CN103555610B - 利普司他汀高产毒三素链霉菌及其发酵培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株利普司他汀高产毒三素链霉菌（streptomyces toxytricini），该菌株能够高效利用油脂，具有高产利普司他汀的性能。另一方面，本发明还提供了一种优化的毒三素链霉菌发酵培养基。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程领域，具体涉及一株毒三素链霉菌，其具有高产利普司他汀性能。本发明还涉及用于该菌株的发酵培养基。
背景技术
利普司他汀是由毒三素链霉菌（streptomyces toxytricini）产生的内源性脂肪酶抑制剂，其四氢衍生物奥利司他是目前唯一一个作为非中枢神经系统作用上市的减肥药[1]。奥利司他已获得FDA认证，目前已占据2/3的减肥药市场。奥利司他能够选择性抑制肠道中的胰脂肪酶活性，作为一种“脂肪阻断剂”，它仅在胃肠道发挥药理作用，可以使得约30%的膳食甘油三酯不被消化吸收，在食物疗法的基础上可以进一步减少热量摄入。奥利司他的高度选择性决定了它对其他酶类无作用，因此不影响碳水化合物、蛋白质和磷脂的吸收。此外，奥利司他可以作为脂肪替代剂，添加在食品中替代其中的脂肪，保留食物原有风味的同时，也降低了膳食中的脂肪含量。
奥利司他目前有两种生产工艺，一种是化学合成法，另外一种是以生物发酵获得利普司他汀，再经加氢获得奥利司他。
Pierre Barbier和Fernand Schneider等[2]提出两种化学合成奥利司他路径：一是从乙基(R)‐3‐羟基‐6‐庚稀醇酯开始合成，经过Witting反应、醇醛缩合反应、羟基保护、酯化反应、加氢等一系列反应制得奥利司他；二是完全对称合成奥利司他，经酮醚和十二烷醛缩合，在进行羟基保护、酮基还原、环化、酯化等反应，最终获得奥利司他。以化学全合成的方式生产奥利司他工艺复杂，反应步骤繁多、反应条件苛刻、收率低、成本高，且易于造成环境污染等问题。
利用发酵制备利普司他汀是近年来主要采用的生产工艺。美国专利文献US2005089978A1采用流加补料以及中间补料的方法优化了利普司他汀的发酵工艺，但是发酵水平仍然较低，产物效价为1.7-1.8g/L。美国专利文献US20110014664A1采用亚油酸、油酸以及γ-9脂肪酸混合培养发酵毒三素链霉菌 生产利普司他汀，产物效价达到5g/L。然而，利用发酵制备利普司他汀仍然面临着发酵产物效价低的问题，严重制约了奥利司他的工业化生产。因此，改良利普司他汀发酵生产方法，包括获取更优良的发酵菌株以及优化发酵培养基，一直是本领域的研发热点。
发明内容
本发明的第一方面提供了一株毒三素链霉菌（streptomyces toxytricini），其保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC M2013357。
本发明的第二方面提供了毒三素链霉菌CCTCC M2013357在生产利普司他汀和/或奥利司他中的用途。
本发明的第三方面提供了一种用于毒三素链霉菌发酵生产利普司他汀的发酵培养基，其含有大豆油50‐60g/L、甘油20‐30g/L、卵磷脂8‐16g/L、黄豆饼粉20‐40g/L和酵母粉0‐20g/L。优选地，该发酵培养基含有大豆油55g/L、甘油20g/L、卵磷脂12g/L、黄豆饼粉30g/L和酵母粉10g/L。
在一个特定的实施方案中，该发酵培养基由大豆油50‐60g/L、甘油20‐30g/L、卵磷脂8‐16g/L、黄豆饼粉20‐40g/L、酵母粉0‐20g/L、(NH4)2SO410g/L和Triton X‐10010g/L组成。最优选地，该发酵培养基由大豆油55g/L、甘油20g/L、卵磷脂12g/L、黄豆饼粉30g/L、酵母粉10g/L、(NH4)2SO410g/L和Triton X‐10010g/L组成。
本发明的第四方面提供了一种利普司他汀发酵生产方法，包括在本发明的发酵培养基中发酵培养本发明的毒三素链霉菌。
在一个特定的实施方案中，发酵条件为空气流量1:1（vvm），搅拌转速500rpm，发酵温度28℃。优选地，发酵时间为140h。
本发明的毒三素链霉菌具有以下优点：
利用本发明的毒三素链霉菌生产利普司他汀，可使得产物效价累积达到10.8g/L，该菌株的高产能力大大提高利普司他汀合成产量，有利于推进利普司他汀的工业化生产。
保藏信息
本发明的毒三素链霉菌（streptomyces toxytricini）BYKY‐20保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC）；地址：中国，武汉，武汉大学；保藏日期：2013年7月31日；保藏号：CCTCC M2013357。
附图说明
图1不同碳源对利普司他汀效价影响。其中，发酵培养基中添加的碳源分别选取淀粉、葡萄糖、甘油、蔗糖、玉米粉。
图2不同的甘油添加量对利普司他汀效价影响。其中，发酵培养基中甘油的添加量选取5g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L的梯度。
图3不同非酵母类氮源对利普司他汀效价影响。其中，发酵培养基中添加的非酵母类氮源分别选取大豆分离蛋白、黄豆饼粉、棉籽蛋白。
图4豆饼粉的添加量对利普司他汀效价影响。其中，发酵培养基中黄豆饼粉的添加量选取20g/L、30g/L、40g/L、45g/L、55g/L的梯度。
图5不同酵母类氮源对利普司他汀效价影响。其中，发酵培养基中添加的酵母类氮源分别选取酵母抽提物、酵母粉、酵母膏。
图6酵母粉添加量对利普司他汀效价的影响。发酵培养基中酵母粉的添加量选取25g/L、35g/L、45g/L、55g/L、65g/L的梯度。
具体实施方式
利普司他汀的效价检测采用高效液相色谱法。
色谱条件：Prevail C18柱，乙腈‐水（86:14）为流动相，柱温30℃，流速1.0ml/min，紫外检测波长210nm。利普司他汀在0.2‐1mg/ml范围内，线性回归比显著（R2=0.9982）。
样品预处理：取0.2ml发酵液，加2.8ml乙腈，超声破壁1h，经9000rpm离心15min，取上清液过膜待测。
实施例1出发菌株诱变
出发菌株为streptomyces toxytricini ATCC19813。
孢子悬浮液的制备：在无菌操作台中，将streptomyces toxytricini ATCC19813接入固体平板培养基（可溶性淀粉10g/L、KNO32g/L、NaCl2g/L、K2HPO42g/L、琼脂2.2g/L，pH7.2，121℃0.1MPa灭菌15min），28℃恒温静置培养48h后，用接种环取培养基表层孢子移入无菌水中，旋转震荡10min。
1.1紫外诱变筛选豆油耐受性菌株
将孢子悬浮液置紫外诱变箱（紫外灯功率30W，波长253nm，直射垂直距离30cm）中诱变处理40s，用黑布包好，用无菌水做梯度稀释后涂布平板，30℃避光培养5‐6天，挑选单菌落转接斜面。
用10g/L的大豆油代替固体平板培养基中的淀粉，并添加0.5g/L乳化剂，制成含大豆油的固体平板培养基（大豆油10g/L、乳化剂0.5g/L、KNO32g/L、NaCl2g/L、K2HPO42g/L、琼脂2.2g/L，pH7.2，121℃0.1MPa灭菌15min）。
紫外线处理后的孢子悬浮液，经过稀释涂布于含大豆油的固体平板培养基，待平板菌落培养成熟后挑取若干株单菌落移种至斜面。单菌落斜面培养成熟后，经摇瓶二级发酵后测定利普司他汀效价。发酵单位高的菌株传子代斜面，并连续进行两次复筛，获得发酵单位高的遗传稳定的菌株（编号streptomyces toxytricini XXYY）。
1.2NTG诱变筛选亮氨酸耐受性菌株
用10g/L亮氨酸代替固体平板培养基中的淀粉，制成含亮氨酸的固体平板培养基（亮氨酸10g/L、KNO32g/L、NaCl2g/L、K2HPO42g/L、琼脂2.2g/L，pH7.2，121℃0.1MPa灭菌15min）。
将紫外诱变筛选出的高产突变菌株streptomyces toxytricini XXYY作为二次出发菌株，制成孢子悬浮液，添加剂量为1mg/ml的NTG处理1min，MV累积照射作用10s。之后经含亮氨酸的固体平板培养基继续筛选，再通过摇瓶发酵、含量测定复筛确证，获得突变菌株streptomyces toxytricini BYKY‐1、streptomyces toxytricini BYKY‐2、streptomyces toxytricini BYKY‐3.streptomyces toxytricini BYKY‐4.streptomyces toxytricini BYKY‐5。
上述突变菌再经过5轮紫外‐NTG复合诱变，经摇瓶发酵、含量测定的复筛程序，最终获得高产利普司他汀突变菌株streptomyces toxytricini BYKY‐20，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC）；地址：中国，武汉，武汉大学；保 藏日期：2013年8月8日；保藏号：CCTCC M2013357。以下实施例2‐4使用streptomyces toxytricini BYKY‐20进行发酵实验。
实施例2发酵培养基中碳源的优化
碳源是组成培养基的主要原材料之一，主要功能是为微生物的生长繁殖提供能力，以及为合成菌体、合成目的产物提供所需的碳成分。在发酵培养基中添加不同种类的碳源，考察不同碳源对微生物的生长和产物合成油显著的差异。
种子培养基：黄豆饼粉20g/L、甘油20g/L、酵母膏7.5g/L、大豆油5g/L、KNO32g/L、MgSO47H2O1g/L，pH7.0‐7.2，121℃0.1MPa灭菌15min。
发酵培养基：黄豆饼粉40g/L、碳源（碳源的具体种类见图1）30g/L、大豆油50g/L、卵磷脂10g/L、酵母粉40g/L、(NH4)2SO410g/L、Triton X‐10010g/L，pH7.0‐7.2，121℃0.1Mpa灭菌15min。
发酵条件：温度27℃，240rpm，装液量25ml/250ml三角瓶，接种量4%，培养时间6天。
如图1所示，采用甘油作为碳源效果最佳，而玉米粉、葡萄糖和蔗糖作为碳源时，发酵效价较低。进一步验证不同的甘油添加量对利普司他汀产量的影响，如图2所示，当甘油的添加量为30g/L时，发酵效果最好。
实施例3发酵培养基中氮源的优化
氮源作为培养基的主要成分之一，主要用于构成菌体的细胞物质，如氨基酸、蛋白质、核酸等，同时也为合成目的产物提供氮成分。培养基中选用酵母类氮源和非酵母类氮源组成的复合氮源有利于发酵产物合成。在发酵培养基中添加不同种类的酵母类氮源和非酵母类氮源，考察不同氮源对微生物的生长和产物合成油显著的差异。
种子培养基和发酵条件同实施例2。
在发酵培养基（非酵母类氮源40g/L、卵磷脂10g/L、甘油30g/L、大豆油50g/L、(NH4)2SO410g/L、Triton X-10010g/L，pH7.0-7.2，121℃0.1MPa灭菌15min）中添加不同种类的非酵母类氮源，发酵结果如图3。从中可看出，添加黄豆饼粉的发酵效果最好。进一步实验验证不同的黄豆饼粉添加量对利普司他汀 产量的影响，如图4所示，当黄豆饼粉的添加量为40g/L时，发酵效果最佳。
在发酵培养基（酵母类氮源40g/L、卵磷脂10g/L、甘油30g/L、大豆油50g/L、(NH4)2SO410g/L、Triton X-10010g/L，pH7.0-7.2，121℃0.1MPa灭菌15min）中添加不同种类的酵母类氮源，发酵结果如图5。从中可看出，酵母类氮源中，添加酵母粉效果最好。添加不同浓度的酵母粉进一步实验，如图6所示，当酵母粉添加量为45g/L时，发酵效果最好。
实施例4发酵培养基配方的最优化
根据实施例2和3中碳源、氮源的单因素实验，设计正交实验方案，确定最优发酵培养基配方。
种子培养基和发酵条件同实施例2。
表1为设计的单因子三水平正交实验，优化发酵培养基（发酵培养基的其它成分及其含量同实施例2和3）。实验结果见表2。
表1正交实验的四因素三水平表
| 水平 | 大豆油(g/L) | 甘油(g/L) | 卵磷脂(g/L) | 黄豆饼粉(g/L)+酵母粉(g/L) |
| 1 | 60 | 30 | 8 | 40+0 |
| 2 | 55 | 25 | 12 | 30+10 |
| 3 | 50 | 20 | 16 | 20+20 |
表2正交实验结果分析表
表2的统计结果表明，对streptomyces toxytricini BYKY‐20发酵，培养基中大豆油添加量影响较大。采取各因素的最佳水平组合的培养基配方为：大豆油55g/L，甘油30g/L，黄豆饼粉30g/L，酵母粉10g/L，卵磷脂12g/L。
实施例5采用优化后的发酵培养基进行放大实验
将活化好的streptomyces toxytricini BYKY‐20新鲜斜面孢子，经种子摇瓶培养24h，培养条件28℃，摇床转速240rpm。按照5%的接种量将种子液接入装有2L按照实施例4优化后的发酵培养基的5L发酵罐中。发酵条件为：空气流量1:1（vvm），搅拌转速500rpm，发酵温度28℃。随着发酵时间的增加，利普司他汀不断积累，发酵至140h时，利普司他汀的效价达到10.8g/L。
参考文献
[1]Hollander PA.Elbein SC，Hirsch LB，et al，Role of orlistat in Treatment of obese patients with Type2Diabetes[J].Diabetes CASE,1998,21(8):1288‐1289
[2]Pierre B,Fernand S.Syntheses of Tetrahydrolipstatin and Absolute Configuration of Tetrahydorlipstatin and lipstatin.Hevletcia Chimcia Acta.1987.70(l):196‐202
Claims (9)
1.一株毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 2013357。
2.权利要求1所述的毒三素链霉菌在生产利普司他汀中的用途。
3.权利要求1所述的毒三素链霉菌在生产奥利司他中的用途。
4.一种利普司他汀发酵生产方法，包括在发酵培养基中发酵培养权利要求1所述的毒三素链霉菌，所述发酵培养基含有大豆油50-60g/L、甘油20-30g/L、卵磷脂8-16g/L、黄豆饼粉20-40g/L和酵母粉0-20g/L。
5.根据权利要求4所述的利普司他汀发酵生产方法，其中所述发酵培养基含有大豆油55g/L、甘油20g/L、卵磷脂12g/L、黄豆饼粉30g/L和酵母粉10g/L。
6.根据权利要求4所述的利普司他汀发酵生产方法，其中所述发酵培养基由大豆油50-60g/L、甘油20-30g/L、卵磷脂8-16g/L、黄豆饼粉20-40g/L、酵母粉0-20g/L、(NH4)2SO4 10g/L和Triton X-100 10g/L组成。
7.根据权利要求6所述的利普司他汀发酵生产方法，其中所述发酵培养基由大豆油55g/L、甘油20g/L、卵磷脂12g/L、黄豆饼粉30g/L、酵母粉10g/L、(NH4)2SO4 10g/L和Triton X-100 10g/L组成。
8.根据权利要求4所述的方法，发酵条件为空气流量1:1vvm，搅拌转速500rpm，发酵温度28℃。
9.根据权利要求8所述的方法，发酵时间为140h。
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