BRPI0519624B1 - processo para preparação de ansamitocinas purificadas - Google Patents
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Abstract
PROCESSOS PARA PREPARAÇÃO DE ANSAMITOCINAS PURIFICADAS. A presente invenção refere-se a um processo de fermentação em larga escala de cepas altamente produtivas na produção de Ansamitocinas. Um método para isolar Ansamitocinas brutas. Um método para purificar Ansamitocinas.
Description
[0001] A invenção refere-se a processos para a produção de Ansamitocinas. Ansamitocinas refere-se a uma mistura de ansamitocinas que diferem em sua cadeia lateral éster C-3. Ansamitocinas podem ser convertidas no álcool C-3 maitansinol.
[0002] Ansamitocinas são compostos altamente citotóxicos derivados de fermentação de microorganismos tais como Actinosynnema pretiosum. Ansamitocinas foram quimicamente convertidas em maytansinóides contendo tiol, cujo uso terapêutico na forma de conjugados de maitansinóide agente de ligação de célula foi descrito (Patentes US N° 5 208 020; 5 416 064; 6 333 410; e 6 441 163).
[0003] O processo de fermentação com cepas de Actinosynnema spp como Actinosynnema pretiosum produz várias espécies de ansamitocina transportando diferentes substituintes éster em C-3 (figura 1). Os vários ésteres C-3 produzidos incluem P-3 (iso-butirila), P-3’ (n-butirila), P-2 (propionila), P-4 (isovalerila), P-4’ (n-valerila). Todos estes ésteres podem ser redutivamente clivados para renderem o álcool maitansinol C-3 (P-0), que é o precursor para a síntese de maytansinóides contendo tiol. Em adição, menores quantidades de indesejadas ansamitocina que são modificadas em outros sítios, como N-demetila, 20-O-demetila, e 19-decloro são produzidas. Com desacilação redutora, estas ansamitocinas não produzem maitansinol.
[0004] Processos para a produção de ansamitocina a partir de fermentação de Actinosynnema spp foram descritos (Patentes US N° 4 162 940; 4 450 234; 4 228 239; 4 331 598 e 4 356 265). O rendimento de ansamitocina produzidas varia, com títulos geralmente variando de 12 mg/L a 100 mg/L. As ansamitocinas são tipicamente recuperadas e purificadas através de um processo multietapas envolvendo adição de um auxiliar de filtro e um solvente orgânico para todo o caldo de fermentação, seguido por concentração de camada orgânica e precipitação com éter de petróleo. O precipitado foi ainda purificado usando cromatografia de sílica e cristalização, seguido por ainda purificação por recristalização ou cromatografia.
[0005] Assim, o processo é problemático e envolve várias etapas onde material altamente tóxico tem de ser manuseado. Isto torna a escalada de um tal processo muito difícil. Em adição, a segurança do operador humano tem de ser assegurada através de todas as etapas de processamento.
[0006] Um recente pedido de Patente (US 2002/001984 A1) reivindica certos aperfeiçoamentos no processo para a produção de ansamitocinas. Os títulos de ansamitocina no caldo de fermentação são reportados terem uma faixa de 65 a 86 mg/L. Os aperfeiçoamentos reivindicados incluíram inativação térmica do caldo a 75oC, extração em um solvente hidrocarboneto aromático tal como tolueno, cromatografia através de uma coluna de sílica aberta, seguida por cristalização. De modo a reduzir o custo de produção de ansamitocina, novas cepas de Actinosynnema spp que têm títulos significantemente maiores (até 400 mg/L em fermentadores) que aquelas previamente descritas, foram produzidas. Os processos previamente descritos para a produção de ansamitocinas têm várias desvantagens, e assim não podem ser adaptados para as novas cepas de alta produção que foram desenvolvidas. Por exemplo, inativação térmica a 75oC resulta em alguma degradação de ansamitocina e uma perda de 10 a 20% em rendimento. Extração de caldo de fermentação contendo alto teor de ansamitocina com hidrocarbonetos aromáticos é ineficiente e incompleta, uma vez que as ansamitocinas não são altamente solúveis em tais solventes. Purificação de ansamitocinas sobre colunas de sílica autoempacotadas tem duas desvantagens: 1) variabilidade de lote para lote em pureza e recuperação, e 2) significante exposição humana resultando em conceitos de segurança. Assim, existe uma necessidade de produção de ansamitocinas em altos rendimentos e também provimento de um eficiente processo para seu isolamento e purificação, enquanto minimizando exposição de trabalhador à droga altamente tóxica.
[0007] Um aspecto da invenção é um processo para a fermentação em larga escala de microorganismos produzindo ansamitocina, o processo sendo especialmente aplicável a uma nova linhagem produzindo ansamitocina altamente produtiva.
[0008] Um outro aspecto da invenção é um processo para isolamento de ansamitocina em bruto, e para preparação de ansamitocinas purificadas compreendendo as seguintes etapas: 1) inativação opcional da cultura, por exemplo, através de exposição a aquecimento em cerca de 50o a 55oC ou através de adição de 1% em volume de clorofórmio, 2) extração com um solvente orgânico não-aromático, 3) concentração do extrato, 4) purificação do concentrado sobre uma coluna de sílica ou alumina, preferivelmente um coluna de cartucho de sílica pré-empacotada, e 5) cristalização do produto.
[0009] Outros aspectos da invenção incluem o seguinte:
[00010] Um processo para preparação de ansamitocinas purificadas compreendendo as etapas de: 2) Cultura de um microorganismo produzindo ansamitocina em um meio de cultura líquido; 3) Extração de ansamitocinas do meio de cultura com um solvente imiscível em água não-aromático; 4) concentração de ansamitocinas extraídas; e 5) purificação de ansamitocinas através de qualquer um de a), b), c) e d): a) cromatografia de adsorção sobre sílica-gel ou alumina, b) cristalização, c) cromatografia de adsorção sobre sílica-gel ou alumina seguida por cristalização, e d) cristalização seguida por cromatografia de adsorção sobre sílica-gel ou alumina.
[00011] Um processo para preparação de ansamitocinas purificadas compreendendo as etapas de: 1) cultura de um microorganismo produzindo ansamitocina em um meio de cultura líquido; 2) extração de ansamitocinas do meio de cultura com um solvente imiscível em água não-aromático; 3) concentração de ansamitocinas extraídas; e 4) purificação de ansamitocinas através de qualquer um de a), b), c) e d): a) cromatografia de adsorção sobre sílica-gel ou alumina, b) cristalização, c) cromatografia de adsorção sobre sílica-gel ou alumina seguida por cristalização, e d) cristalização seguida por cromatografia de adsorção sobre sílica-gel ou alumina.
[00012] Um processo para preparação de ansamitocinas purificadas compreendendo as etapas de: 1) Cultura de um microorganismo produzindo ansamitocina em um meio de cultura líquido; 2) Extração de ansamitocinas do meio de cultura com um solvente imiscível em água não-aromático; 3) Concentração de ansamitocinas extraídas; e 4) Purificação de ansamitocinas por cromatografia de adsorção sobre sílica-gel ou alumina seguida por cristalização.
[00013] Um processo para preparação de ansamitocinas purificadas compreendendo as etapas de: 1) cultura de um microorganismo produzindo ansamitocina em um meio de cultura líquido; 2) extração de ansamitocinas do meio de cultura com um solvente imiscível em água não-aromático; 3) filtração para remoção de sólidos, permitindo isolamento da fase orgânica 4) concentração de ansamitocinas da fase orgânica; e 5) purificação de ansamitocinas através de qualquer um de a), b), c) e d): a) cromatografia de adsorção sobre sílica-gel ou alumina, b) cristalização, c) cromatografia de adsorção sobre sílica-gel ou alumina seguida por cristalização, e d) cristalização seguida por cromatografia de adsorção sobre sílica-gel ou alumina.
[00014] Um processo para preparação de ansamitocinas purificadas compreendendo as etapas de: 1) Cultura de um microorganismo produzindo ansamitocina em um meio de cultura líquido; 2) Extração de ansamitocinas do meio de cultura com um solvente imiscível em água não-aromático, usando várias técnicas de centrifugação; 3) Concentração de ansamitocinas extraídas; e 4) Purificação de ansamitocinas através de qualquer um de a), b), c) e d): a) cromatografia de adsorção sobre sílica-gel ou alumina, b) cristalização, c) cromatografia de adsorção sobre sílica-gel ou alumina seguida por cristalização, e d) cristalização seguida por cromatografia de adsorção sobre sílica-gel ou alumina.
[00015] Um processo para preparação de ansamitocina purificada compreendendo as etapas de: 1) cultura de um microorganismo produzindo ansamitocina em um meio de cultura líquido; 2) centrifugação de caldo na presença de um ou mais solventes orgânicos miscíveis em água para remover sólidos enquanto retendo ansamitocinas em solução. 3) adição de solvente não-aromático imiscível em água, para permitir extração de ansamitocinas na camada orgânica. Opcionalmente, vários sais ou outros componentes também podem ser adicionados à fase orgânica durante a extração. 4) concentração de ansamitocinas extraídas; e 5) purificação de ansamitocinas através de qualquer um de a), b), c), e d): a) cromatografia de adsorção sobre sílica-gel ou alumina, b) cristalização, c) cromatografia de adsorção sobre sílica-gel ou alumina seguida por cristalização, e d) cristalização seguida por cromatografia de adsorção sobre sílica-gel ou alumina.
[00016] Um processo para preparação de ansamitocinas purificadas compreendendo as etapas de: 1) cultura de um microorganismo produzindo ansamitocina em um meio de cultura líquido; 2) tratamento opcional do meio de cultura para facilitar extração de ansamitocinas; 3) extração de fase sólida de ansamitocinas do meio de cultura sobre uma resina; 4) eluição de gradiente ou isocrática de ansamitocinas a partir da resina usando um ou mais solventes orgânicos ou um ou mais solventes orgânicos combinados com água; 5) concentração de ansamitocinas extraídas; e 6) purificação opcionalmente de ansamitocinas ainda através de qualquer um de a), b), c) e d): a) cromatografia de adsorção sobre sílica-gel ou alumina, b) cristalização, c) cromatografia de adsorção sobre sílica-gel ou alumina seguida por cristalização, e d) cristalização seguida por cromatografia de adsorção sobre sílica-gel ou alumina.
[00017] Nestas modalidades a invenção pode opcionalmente incluir: (i) inativação térmica ou química dos microorganismos no caldo de fermentação; (ii) tratamento de meio de cultura para facilitar extração de solvente de ansamitocinas, antes de etapa 2; ou (iii) uma etapa de lavagem na qual uma solução em bruto de ansamitocinas em solvente orgânico é lavada com água, uma solução de sal aquosa, um ácido aquoso ou uma base aquosa em qualquer combinação seqüencial, antes ou após a precipitação. Esta etapa pode ser realizada em vários estágios da purificação.
[00018] Um processo para extração de ansamitocinas de caldo de fermentação, o dito processo compreendendo: 1) opcionalmente inativação de microorganismos produzindo ansamitocina no caldo de fermentação; e 2) extração de ansamitocinas do caldo de fermentação com um solvente imiscível em água não-aromático.
[00019] O processo acima também pode incluir tratamento do meio de cultura para facilitar extração de solvente de ansamitocinas, antes de etapa 2.
[00020] Um processo para extração de ansatomicinas de caldo de fermentação, o dito processo compreendendo: 1) extração de ansamitocinas do caldo de fermentação com um solvente imiscível em água não-aromático, e 2) filtração para remoção de sólidos, seguindo isolamento da fase orgânica.
[00021] O processo acima opcionalmente pode incluir: (i) inativação química ou térmica dos microorganismos no caldo de fermentação; e/ou (ii) tratamento do meio de cultura para facilitar extração com solvente de ansamitocinas, antes de etapa 2.
[00022] Um processo para extração de ansamitocinas de caldo de fermentação, o dito processo compreendendo: extração de ansamitocinas do meio de cultura através de várias técnicas de centrifugação com um solvente imiscível em água não-aromático.
[00023] O processo acima opcionalmente pode incluir: (i) inativação química ou térmica dos microorganismos no caldo de fermentação; e/ou (ii) tratamento do meio de cultura para facilitar extração com solvente de ansamitocinas, antes de ou durante centrifugação.
[00024] Um processo para remoção de debris sólidos de caldo de fermentação, o dito processo compreendendo: 1) centrifugação do caldo de fermentação na presença de um solvente orgânico miscível em água para remover sólidos enquanto retendo ansamitocinas em solução.
[00025] O processo acima opcionalmente pode incluir: (i) inativação química ou térmica dos microorganismos no caldo de fermentação; e/ou (ii) tratamento do meio de cultura para facilitar extração com solvente de ansamitocinas, antes de ou durante centrifugação.
[00026] Nos processos descritos acima, é preferido que o microorganismo produzindo ansamitocina seja Actinosynnema spp., mais preferivelmente Actinosynnema pretiosum. O microorganismo produzindo ansamitocina também pode ser Actinosynnema pretiosum ATCC 31565 ou cepas derivadas do mesmo ou Actinosynnema pretiosum PF4-4 (ATCC PTA-3921) ou cepas derivadas do mesmo. Como descrito na Patente US 4 450 234, Actinosynnema pretiosum ATCC 31565 foi depositado com (i) Institute for Fermentation, Osaka, 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka, 532-8686, Japan, em 20 de agosto de 1979, sob o número de acesso de IFO 13963; (ii) National Institute of Bioscience and Human Technology (anteriormente Fermentation Research Institute), Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibarraki-ken 305, Japan, em 29 de agosto de 1979, sob o número de acesso de FERM-P NO. 5185; e (iii) o American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209, USA, em 11 de setembro de 1979, aob o número de aceso de ATCC 31565. Em adição, Qactinosynnema pretiosum PF4-4 foi depositado sob as provisões do Tratado de Budapeste com o American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209, USA, em 11 de dezembro de 2001, e foi acordado No de acesso ATCC PTA-3921.
[00027] A figura 1 mostra a estrutura de vários ésteres C-3 de ansamitocina que podem ser fabricados através de fermentação, assim como o álcool C-3, maitansinol (P-0).
[00028] Processos são providos para cultura de um microorganismo altamente produtivo para ansamitocinas em um meio de cultura líquido em fermentadores grandes. Também são providos processos para a extração da ansamitocina do caldo de cultura e o microorganismo em um solvente orgânico imiscível em água não-aromático onde a ansamitocina é altamente solúvel, e para a purificação da ansamitocina através de passagem através de uma coluna de sílica ou alumina se necessário, preferivelmente estas colunas são cartuchos pré-empacotados, seguida por cristalização do produto. Se necessário, o microorganismo pode ser inativado através de tratamento térmico ou tratamento com clorofórmio antes da etapa de extração.
[00029] As ansamitocinas purificadas que podem incluir uma mistura de vários ésteres C-3, como as ansamitocinas P-3, P-3’, P-4, P-4’, P-2 e P-1 (figura 1), podem ser tratadas com um agente redutor para renderem o desejado composto hidroxil C-3, maitansinol (P-0). As ansamitocinas purificadas tipicamente contêm somente menores quantidades de indesejáveis ansamitocinas que têm modificações sobre sítios da molécula outras que não a posição C-3. Preferivelmente, a linhagem produzindo ansamitocina é Actinosynnema spp. Mais preferivelmente, o microorganismo é Actinosynnema pretiosum. O microorganismo também pode ser Actinosynnema pretiosum PF4-4 (ATCC PTA-3921) e seus derivados e Actinosynnema pretiosum ATCC 31565 e seus derivados. O microorganismo pode ser desenvolvido através de técnicas de cultura de fermentação que são conhecidas por aqueles versados, usando os específicos meios aqui descritos ou quaisquer outros meios que sejam descritos na técnica (Patente US 4 162 940; 4 450 234; 4 228 239; 4 331 598 e 4 356 265).
[00030] Uma realização do processo da invenção é a cultura do microorganismo em um meio de cultura líquido. Crescimento da linhagem bacterial PF4-4 é realizado sob condições controladas e pode empregar uma ampla variedade de meios e condições. Por exemplo, PF4-4 pode ser crescida sob condições similares e com meios similares àqueles descritos para ATCC 31565 ou ATCC 31281 nas Patentes US expedidas 4 137 230; 4 162 940; 4 331 598; 4 356 265 e 4 450 234; e como descrito em Hatano et al., Agric. Biol. Chem. 48, 1721-1729, 1984. Assim, a linhagem PF4-4 tolera uma ampla variedade de fontes de carbono, que também suportam produção fermentativa de ansamitocinas. Meios de crescimento exemplares são dados nas Tabelas 1 e 2.
[00031] A Tabela 1 mostra meios que suportam produção de ansamitocinas através de microorganismos produzindo ansamitocina, como Actinosynnema pretiosum PF4-4 e Tabela 2 ainda mostra meios apropriados para a propagação e/ou crescimento de Actinosynnema pretiosum PF4-4, e outros microorganismos produzindo ansamitocina. Tabela I.Composição de Meios de Produção (entradas são % peso / volume)
Esterilização foi a 121oC por 20 minutos. Adicionado por último Tabela 2.Meios Relacionados Inclinação e cultura em placa, CM4-1 Agar (%, peso / volume) Extrato de levedura (Difco)0,3 Extrato de malte (Difco)0,3 Soytone (Difco)0,5 Glicerol (Difco)1,0 Bacto Agar (Difco)2,0 Ajustar pH para 6,5 antes de esterilização; Esterilização: 121oC, 20 minutos Meio Semente, VM4-1’ (%, peso / volume) Amido solúvel (BDH)2,0 Glicose (Shuling)1,0 Farinha de soja (ADM)1,0 Licor de infusão de milho (Solulys)0,5 Soytone (Difco)0,5 NaCl (Wako)0,3 CaCO3 (Hayashi)0,5 PH 6,8; Esterilização: 121oC, 20 minutos
[00032] Processos preferidos parra produção fermentativa de ansamitocinas a partir de linhagem PF4-4 são ainda descritos em Exemplos 1 e 2 abaixo. Fermentação
[00033] A cultura pode ser conduzida através de condições de cultura tais como, condições de cultura estacionária, agitação, aeróbica submersa ou quaisquer outras. Para bom crescimento de cultura e alta produção de ansamitocinas em grandes fermentadores de tanque, cultura aeróbica submersa é preferida. A produção de ansamitocina ainda pode ser aperfeiçoada através de alimentação de nutrientes durante a fermentação. Por exemplo, quando cultivando o organismo em meio FM4-6, adicional alimentação de glicose para a duração da fermetação ou de glicose por cerca das primeiras 24 a 72 horas, preferivelmente por cerca de das primeiras 48 h, seguido por alimentação com glicose e um nutriente proteína como farinha de semente de algodão (por exemplo, Proflo ou Pharmamedia de Trader’s Protein, Memphis, TN) ou farinha de soja, e um álcool ou um aldeído para facilitar a formação da cadeia lateral de éster C-3, tal como isobutanol, isobutiraldeído, n-butanol, n-butiraldeído, n-propanol, npropionaldeído, isopropanol, isopropionaldeído, pentanol, valeraldeído, isopentanol, isovaleraldeído até o fim da fermentação pode resultar na duplicação da produção de ansamitocina. Embora as condições de cultura dependam dos meios usados e a escala de produção, é normalmente preferido realizar a fermentação na faixa de pH de cerca de 5 a 9, preferivelmente com um pH de partida de 6,5 a 8,0. Mais preferivelmente, a faixa de pH é cerca de 7 a 8, mesmo mais preferivelmente cerca de 7 a 7,4. O pH mais preferido é cerca de 7,2. A temperatura pode variar de cerca de 15 a 35oC, com uma faixa preferida de cerca de 25 a 30oC. Mais preferivelmente, a temperatura é cerca de 28oC. A fermentação é continuada até a acumulação máxima de ansamitocina ter sido alcançada. O tempo de cultura pode variar e depende de vários fatores incluindo o processo de cultura, a composição do meio, e a temperatura. Tipicamente, o tempo de fermentação varia de 96 a 336 horas. Análises de ansamitocinas:
[00034] Nas Patentes US 4 331 598 e 4 450 234, a linhagem parente ATCC 31565 é mostrada como produzindo duas classes de ansamitocinas que são distinguidas pela presença de um grupo metila ou hidroximetila em C-14 (ver figura 1). Para ambas as classes, várias diferentes ansamitocinas são produzidas que diferem em sua respectiva cadeia lateral acila ligada ao átomo de oxigênio C-3, e com relação a se C-14 transporta um grupo metila ou hidroximetila (ou, em estudos subseqüentes, N-demetila). A nomenclatura aqui usada para o composto permutado é definida acima com referência à figura 1. Ansamitocina P-3 é o principal produto de PF4-4 e a linhagem parente ATCC 31565, sob certas condições de crescimento. Se as bactérias são crescidas na presença de valina ou ácido isobutírico (ver Patente US 4 228 239), ou álcool isobutílico ou isobutiraldeído (ver Patente US 4 356 265), outros compostos ansamitocina estão presentes somente em menores quantidades. Quando linhagem PF4-4 é crescida em diferentes meios de fermentação (designados FM na Tabela 1), os quais contêm todos álcool isobutílico, ansamitocina P-3 é a ansamitocina predominante produzida. Em um processo para ensaiar a quantidade de ansamitocinas, amostras dos caldos de fermentação são diluídas com etanol ou acetonitrila, então agitadas fortemente e finalmente centrifugadas. O sobrenadante é então ensaiado para teor de ansamitocina P-3.
[00035] Ansamitocinas são preferivelmente fracionadas e analisadas através de cromatografia líquida de alta performance de fase reversa (HPLC), mas qualquer técnica apropriada, tal como, por exemplo, MALDI-TOF ou cromatografia de camada fina pode ser usada. Em um processo, caldos de fermentação são extraídos com solventes orgânicos, como acetato de etila, cloreto de metileno, ou clorofórmio, e o teor de P-3 no solvente orgânico é determinado por HPLC, usando colunas C8 ou C18 de fase reversa.
[00036] Ansamitocinas podem ser extraídas do caldo de fermentação através de processos geralmente empregados para a recuperação de metabólitos secundários. Uma vez que ansamitocinas são facilmente solúveis em solventes não-aromáticos, elas podem ser facilmente extraídas através de agitação com solventes imiscíveis em água não-aromáticos como acetatos de alquila onde a cadeia alquila é linear ou ramificada e tem 1-5 átomos de carbono, dialquil cetonas e solventes halogenados. Exemplos de apropriados acetatos de alquila incluem acetato de n-butila, acetato de etila e acetato de metila. Um exemplo de uma apropriada dialquil cetona é metil isobutil cetona. Um exemplo de um apropriado solvente halogenado é diclorometano. Extração com acetato de n-butila é preferida. Preferivelmente, a razão do caldo de fermentação para o solvente imiscível em água nãoaromático é 1:1 em volume.
[00037] Ansamitocinas também podem ser adsorvidas de caldo de fermentação sobre várias resinas, tais como, Amberlite XAD-4, XAD16 comercialmente disponível de Rohm and Haas Company, Diaion HP20, HP21, Sepabeads SP825, SP850, SP70, SP700 comercialmente disponíveis de Mitsubishi Chemical Industries Ltd. Estes exemplos não são limitantes em escopo, outras resinas conhecidas por aqueles versados na técnica também podem ser usadas para o propósito acima. A resina também pode ser usada como um revestimento sobre uma estrutura secundária tal como um magneto ou um material de alta densidade de modo que o polímero pode ser recuperado do caldo magneticamente ou através de processos que se baseiam em densidade adsorvente tal como cromatografia de leito expandido. Uma vez ansamitocinas sejam adsorvidas sobre a resina, elas podem ser eluídas usando um ou mais solventes orgânicos por meio de eluição de gradiente ou isocrática. Em uma realização, a resina pode ser adicionada diretamente ao caldo para extrair ansamitocinas.
[00038] Ansamitocinas podem ser recuperadas da resina através de vários meios. Em uma realização, a resina pode ser recuperada por filtração. Em uma segunda realização, a resina pode ser recuperada por centrifugação e o pélete pode ser eluído com um ou mais solventes orgânicos ou com um ou mais solventes orgânicos combinados com água. Em uma terceira realização, fase aquosa e debris sólidos podem ser removidos da resina através de cromatografia de leito expandido. A resina então pode ser comprimida na coluna de leito expandido e eluída com um ou mais solventes orgânicos ou com um ou mais solventes orgânicos combinados com água através de eluição de gradiente ou isocrática. Em uma quarta realização, a resina pode extrair ansamitocinas enquanto sendo separada do caldo de fermentação por uma membrana parcialmente permeável. Por exemplo, uma membrana de diálise empacotada com resina pode ser agitada com caldo de fermentação, água e componentes de baixo peso molecular podem passar através de membrana, permitindo que ansamitocinas se liguem à resina. A bolsa de diálise então pode ser removida do caldo e resina recuperada pode ser então eluída como descrito acima.
[00039] Antes de extração, os micróbios no caldo de fermentação podem estar inativados, se desejado, através de exposição a aquecimento suave a cerca de 50o a 55oC por cerca de 30 minutos a 2 horas, ou através de adição de clorofórmio 1% (v/v) (Toru Hasegawa et al. 1983, Int. J. Syst. Bacteriol. 33:314-320).
[00040] Também, antes de ou durante a extração, o processo pode incluir tratamento do meio de cultura para facilitar extração com solvente de ansamitocinas. O tratamento pode incluir mas não é limitado a aquecimento, ajuste de pH, ou tratamento enzimático ou tratamento químico, tal como a adição de polissulfato férrico, agentes desemulsificantes, ou co-solventes de sílica sublimada como acetona ou álcoois como metanol.
[00041] No caso de extração de fase orgânica, a extração é realizada em um pH entre 2,0-13,0, mas preferivelmente em um pH de cerca de 6,0 a 7,0, e mais preferivelmente em um pH de cerca de 6,5 a 7,0, e preferivelmente com acetato de n-butila. De modo a aperfeiçoar a eficiência da extração, caldo pode ser mantido em uma temperatura entre 5 e 80oC, preferivelmente entre 30 a 45oC durante o processo de extração.
[00042] O tempo de extração depende de vários fatores incluindo a composição do caldo, a temperatura do caldo e solvente de extração, o processo de mistura de caldo e solvente e o solvente usado para extração. Tempo de extração varia de 1 hora a 120 horas, dependendo do processo de extração. Por exemplo, quando é escolhido um processo de filtração e extração rápido, o tempo de extração pode variar entre 1-12 horas.
[00043] Auxiliares de filtro podem ser usados durante filtração. Tais auxiliares incluem mas não são limitados a Celpure P1000, Celatom FW-80, Hyflo Super Cel and Celite. Opcionalmente, auxiliares de filtro podem ser adicionados diretamente ao caldo durante filtração. Opcionalmente, filtros também podem ser pré-revestidos com um auxiliar de filtro. Processos de filtração que podem ser usados neste processo incluem mas não são limitados a filtração de fluxo tangencial, filtração de tambor de raspagem revestido com auxiliar de filtro ou filtração de batelada.
[00044] Em casos onde extração é realizada em pH extremos como pH1-pH5 ou pH8-pH13 ou em temperaturas altamente elevadas como 60°C-90oC, a extração deve ser completada em uma taxa que evita excessiva decomposição das ansamitocinas. Se necessário, a extração também pode ser realizada extremamente rapidamente através de centrifugação contínua. Em um tal caso, o pH ou temperatura do caldo de fermentação pode ser ajustado quando o caldo entra na centrífuga de modo que prolongada exposição a condições ásperas é evitada. Exemplos de equipamento centrífugo que tem sido usado em processamento de fermentação e pode ser usado para extrair ansamitocinas incluem mas não são limitados a decantadores centrífugos e centrífugas de discos empilhados. O extrato de solvente orgânico retido então pode ser concentrado sob pressão reduzida para render um resíduo que contém as ansamitocinas. Alternativamente, um solvente miscível em água pode ser misturado com o caldo de fermentação e centrifugado para remover sólidos rendendo uma solução isenta de sólidos, de fase simples. A solução então pode ser processada através de, por exemplo, adição de um solvente imiscível em água para causar a separação de fases orgânica e aquosa seguido por concentração da fase orgânica.
[00045] Ansamitocinas em uma solução de solvente orgânico imiscível em água podem ser lavadas com água, ácido aquoso, base aquosa, água saturada parcial ou inteiramente com sal, ou uma combinação de quaisquer das lavagens aquosas descritas. Exemplos de ácidos aquosos incluem mas não são limitados a soluções aquosas de ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido acético, ácido fórmico, e ácido fosfórico em um pH entre 1-6,9. No contexto desta invenção, um ácido aquoso também inclui um sistema tamponado aquoso ácido. Exemplos de sistemas tamponados ácidos incluem, mas não são limitados a, fosfato de sódio, fosfato de potássio, acetato de amônio, e formato de amônio, cada um sendo de pH ajustado para uso em suas respectivas faixas de tamponamento ácido. Exemplos de bases aquosas incluem mas não são limitadas a, soluções aquosas de bicarbonato de sódio, bicarbonato de potássio, carbonato de sódio, hidróxido de sódio, hidróxido de amônio, e fosfato de sódio em um pH entre 7,1-13. No contexto desta invenção, uma base aquosa também inclui um sistema tamponado aquoso básico. Exemplos de sistemas tamponados básicos incluem, mas não são limitados a, fosfato de sódio, fosfato de potássio, borato de sódio, e carbonato de amônio cada um sendo de pH ajustado para uso em suas respectivas faixas de tamponamento básico.
[00046] As lavagens ácidas ou básicas têm de ser completadas sem apreciável decomposição das ansamitocinas podem variar com o pH. Se necessário, extrações extremamente rápidas podem ser realizadas através de técnicas centrífugas. Exemplos de água saturada parcial ou inteiramente com sal incluem mas não são limitados a cloreto de sódio aquoso em vários níveis de saturação, sulfato de sódio aquoso em vários níveis de saturação, e cloreto de potássio aquoso em vários níveis de saturação. Lavagens aquosas também podem ser realizadas nas quais uma mistura de uma solução de sal aquosa parcial ou totalmente saturada é combinada com uma base aquosa ou um ácido aquoso.
[00047] Alternativamente, antes de extração, os sólidos no caldo de fermentação contendo ansamitocinas podem ser separados por filtração ou centrifugação. Ansamitocinas na massa de células sólida podem ser recuperadas através de lavagem com um solvente tal como etanol, etanol aquoso, ou outros solventes orgânicos, como acetato de etila, acetato de butila, diclorometano ou acetona, e é bem conhecido por aqueles versados na técnica. As ansamitocinas no filtrado podem ser recuperadas por extração com um solvente orgânico aromático conhecido como descrito em outro lugar no pedido de patente. Purificação de ansamitocinas:
[00048] O produto bruto pode ser submetido a procedimentos de purificação como cromatografia de adsorção sobre sílica-gel ou alumina, seguido por recristalização se necessário. Preferivelmente a cromatografia é conduzida sobre uma coluna pré-empacotada, tal como um cartucho de sílica-gel Biotage usando o sistema de cromatografia Biotage. As desejadas ansamitocinas podem ser eluídas da coluna usando um gradiente de solvente partindo com uma mistura de acetato de etila e hexano e adicionando quantidades crescentes de metanol. As frações contendo as desejadas ansamitocinas podem ser reunidas e concentradas. Se desejado, as ansamitocinas ainda podem ser purificadas por cristalização usando um solvente tal como acetato de etila para dissolver o produto, e então adicionando um solvente não-polar como heptano ou hexano para cristalizar o produto puro. O termo cristalização como aqui usado também abrange o termo precipitação, em que o sólido formado a partir de solução pode ter tanto uma estrutura definida como amorfa. Complexos de Maitansinóide / Agente de Ligação de Célula:
[00049] O processo da invenção pode ser usado para fabricação de complexos de maitansinóide / agente de ligação de célula que são úteis como pró-drogas ativadas-tumor. Ansamitocinas preparadas através do processo da invenção podem sofrer clivagem redutora para maitansinol que pode ser usado como descrito nas Patentes US 5 208 020, 5 416 064, 6 333 410 e 6 441 163 para produzir derivados de maitansinóide contendo N-metil-L-alanina. Estes derivados são então conjugados a agentes de ligação de célula, preferivelmente anticorpos, via vários ligadores tais como ligantes contendo dissulfeto.
[00050] A invenção será agora ilustrada por referência a exemplos não-limitantes. Exemplo 1.Produção de Ansamitocinas:
[00051] Semente Primária: Meio de cultura semente VM4-1’ (400 mL/frasco) compreendendo amido solúvel 2%, glicose 1%, farinha de soja 1%, licor de infusão de milho 0,5%, Soytone 0,5% (Roquette), cloreto de sódio 0,3%, e carbonato de cálcio 0,5% foi vertido em cada um de onze frascos erlenmeyer de 2L de capacidade. Após esterilização, cada um dos frascos foi inoculado com a cultura de PF44 (ATCC PTA-3921). Os frascos foram incubados a 28oC sobre um agitador orbital em 230 rpm por 48 horas.
[00052] Semente secundária: Os conteúdos dos frascos de semente primária foram então reunidos. Um fermentador de 300L foi enchido com 100L do meio semente VM4-1’. Após esterilização, o fermentador foi inoculado com 4 L da cultura semente primária reunida. O fermentador foi mantido em 28oC, com agitação em 80 rpm. O nível de oxigênio dissolvido foi mantido acima de 30% de saturação através de aeração e agitação aumentada se necessário. Após incubação por 24 horas, a cultura semente secundária estava pronta para ser transferida nos vasos de produção.
[00053] Produção: Dois fermentadores de produção de 300 L foram cada um enchidos com 250 L de meio de produção FM4-6 (ver Tabela 1). Após esterilização, os fermentadores foram, cada um, inoculados com 15 L da cultura semente secundária. Os fermentadores foram mantidos a 28oC com agitação em 107±5 rpm e aeração em 0,4 vvm. Após dia 2, o teor de oxigênio dissolvido foi mantido acima de 30% através de aumento de taxa de agitação para um máximo de 170±5 rpm, e a taxa de aeração para um máximo de 1 vvm. O título de ansamitocina foi medido diariamente através de retirada de uma amostra do caldo de fermentação e diluição em etanol, seguido por quantificação através de análises de HPLC. A fermentação foi continuada até dia 10, em cujo ponto, o acrescentamento de ansamitocina nivelou. O título de ansamitocina no dia 10 nos dois fermentadores foi 251 mg/L e 244 mg/L, respectivamente. O pH do caldo de fermentação foi ajustado para 6,5 através de adição de ácido fosfórico. Os fermentadores foram aquecidos para 55oC e mantidos nesta temperatura por 1 hora para inativação de microorganismo. Os fermentadores foram então resfriados para temperatura ambiente para extração com um solvente orgânico. Exemplo 2: Produção de Ansamitocinas usando um processo de alimentação de batelada
[00054] Um fermentador de produção de 1500 L foi enchido com 900 L de meio de produção FM4-6(ver Tabela 1). Após esterilização, o fermentador foi inoculado com 54 L da cultura semente secundária, preparada como descrito acima. O fermentador foi mantido a 28oC com agitação em 107±5 rpm e aeração em 0,4 vvm. De 0 a 48 h, uma solução aquosa de glicose 28,5% foi alimentada em uma taxa de 0,39 mL/L/h. De 48 a 288 h a alimentação foi trocada para uma solução estoque compreendendo glicose 21,5%, Proflo 7,1% e isobutanol 7,1%, que foi alimentado na taxa de 0,51 mL/L/h. Após dia 2, o teor de oxigênio dissolvido foi mantido acima de 20% através de aumento de taxa de agitação para um máximo de 170±5 rpm, e a taxa de aeração para um máximo de 1 vvm. O título de ansamitocina foi medido diariamente através de retirada de uma amostra do caldo de fermentação e diluindo em etanol, seguido por análise quantitativa por HPLC. A fermentação foi continuada até dia 13, em cujo ponto, o acrescentamento de ansamitocina nivelou. O título de ansamitocina no dia 13 no fermentador foi 304 mg/L. O pH do caldo de fermentação foi ajustado para 6,5 através de adição de ácido fosfórico.
[00055] Inativação térmica. O fermentador foi aquecido até 55oC e mantido nesta temperatura por 1 hora para inativar o microorganismo. Os fermentadores então foram resfriados para entre 30 e 40oC para extração com um solvente orgânico. Exemplo 3. Extração e purificação cromatográfica de ansamitocinas.
[00056] O caldo de fermentação de Exemplo 2 foi misturado com um igual volume de acetato de n-butila. A mistura foi mantida entre 30 e 40 a 45oC, e suavemente agitada de modo que a mistura das duas fases estava justo ocorrendo na interface de solvente. A extração foi continuada por até 5 dias, ou, até análises de HPLC da camada orgânica terem indicado que >80% das ansamitocinas foram extraídas. A camada orgânica foi então separada, e evaporada usando um evaporador de filme em queda para um volume final de entre 20 e 50 L. O extrato concentrado foi transferido em um frasco contendo 2,2 kg de sílica-gel. As ansamitocinas brutas foram revestidas sobre a sílicagel através de evaporação de solvente à secura usando um evaporador rotatório, operando sob pressão reduzida. A sílica revestida foi então transferida para um módulo de injeção de amostra (SIM), obtido de Biotage, Inc., Charlotesville, VA. O SIM foi lavado com uma mistura de ciclo hexano e hexano (2:1 v/v), e então conectado a um sistema Biotage 150M equipado com um cartucho de sílica. O desejado produto foi eluído da coluna usando uma mistura de acetato de etila : hexano : metanol (29,4 : 68,6 : 2,0, v/v/v). Frações contendo ansamitocinas foram reunidas e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O produto foi ainda secado sob alto vácuo por 24 h. Exemplo 4. Recristalização de Ansamitocinas.
[00057] O produto seco da etapa acima foi dissolvido em acetato de etila quente (23 mL/g de resíduo). A mistura foi mantida entre 60-75oC, até completa dissolução das ansamitocinas ser obtida. Heptano (80 mL/g residuo) foi adicionado lentamente, enquanto mantendo a temperatura da batelada entre 60-75oC. Após todo o heptano ter sido adicionado, a batelada foi deixada resfriar para temperatura ambiente. Os cristais foram recuperados por filtração e então secados sob alto vácuo para renderem 221 gramas de ansamitocinas puras. Exemplo 5. Extração de caldo de fermentação com filtração
[00058] Caldo de fermentação (200 mL) preparado como descrito no Exemplo 2, foi vigorosamente misturado por 5 minutos com 200 mL de acetato de n-butila (200 mL), resultando em uma emulsão. Auxiliar de filtro Cellatom FW-80 (20 g) foi adicionado, e a mistura foi filtrada à vácuo através de um funil de buchner que foi pré-revestido com auxiliar de filtro Cellatom FW-80. A torta de filtro foi lavada com 40 mL de acetato de n-butila. O filtrado, agora livre de contaminantes sólidos, compreendendo uma camada aquosa e orgânica clara foi transferido para um funil de separação. A fase aquosa foi drenada. A fase orgânica contendo as ansamitocinas foi retida. Exemplo 6. Extração de caldo de fermentação com centrifugação usando um solvente imiscível em água
[00059] Uma parte de caldo de fermentação, preparado como descrito no Exemplo, foi misturada vigorosamente com uma parte de acetato de n-butila por 2 minutos. A resultante emulsão foi centrifugada por 1 minuto e a camada orgânica contendo as ansamitocinas, livre de contaminantes sólidos, foi retirada. Exemplo 7: Extração de caldo de fermentação com centrifugação usando um solvente miscível em água
[00060] Uma parte de caldo de fermentação, preparado como descrito no Exemplo 2, foi vigorosamente misturada com uma parte de acetona. A mistura foi centrifugada por 1 minuto para peletizar os sólidos. Sobrenadante foi retirado e misturado com metade de hexanos. A camada aquosa separada deixando uma fase orgânica clara contendo as ansamitocinas. Exemplo 8. Extração em fase sólida de ansamitocinas usando pérolas hidrofóbicas XAD-16.
[00061] Um litro de caldo de fermentação, preparado como descrito no Exemplo 2, foi agitado com 10 gramas de pérolas XAD-16 por seis horas. A mistura foi então centrifugada e o sobrenadante foi removido. O pélete foi transferido para uma coluna pequena e eluída com água deionizada, seguido por 90:10 água deionizada : acetonitrila. Frações contendo ansamitocinas foram combinadas e solvente foi evaporado para render 112 mg de extrato concentrado. Análises de HPLC indicaram que o extrato conteve 50 mg de ansamitocinas. Embora a invenção tenha sido descrita em detalhes e com referência a suas específicas realizações, será aparente para aqueles versados na técnica que várias mudanças e modificações podem ser feitas ali sem se fugir do espírito e escopo da invenção.
[00062] Todas as publicações aqui referidas são expressamente incorporadas por referência.
Claims (14)
1. Processo para preparação de ansamitocinas purificadas, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: i) cultivo de um microorganismo produtor de ansamitocina em um meio de cultura líquido; ii) extração em fase sólida de ansamitocinas a partir do meio de cultura para uma resina hidrofóbica; iii) eluição isocrática ou gradual de ansamitocinas a partir da resina usando um solvente orgânico ou um solvente orgânico combinado com água; iv) concentração das ansamitocinas extraídas; e v) opcionalmente, purificação das ansamitocinas através de qualquer um de a), b), c) e d): a) cromatografia de adsorção sobre sílica-gel ou alumina, b) cristalização, c) cromatografia de adsorção sobre sílica-gel ou alumina seguida por cristalização, e d) cristalização seguida por cromatografia de adsorção sobre sílica-gel ou alumina; e em que a referida ansamitocina compreende a seguinte estrutura:
em que R é COCH3, COCH2CH3, COCH(CH3)2, COCH2CH2CH3, COCH2CH(CH3)2, ou COCH2CH2CH2CH3.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterezado pelo fato de que a extração é realizada em um pH de 6 a 7; e/ou em uma temperatura de 30o a 45oC.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o microorganismo produtor de ansamitocina é Actinosynnema spp ou Actinosynnema pretiosum.
4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterezado pelo fato de que o microorganismo produzindo ansamitocina é Actinosynnema pretiosum ATCC 31565 ou uma cepa derivada do mesmo, ou Actinosynnema pretiosum PF-4-4 (ATCC PTA-3921) ou uma cepa derivada do mesmo.
5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a dita cultura está em um pH na faixa de 6,5 a 8 ou 7 a 7,4 ou é 7,2; e/ou em que a temperatura está na faixa de 15oC a 35oC ou 25oC a 30oC ou é 28oC.
6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterezado pelo fato de que a temperatura é de 28oC e o pH é de 7,2.
7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que ao menos um nutriente é provido durante a dita cultura.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracteri zado pelo fato de que pelo menos um nutriente é uma fonte de carbono.
9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracteri zado pelo fato de que a fonte de carbono é glicose.
10. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o nutriente é uma fonte de carbono seguida por uma fonte de carbono e um nutriente proteína.
11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o nutriente proteína é farinha de semente de algodão ou farinha de soja.
12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado pelo fato de que ainda é provido durante a cultura de um álcool ou um aldeído e facilita a formação de uma cadeia lateral de éster C-3 da ansamitocina.
13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o aldeído ou álcool é selecionado do grupo consistindo em isobutanol, isobutiraldeído, n-butanol, n-butiraldeído, npropanol, n-propionaldeído, isopropanol, isopropionaldeído, pentanol, valeraldeído, isopentanol, e isovaleraldeído.
14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que ainda compreende um ou mais de: (i) inativação dos microorganismos no meio de cultura através de inativação química ou térmica; (ii) lavagem, na qual uma solução bruta de ansamitocinas no solvente orgânico é lavada com água, uma solução aquosa de sal, um ácido aquoso, ou uma base aquosa, em qualquer combinação sequencial, antes ou após a precipitação que pode ser realizada durante a purificação.
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