为在大容量的发酵器中较好的培养珍贵橙色束丝放线菌并实现高产量，优选通气浸没培养。

pH值优选7.0；温度优选28度；溶氧优选控制30%以上。

发酵的典型时间为120h至360h。

本发明可实现安丝菌素P-3的高表达，安丝菌素P-3表达量达到100mg/L以上，安丝菌素P-3占全部安丝菌素表达量的70%以上。

较佳地，液体发酵培养基中还含有0.01-0.2%的微量元素，所述的微量元素选自CoCl₂、FeSO₄或MgSO₄中的一种或两种以上。

较佳地，所述的液体发酵培养基中含有0.5-1.5%的酵母提取物、1-5%的可溶性淀粉、0.5-1.5%葡萄糖、0.1-1%的果糖、0.5-4%的麦芽提取物、0.5-3%的大豆粉、0.05-0.2%的K₂HPO₄、0.5%的碳酸钙、0.0005-0.005%的FeSO₄·7H2O、0.01-0.1%的MgSO₄·7H₂O、0.1-2%的异丁醇、0.005-0.05%的酪氨酸。

最佳地，所述的液体发酵培养基中含有0.5%的酵母提取物、2%的可溶性淀粉、0.5%的葡萄糖、0.5%的果糖、1%的麦芽提取物、2%的大豆粉、0.05%的K₂HPO₄、0.5%的碳酸钙、0.001%的FeSO₄·7H₂O、0.05%的MgSO₄·7H₂O、0.3%的异丁醇，消泡剂0.2%，pH7.0（发酵培养基配方JF-21）。

所述的液体发酵培养基中含有0.5%的酵母提取物、2%的可溶性淀粉、0.5%的葡萄糖、1%的麦芽提取物、1%的大豆粉、0.05%的K₂HPO₄、0.5%的碳酸钙、0.001%的FeSO₄·7H₂O、0.05%的MgSO₄ 7H₂O、0.3%的异丁醇、pH7.0（发酵培养基JF-06）。

以上百分比均为重量百分比，其余量为水。

进一步地，本发明提供的一种珍贵橙色束丝放线菌发酵产生安丝菌素P-3的方法，还包括如下步骤：

发酵前培养：配制种子培养基，采用甘油融化接种于种子培养基并进行培养操作，获得一级种子，经二次培养得到二级种子，二级种子接种到液体发酵培养基进行发酵；

所述的种子培养基的组分及重量百分比为：甘油1%;葡萄糖1%;蛋白胨1%;酵母提取物0.5%；pH7.2；

所述的甘油融化接种是指-70℃保存的甘油种经融化后接种于种子培养基；

所述的培养操作是指在26-32℃环境下培养24-72h；

所述的二次培养是指：取一级种子按0.5-3.0%的接种量接种于种子培养基并进行培养操作。

进一步地，当二级接种后培养24h至48h后补加葡萄糖和蛋白质类营养物以及额外添加部分醇类或醛类，如异丁醇、正丁醇、正丙醇、异丙醇、戊醇、戊醛、正丙醛、异丙醛、异丁醛等，以促进C-3酯侧链的形成，直至发酵结束。

较佳地，珍贵橙色束丝放线菌以2-5%的菌密度接种到所述的液体发酵培养基中。

进一步地，本发明提供的一种珍贵橙色束丝放线菌发酵产生安丝菌素P-3的方法，还包括如下步骤：

从发酵液中纯化安丝菌素P-3：体积比为1:1～3:1的乙酸乙酯和乙酸丁酯混合对发酵液进行萃取，萃取比例为1:1，浓缩萃取安丝菌素的有机溶剂层，重结晶，用硅胶或氧化铝吸附层析后蒸馏得到安丝菌素P-3。

本发明的有益效果：

在美国专利US4331598和4450234中，珍贵橙色束丝放线菌发酵产生的安丝菌素主要是AP-1、AP-2、AP-3、AP-3'、AP-4和AP-4'，都可以通过化学转变成美登木素生物碱，用于医疗用途。通常珍贵橙色束丝放线菌表达的安丝菌素总量一般在10-50mg/L，AP-3一般占比不到50%。且由于表达物为多种安丝菌素混合物，还有不少不希望产生的安丝菌素，如N-脱甲基、20-O-脱甲基以及19-脱氯处被修饰的产物，在还原性脱酰作用下这些安丝菌素不会变成美登木醇。不利于将来进行化学改造成美登木生物碱。本发明通过对CPCC260982的发酵培养基配方优化以及发酵条件控制实现较高的安丝菌素P-3表达量，在发酵器中表达量高达100mg/L以上，更优的达到150mg/L以上。安丝菌素P-3的占比达到70%以上，更优的达到80%以上，这非常有利于安丝菌素P-3的后续纯化过程。

附图说明

图1是实施例1发酵液最终安丝菌素P-3的HPLC检测图谱；

图2是实施例2发酵液最终安丝菌素P-3的HPLC检测图谱；

图3是实施例4中安丝菌素P-3粗品溶于DMA的HPLC检测纯度图谱；

图4是实施例6中安丝菌素P-3产物溶于DMA的HPLC检测纯度图谱；

图5是实施例7安丝菌素P-3的质谱检测图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的应用范围。

本发明涉及的酵母提取物、麦芽提取物、蛋白胨购自上海爱紫特生物科技有限公司代理的英国oxiod品牌，可溶性淀粉、果糖、玉米浆购自上海源叶生物科技有限公司，甘油、葡萄糖、大豆粉、碳酸钙、NaNO₃、K₂HPO₄、FeSO₄·7H₂O、MgSO₄·7H₂O、异丁醇购自国药集团化学试剂有限公司；棉籽饼粉购自天津市利发隆化工科技有限公司。

实施例1

1.初级接种：50ml种子培养基加入250ml锥形瓶，加入0.5ml甘油种，28°C恒温200rpm振荡3天。

种子培养基：甘油1%;葡萄糖1%;蛋白胨1%;酵母提取物0.5%；pH7.2。

2.二级接种：4个含有500ml种子培养基的3L锥形瓶中分别接入10ml初级种子培养物接入，28°C恒温200rpm振荡3天。

3.30L发酵罐中，加入18L除菌后的发酵培养基JF-21，接入合并的二级接种培养物2L，初始通气0.5VVM，搅拌速度200rpm，1天后设定为控制溶氧30%，调整溶氧与通气搅拌速度关联，最大通气设定为1VVM，28℃培养6天。

发酵培养基JF-21配方：0.5%的酵母提取物、2%的可溶性淀粉、0.5%的葡萄糖、0.5%的果糖、1%的麦芽提取物、2%的大豆粉、0.05%的K₂HPO₄、0.5%的碳酸钙、0.001%的FeSO₄·7H₂O、0.05%的MgSO₄·7H₂O、0.3%的异丁醇，加水定容至18L，pH7.0。

4.发酵物用乙醇稀释后HPLC检定各突变菌株的安丝菌素表达量，每日检测发酵液中安丝菌素表达量，至安丝菌素表达量不再增长，停止发酵，安丝菌素P-3表达量为114mg/L（如图1所示），远高于已有报道的发酵珍贵橙色束丝放线菌CPCC260982的表达量（10-50mg/L）。

实施例2：

1.初级接种：50ml种子培养基加入250-ml锥形瓶，加入0.5ml甘油种，28°C恒温200rpm振荡3天。

种子培养基：甘油1%;葡萄糖1%;蛋白胨1%;酵母提取物0.5%；pH7.2。

2.二级接种：4个含有500ml种子培养基的3L锥形瓶中分别接入10ml初级种子培养物接入，28°C恒温200rpm振荡3天。

3.30L发酵罐中，加入18L除菌后的发酵培养基JF-06，配方：0.5%的酵母提取物、2%的可溶性淀粉、0.5%的葡萄糖、1%的麦芽提取物、1%的大豆粉、0.05%的K₂HPO₄、0.5%的碳酸钙、0.001%的FeSO₄·7H₂O、0.05%的MgSO₄ 7H₂O、0.3%的异丁醇，加水定容至18L，pH7.0。

4.接入合并的二级接种培养物2L，初始通气0.5VVM，搅拌速度200rpm，30℃培养24h；之后控制溶氧30%，调整溶氧与通气搅拌速度关联，最大通气设定为1VVM，29℃培养24h；从第3天开始以10ml/h速度补加含有10%葡萄糖、10%果糖、7%异丁醇、5%玉米浆的补料液，控制pH在7.0±0.5。发酵持续192-240h，至安丝菌素P-3表达量最高值，表达量达到164mg/L（如图2所示）。

实施例3：安丝菌素发酵中止

实施例1和2可通过加入磷酸将发酵培养液pH调节到6.5.发酵罐加热到75度在该温度下持续1h使微生物灭活，冷却到40度进行有机溶剂萃取。

实施例4：安丝菌素的萃取

实施例2中20L发酵液以1:1（v:v）加入乙酸正丁酯和乙酸乙酯（1:1）的混合物，40度下搅拌方式萃取5h以上，重力分层4h以上，HPLC测定显示85%以上的安丝菌素已经进入有机溶液层。萃取后分离上层有机溶剂，进行减压蒸馏，除去有机溶剂获得粗品安丝菌素4.2g，其中安丝菌素P-3占77.5%（如图3所示）。

实施例5：安丝菌素的重结晶

将实施例4获得的上述步骤中获得的安丝菌素溶解在热的乙酸乙酯中（23ml/g的粗安丝菌素）。保持温度在60-75度之间，至样品完全溶解，缓慢加入庚烷（80ml/g的粗安丝菌素）。将混合液体冷却至室温。过滤回收晶体，接着真空干燥获得较纯的安丝菌素3.5g。

实施例6：

将上述步骤的产物溶于甲苯，用硅胶柱吸附层析，将含有安丝菌素P-3的部分汇总蒸发，得到安丝菌素P-32.5克，安丝菌素P-3纯度93.3%（如图4所示）。

实施例7：安丝菌素P-3的LC-MASS分析

通过HPLC的紫外检测图谱分析安丝菌素P-3的纯度，色谱柱：C18柱（Waters公司，symmetry150mm×4.6mm，5μm）；流动相为含0.05％TFA在乙腈（B）:去离子水（A）梯度洗脱：5分钟30％流动相B，15分钟流动相由30-90％，5分钟100％流动相B，5分钟还原到30％流动相）；流速：1.0ml/min，检测波长为252nm，柱温25℃。

HPLC显示发酵液样品在保留时间13.75min有较高吸收峰（与AP-3标准品一致，如图1所示），经HPLC定量分析样品中AP-3浓度为164mg/L，乙酸丁酯萃取后样品纯度达到77.5%（如图3所示）。Mass分析显示实施6中安丝菌素P-3的分子量为635.3（如图5所示），与AP-3理论分子量一致。

实施例8：

按实施例1实验步骤，以JL-11、JF-16、JF-25发酵培养基配方进行发酵，安丝菌素P-3的表达量分别为110、113和103mg/L，发酵液萃取后安丝菌素P-3纯度均可达到70%以上。而用JL-04和JL-21发酵培养基配方进行发酵的安丝菌素P-3的表达量仅为2.1、12.0和0.5mg/L，分析发酵过程中菌体生长认为，JL-03、JL-04和JL-21发酵配方中营养物中氮源、碳源配比都不理想，JL-04发酵配方试验中菌密度过低，从而最终的表达量也非常低；JL-03和JL-21发酵方案中菌密度较高，但是并未充分进入次级代谢表达安丝菌素，特别是JL-21发酵方案过高的碳源和氮源导致菌体长期处于生长状态导致初级代谢物过度积累反而没有进入次级代谢，并迅速的进入菌体衰亡期，开始溶菌pH显著上升。

以上百分比均为重量百分比，其余量为水。

Claims (9)

1.一种珍贵橙色束丝放线菌发酵产生安丝菌素P-3的方法，包括如下步骤：

用珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema Pretiosum)CPCC260982在液体发酵培养基中培养，所述的液体发酵培养基选自以下A、B或C：

A、液体发酵培养基中含有0.5-1.5%的酵母提取物、1-5%的可溶性淀粉、0.5-1.5%葡萄糖、0.1-1%的果糖、0.5-4%的麦芽提取物、0.5-3%的大豆粉、0.05-0.2%的K₂HPO₄、0.5%的碳酸钙、0.0005-0.005%的FeSO₄·7H₂O、0.01-0.1%的MgSO₄·7H₂O、0.1-2%的异丁醇、0.005-0.05%的酪氨酸；

B、液体发酵培养基中含有0.5%的酵母提取物、2%的可溶性淀粉、0.5%的葡萄糖、0.5%的果糖、1%的麦芽提取物、2%的大豆粉、0.05%的K₂HPO₄、0.5%的碳酸钙、0.001%的FeSO₄·7H₂O、0.05%的MgSO₄·7H₂O、0.3%的异丁醇；

C、液体发酵培养基中含有0.5%的酵母提取物、2%的可溶性淀粉、0.5%的葡萄糖、1%的麦芽提取物、1%的大豆粉、0.05%的K₂HPO₄、0.5%的碳酸钙、0.001%的FeSO₄·7H₂O、0.05%的MgSO₄·7H₂O、0.3%的异丁醇；

发酵过程的pH值为6.5-7.5；温度为26-30℃；溶氧控制20%以上。

2.根据权利要求1所述的一种珍贵橙色束丝放线菌发酵产生安丝菌素P-3的方法，其特征在于所述的在液体发酵培养基中培养，培养条件是通气浸没培养。

3.根据权利要求1所述的一种珍贵橙色束丝放线菌发酵产生安丝菌素P-3的方法，其特征在于pH值为7.0。

4.根据权利要求1所述的一种珍贵橙色束丝放线菌发酵产生安丝菌素P-3的方法，其特征在于温度为28℃。

5.根据权利要求1所述的一种珍贵橙色束丝放线菌发酵产生安丝菌素P-3的方法，其特征在于溶氧优选控制30%以上。

6.根据权利要求1至5任一所述的一种珍贵橙色束丝放线菌发酵产生安丝菌素P-3的方法，其特征在于该方法，还包括如下步骤：

发酵前培养：配制种子培养基，采用甘油融化接种于种子培养基并进行培养操作，获得一级种子，经二次培养得到二级种子，二级种子接种到液体发酵培养基进行发酵；

所述的种子培养基的组分及重量百分比为：甘油1%;葡萄糖1%;蛋白胨1%;酵母提取物0.5%；pH7.2；

所述的甘油融化接种是指-70℃保存的甘油种经融化后接种于种子培养基；

所述的培养操作是指在26-32℃环境下培养24-72h；

所述的二次培养是指：取一级种子按0.5-3.0%的接种量接种于种子培养基并进行培养操作。

7.根据权利要求6所述的一种珍贵橙色束丝放线菌发酵产生安丝菌素P-3的方法，其特征在于当二级接种后培养24h至48h后补加葡萄糖、蛋白质类营养物、醇类或醛类，直至发酵结束。

8.根据权利要求1至5任一所述的一种珍贵橙色束丝放线菌发酵产生安丝菌素P-3的方法，其特征在于珍贵橙色束丝放线菌以2-5%的菌密度接种到所述的液体发酵培养基中。

9.根据权利要求1至5任一所述的一种珍贵橙色束丝放线菌发酵产生安丝菌素P-3的方法，其特征在于该方法，还包括如下步骤：

从发酵液中纯化安丝菌素P-3：体积比为1:1～3:1的乙酸乙酯和乙酸丁酯混合对发酵液进行萃取，萃取比例为1:1，浓缩萃取安丝菌素的有机溶剂层，重结晶，用硅胶或氧化铝吸附层析后蒸馏得到安丝菌素P-3。