NO342876B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av ansamitosiner. - Google Patents

Fremgangsmåte for fremstilling av ansamitosiner. Download PDF

Info

Publication number
NO342876B1
NO342876B1 NO20074222A NO20074222A NO342876B1 NO 342876 B1 NO342876 B1 NO 342876B1 NO 20074222 A NO20074222 A NO 20074222A NO 20074222 A NO20074222 A NO 20074222A NO 342876 B1 NO342876 B1 NO 342876B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
ansamitosins
ansamitosin
approximately
crystallization
silica gel
Prior art date
Application number
NO20074222A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20074222L (no
Inventor
Wayne C Widdison
Cynthia Kuo
Graham S Byng
Original Assignee
Immunogen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=36692550&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO342876(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Immunogen Inc filed Critical Immunogen Inc
Publication of NO20074222L publication Critical patent/NO20074222L/no
Publication of NO342876B1 publication Critical patent/NO342876B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms

Abstract

En fremgangsmåte for storskalafermenteringen av svært produktive ansamitosinproduserende stammer. En fremgangsmåte for isolering av ubehandlede ansamitosiner. En fremgangsmåte for å rense ansamitosiner.

Description

Oppfinnelsens område
Oppfinnelsen vedrører fremgangsmåter for fremstillingen av ansamitosiner.
Ansamitosiner refererer til en blanding av ansamitosiner som har forskjellige C-3-estersidekjeder. Ansamitosiner kan bli konvertert til C-3-alkoholen maytansinol.
Bakgrunn for oppfinnelsen
Ansamitosiner er svært cytotoksiske forbindelser som er avledet fra fermentering av mikroorganismer, slik som Actinosynnema pretiosum. Ansamitosiner har blitt kjemisk konvertert til tiolinneholdende maytansinoider, hvis terapeutiske anvendelse i formen av cellebindingsmiddelmaytansinoidkonjugater har blitt beskrevet (U.S. patentskrift nr.
5 208 020, 5 416 064, 6 333 410 og 6 441 163).
Fermenteringsprosessen med Actinosynnema spp-stammer, slik som Actinosynnema pretiosum, produserer flere ansamitosintyper som inneholder ulike estersubstituenter på C-3 (fig. 1). De ulike C-3-esterne som blir produsert inkluderer (P-3 (iso-butyryl, P-3’ (n-butyryl) P-2 (propionyl), P-4 (iso-valeryl), P-4’ (n-valeryl). Alle disse esterne kan bli reduktivt kløyvd for å gi C-3-alkoholen maytansinol (P-0), som er forløperen for syntesen av tiolinneholdende maytansinoider. I tillegg blir mindre mengder av uønskede ansamitosiner som er modifisert på andre steder, slik som N-demetyl, 20-O-demetyl og 19-deklor, produsert. Ved reduktiv deasylering produserer ikke disse ansamitosinene maytansinol.
Fremgangsmåte for fremstillingen av ansamitosiner fra fermentering av Actinosynnema spp har blitt beskrevet (U.S. patentskrifter nr. 4 162 940, 4 450 234, 4 228 239, 4 331 598 og 4 356 265). Utbyttet av ansamitosiner som blir produsert varierer, der titre vanligvis strekker seg fra 12 mg/l til 100 mg/l. Ansamitosiner blir typisk gjenvunnet og renset ved hjelp av en flertrinnsprosess som involverer tilsetting av et filterhjelpemiddel og et organisk løsningsmiddel til hele fermenteringsbuljongen, etterfulgt av konsentrering av den organiske fasen og presipitering med petroleumseter.
Presipitatet ble ytterligere renset ved å benytte silikakromatografi og krystallisering, etterfulgt av ytterligere rensing ved hjelp av rekrystallisering eller kromatografi.
Fremgangsmåten er slik arbeidskrevende og involverer flere trinn der svært toksisk materiale må bli håndtert. Dette gjør oppskaleringen av en slik fremgangsmåte svært vanskelig. I tillegg må tryggheten for folk som utfører prosessen, bli sikret gjennom de ulike prosesseringstrinnene.
US 4307016 A beskriver demetylmaytansinoider fremstilt fra maytansinoider ved hjelp av enzymatisk transformasjon. US4322348A beskriver antistoff C-15003PND produsert ved å dyrke en mikroorganisme av slekten Nocardia. US5208020A angår cytotoksiske midler omfattende maytansinoider og deres terapeutiske bruk.
En nyere søknad (US 2002/00115984 A1) krever visse forbedringer i prosessen for fremstillingen av ansamitosiner. Ansamitosintitrene i fermenteringsbuljongen er rapportert å ha ligget fra 65 til 86 mg/l. De krevde forbedringene inkluderte varmeinaktivering av buljongen ved 75<o>C, ekstrahering inn i et aromatisk hydrokarbonløsningsmiddel, slik som toluen, kromatografi gjennom en åpen silikakolonne, etterfulgt av krystallisering. For å redusere kostnaden ved ansamitosinproduksjon, har nye Actinosynnema spp-stammer som gir vesentlig høyere titre (opp til 400 mg/l i fermentorer) enn de som er tidligere beskrevet, blitt produsert. Fremgangsmåtene som tidligere er beskrevet for fremstillingen av ansamitosiner har flere ulemper, og kan slik ikke bli tilpasset til de nye høyproduserende stammene som har blitt utviklet. Varmeinaktivering ved 75<o>C fører for eksempel til noe degradering av ansamitosin og et tap på 10 til 20 % i utbytte. Ekstrahering av fermenteringsbuljong inneholdende et høyt nivå av ansamitosin med aromatiske hydrokarboner er ueffektivt og ufullstendig, siden ansamitosinene ikke er høyt løselige i slike løsningsmidler. Rensing av ansamitosiner på åpne, selvpakkede silikakolonner har to ulemper: 1) variabilitet fra ladning til ladning når det gjelder renhet og gjenvinning og 2) vesentlig, human eksponering som fører til problemer med trygghet. Slik eksisterer det et behov for å fremstille ansamitosiner i høye utbytter og også for å tilveiebringe en effektiv fremgangsmåte for deres isolering og rensing, mens det samtidig minimaliseres eksponering overfor utøveren for det svært toksiske legemiddelet.
Oppsummering av oppfinnelsen
Et aspekt av oppfinnelsen er en fremgangsmåte for storskalafermentering av ansamitosinproduserende mikroorganismer, der prosessen er spesielt anvendelig på en ny, svært produktiv ansamitosinproduserende stamme.
Et annet aspekt av oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å isolere det ubehandlede ansamitosinet, og for å fremstille rensede ansamitosiner som omfatter de følgende trinnene:
1) eventuell inaktivering av kulturen, for eksempel ved eksponering overfor varme ved omtrent 50<o>C til 55<o>C eller ved tilsetning av 1 % etter volum med kloroform, 2) ekstrahering med et ikke-aromatisk, organisk løsningsmiddel, 3) konsentrering av ekstraktet, 4) rensing av konsentratet på en silika- eller aluminiumkolonne, fortrinnsvis en forhåndspakket silikahylsekolonne og 5) krystallisering av produktet.
Andre aspekter av oppfinnelsen inkluderer det følgende:
Fremgangsmåte for fremstilling av rensede ansamitosiner som omfatter trinnene med å: 1) dyrke en ansamitosin-produserende mikroorganisme i et flytende kulturmedium; 2) faststoff-fase-ekstrahere ansamitosiner fra kulturmediet på en hydrofob harpiks; 3) eluere ansamitosinene fra harpiksen ved hjelp av isokratisk eluering eller gradienteluering med et organisk løsningsmiddel eller et organisk løsningsmiddel kombinert med vann;
4) konsentrere de eluerte ansamitosinene, og
5) eventuelt rense ansamitosinene ved hjelp av enhver av a), b), c) og d):
a) adsorpsjonskromatografi over silikagel eller alumina,
b) krystallisering,
c) adsorpsjonskromatografi over silikagel eller alumina etterfulgt av krystallisering, og
d) krystallisering etterfulgt av adsorpsjonskromatografi over silikagel eller alumina.
og hvor nevnte ansamitosin har den følgende strukturen:
hvor R er H, COCH3, COCH2CH3, COCH(CH3)2, COCH2CH2CH3, COCH2CH(CH3)2 eller COCH2CH2CH2CH3.
Fremgangsmåte for fremstilling av rensede ansamitosiner som omfatter trinnene med å: i. dyrke en ansamitosin-produserende mikroorganisme i et flytende kulturmedium som inneholder en hydrofob harpiks;
ii. separere harpiksen ved hjelp av filtrering eller sentrifugering;
iii. eluere ansamitosinet med et organisk løsningsmiddel eller ett eller flere organiske løsningsmidler kombinert med vann;
iv. konsentrere de eluerte ansamitosinene, og
v. eventuelt rense ansamitosinene ved hjelp av enhver av a), b), c) og d):
a) adsorpsjonskromatografi over silikagel eller alumina,
b) krystallisering,
c) adsorpsjonskromatografi over silikagel eller alumina etterfulgt av krystallisering, og
d) krystallisering etterfulgt av adsorpsjonskromatografi over silikagel eller alumina.
og hvor nevnte ansamitosin har den følgende strukturen:
I de ovenfor beskrevne fremgangsmåtene er det foretrukket at den ansamitosinproduserende mikroorganismen er Actinosynnema spp., mer foretrukket Actinosynnema pretiosum. Den ansamitosinproduserende mikroorganismen kan også være Actinosynnema pretiosum ATCC 31565 eller stammer som er avledet fra denne, eller Actinosynnema pretiosum PF4-4 (ATCC PTA-3921) eller stammer som er avledet fra denne. Som beskrevet i U.S. patentskrift nr. 4 450 234 ble Actinosynnema pretiosum ATCC 3165 deponert hos (i) Institute for Fermentation, Osaka, 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532-8686, Japan den 20. august 1979 under aksesjonsnummeret IFO 13963 (ii) National Institute of Bioscence and Human Technology (tidligere Fermentation Research Institute), Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, higashi 1-chrome, Tsukuba-shi, Ibarakiken 305, Japan, den 29. august 1979 under aksesjonsnummeret FERM-P NO. 5185 og (iii) the American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. Manassas, Virginia 20110-2209 USA, den 11. september 1979 under aksesjonsnummeret ATCC31565. I tillegg ble Actinosynnema pretiosum PF4-4 deponert under retningslinjene i Budapestavtalen hos the American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209, USA, den 11. desember 2001 og har blitt gitt aksesjonsummer ATCC PTA-3921.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 viser strukturen til ulike ansamitosin-C-3-estere som kan ble fremstilt ved fermentering, i tillegg til C-3-alkoholen maytansinol (P-0).
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Det blir tilveiebrakt fremgangsmåter for å dyrke en mikroorganisme som er svært produktiv for ansamitosiner i et flytende kulturmedium i store fermentorer.
Fremgangsmåter ble også tilveiebrakt for ekstraheringen av ansamitosinet fra kulturbuljongen og mikroorganismen inn i et ikke-aromatisk, ikke-vannblandbart, organisk løsningsmiddel, der ansamitosinet er svært løselig, og for rensingen av ansamitosinet ved passering gjennom en silika- eller en aluminakolonne, hvis dette er nødvendig, og fortrinnsvis er disse kolonnene forhåndspakkede hylser, etterfulgt av krystallisering av produktet. Hvis nødvendig, kan mikroorganismen bli inaktivert ved hjelp av varmebehandling eller behandling med kloroform før ekstraheringstrinnet.
De rensede ansamitosinene som kan inkludere en blanding av ulike C-3-estere, slik som ansamitosinene P-3, P-3’, P-4, P-4’, P-2 og P-1 (fig. 1) kan bli behandlet med et reduksjonsmiddel for å gi den ønskede C-3-hydroksylforbindelsen maytansinol (P-0). De rensede ansamitosinene inneholder typisk mindre mengder av uønskede ansamitosiner som har modifiseringer på steder på molekylet som er forskjellig fra C-3-posisjonen. Fortrinnsvis er den ansamitosinproduserende stammen Actinosynnema spp. Mer foretrukket er mikroorganismen Actinosynnema pretiosum. Mikroorganismen kan også være Actinosynnema pretiosum PF4-4 (ATCC PTA-3921) og derivater derav og Actinosynnema pretiosum ATCC 31565 og derivater derav. Mikroorganismen kan bli rykket ved hjelp av fermenteringskulturteknikker som er kjent for fagfolk på området, ved å benytte de spesifikke mediene som er beskrevet her eller i ethvert annet medium som er beskrevet på fagområdet (U.S. patentskrift nr. 4 162 940, 4 450 234, 4228 239, 4 331 598 og 4 356 265).
I en utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er dyrkningen av mikroorganismen i et flytende kulturmedium. Dyrkning av bakteriestammen PF4-4 blir utført under kontrollerte betingelser og kan benytte et bredt utvalg av medier og betingelser. PF4-4 kan for eksempel bli dyrket ved lignende betingelser og med lignende medier i forhold til de som er beskrevet for ATCC 31565 eller ATCC 31281 ifølge U.S. patentskrifter nr. 4 137 230, 4 162 940, 4 331 598, 4 356 265 og 4 450 234 og som beskrevet i Hatano et al. Agric. Biol. Chem. 48, 1721-1729, 1984. Stammen PF4-4 tolererer slik et bredt utvalg av karbonkilder, som også støtter fermenteringsproduksjon av ansamitosiner. Eksempler på vekstmedier er gitt i tabell 1 og 2. Tabell 1 viser medier som støtter produksjon av ansamitosiner ved ansamitosinproduserende mikroorganismer, slik som Actinosynnema pretiosum PF4-4, og tabell 2 viser ytterligere medier som er passende for frembringelsen og/eller veksten av Actinosynnema pretiosum P4-4 og andre ansamitosinproduserende mikroorganismer.
Tabell 1. Sammensetning av produksjonsmedier (verdier er i % vekt/volum)
Sterilisering foregikk ved 121<o>C i 20 minutter. Tilsatt sist.
Tabell 2. Beslektede medier
Skråkultur og platekultur, CM4-1-agar
(%, vekt/volum)
Gjærekstrakt (Difco) 0,3
Maltekstrakt (Difco) 0,3
Soytone (Difco) 0,5
Glyserol (Difco) 1,0
Baktoagar (Difco) 2,0
Juster pH til 6,5 før sterilisering, sterilisering: 121<o>C, 20 minutter
Utsåingsmedium, VM4-1’
(%, vekt/volum)
Løselig stivelse (BDH) 2,0
Glukose (Shuling) 1,0
Soyabønnemel (ADM) 1,0
Corn Steep Liquor (Solulys) 0,5
Soytone (Difco) 0,5
NaCl (Wako) 0,3
CaCO3 (Hayashi) 0,5
pH 6,8, sterilisering: 121<o>C, 20 minutter
Foretrukne fremgangsmåter for fermenteringsproduksjon av ansamitosiner fra stamme PF4-4 er ytterligere beskrevet i eksempel 1 og 2 nedenfor.
Fermentering
Dyrkningen kan bli utført ved kulturbetingelser, slik som stasjonær, risting, aerob nedsenket eller enhver annen dyrkningsbetingelse. For god kulturvekst og høy produksjon av ansamitosiner i store tankfermentorer er aerob nedsenket kultur foretrukket.
Ansamitosinproduksjonen kan ytterligere blir forbedret ved å tilsette næringsstoffene i løpet av fermenteringen. Når man dyrker organismen i FM4-6-medium, kan for eksempel ytterligere tilsetning av glukose i hele varigheten av fermenteringen eller av glukose i omtrent de første 24 til 72 timer, fortrinnsvis i omtrent de første 48 timene, etterfulgt av tilsetning av glukose og et proteinnæringsmiddel, slik som bomullsfrømel (f.eks. Proflo eller Pharmamedia fra Trader’s Protein, Memphis, TN) eller soyabønnemel og en alkohol eller et aldehyd for å fremme dannelsen av D-3-estersidekjeden, slik som isobutanol, isobutyraldehyd, n-butanol, n-butyraldehyd, n-propanol, n-propionaldehyd, isopropanol, isopropionaldehyd, pentanol, valeraldehyd, isopentanol, isovaleraldehyd inntil slutten på fermenteringen, føre til dobling av ansamitosinproduksjon. Mens dyrkningsbetingelsene er avhengig av mediet som blir benyttet og produksjonsskalaen, er det normalt foretrukket å utføre fermenteringen i pH-området på omtrent 5 til 9, fortrinnsvis med en utgangs-pH på omtrent 6,5 til 8,0. Mer foretrukket er pH-området på omtrent 7 til 8, enda mer foretrukket omtrent 7 til 7,4. Den mest foretrukne pH-verdien er omtrent 7,2. Temperaturen kan strekke seg fra omtrent 15<o>C til 35<o>C, med et foretrukket temperaturområde på omtrent 25<o>C til 30<o>C. Mer foretrukket er temperaturen omtrent 28<o>C. Fermenteringen blir fortsatt inntil den maksimale ansamitosinakkumuleringen har blitt oppnådd. Dyrkningstiden kan variere og avhenger av flere faktorer, inkludert dyrkningsfremgangsmåten, sammensetningen av mediet og temperaturen. Typisk strekker fermenteringstiden seg fra 96 til 336 timer.
Analyse av ansamitosiner
I U.S. patentskrift nr. 4 331 598 og 4 450 234 er opphavsstammen ATCC 31565 tilkjennegjort som å produsere to klasser av ansamitosiner som kan bli skilt fra hverandre ved tilstedeværelsen av en metyl- eller hydroksymetylgruppe på C-14 (se fig. 1). For begge klasser blir flere ulike ansamitosiner produsert som er forskjellige på deres respektive asylsidekjede bundet til C-3-oksygenatomet og med hensyn til hvorvidt D-14 bærer en metyl- eller en hydroksymetylgruppe (eller i påfølgende undersøkelser, N-demetyl). Nomenklaturet som blir benyttet her for de permuterte forbindelsene, er definert ovenfor med referanse til fig. 1.
Ansamitosin P-3 er hovedproduktet til PF4-4 og opphavsstammen ATCC 31565, ved visse dyrkningsbetingelser. Hvis bakterien blir dyrket i nærvær av valin eller isosmørsyre (se U.S. patentskrift nr. 4 228 239) eller isobutylalkohol eller isobutyraldehyd (se U.S. patentskrift nr. 4 356 265), så er andre ansamitosinforbindelser kun til stede i mindre mengder. Når PF4-4-stamme dyrket i ulike fermenteringsmedier (betegnet FM i tabell 1), som alle inneholder isobutylalkohol, så er ansamitosin P-3 det fremherskende ansamitosinet som blir produsert. I en fremgangsmåte for å analysere mengden av ansamitosiner blir prøver av fermenteringsbuljongene fortynnet med etanol eller acetonitril, deretter ristet kraftig og til slutt sentrifugert. Supernatanten blir deretter analysert for innhold av ansamitosin P-3.
Ansamitosinet blir fortrinnsvis fraksjonert og analysert ved hjelp av reversfasehøyomsetningsflytende kromatografi (HPLC), men enhver passende teknikk, slik som for eksempel MALDI-TOF eller tynnsjiktskromatografi, kan bli benyttet. I en fremgangsmåte blir fermenteringsbuljonger ekstrahert med organiske løsningsmidler, slik som etylacetat, metylenklorid eller kloroform, og innholdet av P-3 i det organiske løsningsmiddelet ble bestemt ved hjelp av HPLC, ved å benytte reversfase-C18- eller C-8-kolonner.
Ekstrahering av ansamitosiner
Ansamitosiner kan bli ekstrahert fra fermenteringsbuljongen ved hjelp av fremgangsmåter som generelt blir benyttet til gjenvinningen av sekundære metabolitter. Siden ansamitosinene er lett løselige i ikke-aromatiske løsningsmidler, kan de enkelt bli ekstrahert ved å røre ut med ikke-aromatiske, ikke-vannblandbare løsningsmidler, slik som alkylacetater, der alkylkjeden er lineær eller forgrenet og har 1 til 5 karbonatomer, dialkylketoner og halogenerte løsningsmidler. Eksempler på passende alkylacetater inkluderer n-butylacetat, etylacetat og metylacetat. Et eksempel på et passende dialkylketon er metylisobutylketon. Et eksempel på et passende, halogenert løsningsmiddel er diklormetan. Ekstrahering med n-butylacetat er foretrukket. Fortrinnsvis er forholdet mellom fermenteringsbuljongen og det ikke-aromatiske, ikke-vannblandbare løsningsmiddelet 1:1 etter volum.
Ansamitosiner kan også bli adsorbert fra fermenteringsbuljongen på ulike harpikser, slik som Amberlite XAD-4, XAD-16 som er tilgjengelig kommersielt fra Rohm and Haas Company, Diaion HP20, HP21, Sepabeads SP825, SP850, SP70, SP700, som er kommersielt tilgjengelige fra Mitsubishi Chemical Industries Ltd. Disse eksemplene er ikke begrensende i omfang, og andre harpikser som er kjent for fagfolk på området kan også bli benyttet for formålet ovenfor. Harpiksen kan også bli benyttet som en belegning på en sekundær struktur, slik som en magnet eller høytetthetsmateriale, slik at polymeren kan bli gjenvunnet fra buljongen magnetisk eller ved hjelp av fremgangsmåter som støtter seg på adsorbenttetthet, slik som ekspandert kromatografi. Straks ansamitosiner er adsorbert på harpiksen, kan de ble eluert ved å benytte ett eller flere organiske løsningsmidler ved hjelp av isokratisk eluering eller gradienteluering. I en utførelsesform kan harpiksen bli tilsatt direkte til buljongen for å ekstrahere ansamitosiner.
Ansamitosiner kan bli gjenvunnet fra harpiksen på flere ulike måter. I en utførelsesform kan harpiksen bli gjenvunnet ved hjelp av filtrering. I en annen utførelsesform kan harpiksen bli gjenvunnet ved hjelp av sentrifugering, og pelletten kan bli eluert med ett eller flere organiske løsningsmidler eller med ett eller flere organiske løsningsmidler kombinert med vann. I en tredje utførelsesform kan vandig fase og faste avfallsstoffer bli fjernet fra harpiksen ved hjelp av ekspandert kromatografi. Harpiksen kan deretter bli sammenpresset i den ekspanderte kolonnen og eluert med ett eller flere organiske løsningsmidler eller med ett eller flere organiske løsningsmidler kombinert med vann ved hjelp av isokratisk eluering eller gradienteluering. I en fjerde utførelsesform kan harpiksen ekstrahere ansamitosiner mens det blir separert fra fermenteringsbuljongen ved hjelp av en delvis gjennomtrengelig membran. En dialysemembran pakket med harpiks kan for eksempel bli omrørt med fermenteringsbuljongen, vann og lavmolekylærvektkomponenter kan passere gjennom membranen, for å tillate ansamitosiner å binde til harpiksen. Dialyseposen kan deretter bli fjernet fra buljongen, og gjenvunnet harpiks kan deretter bli eluert som beskrevet ovenfor.
Før ekstrahering kan mikrobene i fermenteringsbuljongen bli inaktivert, hvis dette er ønskelig, ved eksponering overfor mild oppvarming til omtrent 50 til 55<o>C i omtrent 30 minutter til omtrent 2 timer, eller ved tilsetningen av 1 % (volum/volum). kloroform (Toru Hasegawa et al. 1983, Int. J. Syst. Bacteriol, 33:314-320).
Før eller i løpet av ekstraheringen kan fremgangsmåten også inkludere behandling av kulturmediet for å fremme løsningsmiddelekstrahering av ansamitosiner. Behandlingen kan inkludere, men er ikke begrenset til, oppvarming, justering av pH eller enzymatisk behandling eller kjemisk behandling, slik som tilsetningen av polyjernsulfat, de-emulgeringsmidler, fuktede silikaorkoløsningsmidler, slik som aceton eller alkoholer, slik som metanol.
I tilfellet med organisk faseekstrahering blir ekstraheringen utført ved en pH på mellom 2,0 - 13,0, men fortrinnsvis ved en pH på omtrent 6,0 til 7,0, og mer foretrukket ved en pH på omtrent 6,5 til 7,0 og fortrinnsvis med n-butylacetat. For å forbedre effektiviteten av ekstraheringen, kan buljongen bli opprettholdt ved en temperatur på mellom 5<o>C og 80<o>C, fortrinnsvis mellom 30<o>C og 45<o>C i løpet av ekstraheringsprosessen.
Ekstraheringstiden avhenger av flere faktorer, inkludert sammensetningen av buljongen, temperaturen i buljongen og ekstraheringsløsningsmiddel, fremgangsmåten for blanding av buljong og løsningsmiddel og løsningsmiddelet som blir benyttet til ekstrahering. Ekstraheringstider strekker seg fra 1 time til 120 timer, avhengig av ekstraheringsfremgangsmåten. Når en rask ekstraherings- og filtreringsprosess blir valgt, kan for eksempel ekstraheringstiden strekke seg fra omtrent 1-12 timer.
Filterhjelpemidler kan bli benyttet i løpet av filtrering. Slike hjelpemidler, inkluderer, men er ikke begrenset til Celpure P1000, Celatom FW-80, Hyflo Super Cel og kilsegur. Eventuelt kan filterhjelpemidler bli tilsatt direkte til buljongen i løpet av filtrering. Filtre kan eventuelt også være forhåndsbelagte med et filterhjelpemiddel.
Filtreringsfremgangsmåter som kan bli benyttet i denne prosessen, inkluderer, men er ikke begrenset til, tangensflowfiltrering, filterhjelpemiddelbelagt ”scraping-drum”-filtrering eller batchfiltrering.
I tilfeller der ekstraheringen blir utført ved pH-ekstremverdier, slik som pH 1 til pH 5 eller pH 8 til pH 13 eller ved svært forhøyede temperaturer, slik som 60<o>C til 90<o>C, bør ekstraheringen bli fullført ved en hastighet som unngår omfattende nedbrytning av ansamitosiner. Hvis nødvendig, kan ekstraheringen også bli utført ekstremt raskt ved hjelp av kontinuerlig sentrifugering. I et slikt tilfelle vil pH eller temperaturen i fermenteringsbuljongen bli justert ettersom buljongen går inn i sentrifugen, slik at forlenget eksponering overfor uhensiktsmessige betingelser blir unngått. Eksempler på sentrifugeringsutstyr som har blitt benyttet i fermenteringsprosessering og som kan bli benyttet for å ekstrahere ansamitosiner, inkluderer, men er ikke begrenset til, sentrifugedekanterere og ”stacked-disc”-sentrifuger. Det tilbakeholdte, organiske løsningsmiddelekstraktet kan deretter bli konsentrert under redusert trykk for å gi en rest som inneholder ansamitosiner. Alternativt kan et vannblandbart løsningsmiddel bli blandet med fermenteringsbuljongen og sentrifugert for å fjerne faste stoffer for å gi en enkeltfaseløsning som er fri for faste stoffer. Løsningen kan deretter bli prosessert, for eksempel ved å tilsette et ikke-vannblandbart løsningsmiddel for å forårsake operasjonen av de organiske og vandige fasene etterfulgt av konsentrering av den organiske fasen.
Vandig vasking av ansamitosiner i løsning
Ansamitosiner i en løsning av ikke-vannblandbart, organisk løsningsmiddel kan bli vasket med vann, vandig syre, vandig base, delvis eller fullt saltmettet vann eller en kombinasjon av hver av de beskrevne, vandige vaskingene. Eksempler på vandige syrer inkluderer, men er ikke begrenset til, vandige løsninger av saltsyre, svovelsyre, eddiksyre, maursyre og fosforsyre ved en pH på mellom 1 til 6,9. I konteksten av denne oppfinnelsen inkluderer en vandig syre også et surt, vandig, bufret system. Eksempler på syre, bufrede systemer inkluderer, men er ikke begrenset til, natriumfosfat, kaliumfosfat, ammoniumacetat og ammoniumformat, der hver blir pH-justert for anvendelse i deres respektive, sure bufferområder. Eksempler på vandige baser inkluderer, men er ikke begrenset til, vandige løsninger av natriumbikarbonat, kaliumbikarbonat, natriumkarbonat, natriumhydroksid, ammoniumhydroksid og natriumfosfat ved en pH på mellom 7,1 til 13. I konteksten av denne oppfinnelsen inkluderer en vandig base også et basisk, vandig, bufret system. Eksempler på basiske, bufrede systemer, inkluderer, men er ikke begrenset til, natriumfosfat, kaliumfosfat, natriumborat og ammoniumkarbonat der hvert er pH-justert til anvendelse i deres respektive, basiske bufferområder.
De sure eller basiske vaskingene må bli ferdig utført uten påvisbar nedbryting av ansamitosinene og vil variere med pH. Hvis nødvendig, kan ekstremt raske ekstraheringer bli utført ved hjelp av sentrifugeteknikker. Eksempler på delvis eller fullt saltmettet vann inkluderer, men er ikke begrenset til, vandig natriumklorid ved ulike nivåer av metning, vandig natriumsulfat ved ulike nivåer av metning og vandig kaliumklorid ved ulike nivåer av metning. Vandige vaskinger kan også bli utført der en blanding av en fullt eller delvis mettet, vandig saltløsning blir kombinert med en vandig base eller en vandig syre.
Filtrering før ekstrahering
Før ekstrahering kan alternativt de faste stoffene i den ansamitosininneholdende fermenteringsbuljongen bli separert ved hjelp av filtrering eller sentrifugering.
Ansamitosiner i den faste cellemassen kan bli gjenvunnet ved å vaske med et løsningsmiddel, slik som etanol, vandig etanol eller andre organiske løsningsmidler, slik som etylacetat, butylacetat, diklormetan eller aceton, og er velkjente for fagfolk på området. Ansamitosinene i filtratet kan bli gjenvunnet ved hjelp av ekstrahering med et kjent, aromatisk, organisk løsemiddel som beskrevet på annet sted i søknaden.
Rensing av ansamitosiner
Råprodukter kan bli utsatt for rensingsprosedyrer, slik som adsorpsjonskromatografi over silikagel eller alumina, etterfulgt av rekrystallisering hvis det er nødvendig. Fortrinnsvis blir kromatografien utført på en forhåndspakket kolonne, slik som en Biotagesilikagelhylse ved å benytte Biotage-kromatografisystemet. De ønskede ansamitosinene kan bli eluert fra kolonnen ved å benytte en løsningsmiddelgradient ved å starte med en blanding av etylacetat og heksan og tilføre økende mengder metanol. Fraksjonene som inneholder de ønskede ansamitosinene, kan bli slått sammen og konsentrert. Hvis ønskelig, kan ansamitosinene ytterligere bli renset ved hjelp av krystallisering ved å benytte et løsningsmiddel, slik som etylacetat, for å løse opp produktet, og deretter tilsette et ikke-polart løsningsmiddel, slik som heptan eller heksan for å krystallisere ut det rene produktet. Uttrykket krystallisering, slik som det blir benyttet her, omfatter også uttrykket presipitering, ved at de faste stoffene som blir dannet fra løsning, kan ha enten en amorf eller en definert struktur.
Cellebindende middel/maytansinoidkomplekser Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan bli benyttet for å fremstille cellebindende middel/maytansinoidkomplekser som er nyttige som tumoraktiverte prolegemidler. Ansamitosiner som blir fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan gjennomgå reduktiv kløyving til maytansinol som kan bli benyttet som beskrevet i U.S. patentskrifter nr. 5 208 020, 5 416 064, 6 333 410 og 6 441 163 for å fremstille N-metyl-L-alanininneholdende maytansinoidderivater. Disse derivatene blir deretter konjugert til cellebindingsmidler, fortrinnsvis antistoffer, via ulike linkere, slik som disulfidinneholdende linkere.
EKSEMPLER
Oppfinnelsen vil nå bli illustrert med referanser til ikke-begrensende eksempler.
Eksempel 1: Fremstilling av ansamitosiner
Primær utsåing: Utsåingskulturmedium VM4-1’ (400 ml/flaske) omfattende 2 % løselig stivelse, 1 % glukose, 1 % soyabønnemel, 0,5 % corn steep liquor, (Roquette) 0,5 % Soytone, 0,3 % natriumklorid og 0,5 % kalsiumkarbonat ble helt inn i hver av elleve 2 liters kapasitetserlendmeyerflaske. Etter sterilisering ble hver av flaskene inokulert med PF4-4-(ATTCC PTA-3921)-kulturen. Flaskene ble innkubert ved 28<o>C på en orbital rister ved 230 rpm i 48 timer.
Sekundær utsåing: Innholdet i primærutformingsflaskene ble deretter slått sammen. En fermentor på 300 l ble fylt med 100 l av VM4-1’-utsåingsmediet. Etter sterilisering ble fermentoren inokulert med 4 l av den sammenslåtte, primære utsåingskulturen. Fermentoren ble opprettholdt ved 28<o>C, med risting ved 80 rpm. Det oppløste oksygennivået ble opprettholdt ved omtrent 30 % metning ved innluftning og økt risting hvis nødvendig. Etter inkubering i 24 timer var den sekundære utsåingskulturen ferdig til å bli overført til produksjonskarene.
Produksjon: To fermentorer på 300 l ble hver fylt med 250 l produksjonsmedium FM4-6 (se tabell 1). Etter sterilisering ble fermentorene hver inokulert med 15 l av den sekundære utsåingskulturen. Fermentorene ble opprettholdt ved 28<o>C med risting ved 107 ± 5 rpm og innlufting ved 0,4 vvm. Etter dag 2 ble det oppløste oksygeninnholdet opprettholdt over 30 % ved å øke ristingshastigheten til et maksimum på 170 ± 5 rpm, og innluftingshastigheten til et maksimum på 1 vvm. Ansamitosintitre ble målt daglig ved å ta en prøve av fermenteringsbuljongen og fortynne i etanol, etterfulgt av kvantitering ved hjelp av HPLC-analyse. Fermenteringen ble fortsatt inntil dag 10, og på dette tidspunktet hadde ansamitosintilveksten flatet ut. Ansamitosintitre på dag 10 i to fermentorer var henholdsvis 251 mg/l og 244 mg/l. pH-verdien i fermenteringsbuljongen ble justert til 6,5 ved tilsetning av fosforsyre. Fermentorene ble varmet opp til 55<o>C og oppretthold ved denne temperaturen i 1 time for å inaktivere mikroorganismen.
Fermentorene ble deretter kjølt ned til omkringliggende temperatur for ekstrahering med et organisk løsningsmiddel.
Eksempel 2: Fremstilling av ansamitosiner ved å benytte en tilsetningsladningsprosess
En produksjonsfermentor på 1500 l ble fylt med 900 l produksjonsmedium FM4-6 (se tabell 1). Etter sterilisering ble fermentoren inokulert med 54 l av den sekundære utsåingskulturen, fremstilt som beskrevet ovenfor. Fermentoren ble opprettholdt ved 28<o>C med risting ved 107 ± 5 rpm og innluftning ved 0,4 vvm. Fra 0 til
48 timer ble en vandig løsning av 28,5 % glukose tilsatt ved en hastighet på 0,39 ml/l/t. Fra 48 til 288 timer ble tilsetningen byttet til en stokkløsning omfattende 21,5 % glukose, 7,1 Proflo og 7,1 % isobutanol, som ble tilført ved en hastighet på 0,51 ml/l/t. Etter dag 2 ble det oppløste oksygeninnholdet opprettholdt over 20 % ved å øke ristingen til et maksimum på 170 ± 5 rpm, og innluftningen til et maksimum på 1 vvm. Ansamitosintitre ble målt daglig ved å ta en prøve av fermenteringsbuljongen og fortynne i etanol, etterfulgt av kvantitativ analyse ved hjelp av HPLC. Fermenteringen ble fortsatt inntil dag 13, og på dette tidspunktet hadde tilveksten av ansamitosinet flatet ut. Ansamitosintitre på dag 13 i fermentoren var 304 mg/l. pH-verdien i fermenteringsbuljongen ble justert til 6,5 ved tilsetning av fosforsyre.
Varmeinaktivering: Fermentoren ble varmet opp til 55<o>C og opprettholdt ved denne temperaturen i 1 time for å inaktivere mikroorganismen. Fermentorene ble deretter avkjølt til mellom 30 og 40<o>C for ekstrahering med et organisk løsningsmiddel.
Eksempel 3: Ekstrahering og kromatografisk rensing av ansamitosiner Fermenteringsbuljongen fra eksempel 2 ble blandet med et likt volum med nbutylacetat. Blandingen ble opprettholdt ved mellom 30 og 40<o>C til 45<o>C, og forsiktig omrørt, slik at blanding av de to fasene så vidt forekom på løsningsmiddelgrenseflaten. Ekstraheringen ble fortsatt i opptil 5 dager, eller inntil HPLC-analyse av den organiske fasen indikerte at >80 % av ansamitosinene hadde blitt ekstrahert. Den organiske fasen ble deretter separert og avdampet ved å benytte en fallende filmavdamper til et sluttvolum på mellom 20 og 50 l. Det konsentrerte ekstraktet ble overført til en flaske inneholdende 2,2 kg silikagel. De ubehandlede ansamitosinene ble belagt på silikagelen ved avdampning av løsningsmiddelet til tørrhet ved å benytte en roterende avdamper, som virker under redusert trykk. Den belagte silikaen ble deretter overført til en prøveinjeksjonsmodul (SIM) fremskaffet fra Biotage, Inc., Charlotesville, VA. SIM-modulen ble vasket med en blanding av sykloheksan og heksan (2:1 volum/volum) og deretter koblet til et Biotage 150 M-system utstyrt med en silikahylse. Det ønskede produktet ble eluert fra kolonnen ved å benytte en blanding av etylacetat:heksan:metanol (29,4:68,6:2,0, volum/volum/volum). Fraksjoner som inneholdt ansamitosiner ble slått sammen og løsningsmiddelet ble dampet av under redusert trykk. Produktet ble ytterligere tørket under høyt vakuum i 24 timer.
Eksempel 4: Rekrystallisering av ansamitosiner
Det tørre produktet fra trinnet ovenfor ble løst i varm etylacetat (23 ml/g rest). Blandingen ble opprettholdt ved mellom 60 til 75<o>C inntil fullstendig oppløsning av ansamitosinene ble oppnådd. Heptan (80 ml/g rest) ble tilsatt sakte, mens temperaturen ble opprettholdt i ladningen på mellom 60 til 75<o>C. Etter at alt heptanet hadde blitt tilsatt, ble ladningen tillatt avkjølt til romtemperatur. Krystallene ble gjenvunnet ved hjelp av filtrering og deretter tørket under høyt vakuum for å gi 221 gram rene ansamitosiner.
Eksempel 5: Ekstrahering av fermenteringsbuljong ved hjelp av filtrering Fermenteringsbuljong (200 ml) som var fremstilt som beskrevet i eksempel 2 ble kraftig blandet i 5 minutter med 200 ml n-butylacetat (200 ml), noe som førte til en emulsjon. Cellatom FW-80-filterhjelpemiddel (20 g) ble tilsatt, og blandingen ble vakuumfiltrert gjennom en buchner-trakt som var forhåndsbelagt med Cellatom FW-80-filterhjelpemiddel. Filtermassen ble vasket med 40 ml n-butylacetat. Filtratet, som nå var fritt for faste kontaminanter, som omfattet et klart, organisk og vandig lag, ble overført til en separatortrakt. Den vandige fasen ble fjernet. Den organiske fasen inneholdende ansamitosinene ble tilbakeholdt.
Eksempel 6: Ekstrahering av fermenteringsbuljong ved hjelp av sentrifugering ved å benytte et ikke-vannblandbart løsningsmiddel En del av fermenteringsbuljongen, som var fremstilt som beskrevet i eksempel 2, ble kraftig blandet med én del n-butylacetat i 2 minutter. Den resulterende emulsjonen ble sentrifugert i 1 minutt og den organiske fasen inneholdende ansamitosinene, som var fri for faste kontaminanter, ble samlet opp.
Eksempel 7: Ekstrahering av fermenteringsbuljong ved hjelp av sentrifugering ved å benytte et vannblandbart løsningsmiddel
En del fermenteringsbuljong, som var fremstilt som beskrevet i eksempel 2, ble kraftig blandet med én del aceton. Blandingen ble sentrifugert i 1 minutt for å spinne de faste stoffene ned til en pellett. Supernatanten ble tatt vekk og blandet med en halv del heksaner. Den vandige fasen ble separert og frembrakte en klar, organisk fase inneholdende ansamitosinene.
Eksempel 8: Fastfaseekstrahering av ansamitosinet ved å benytte hydrofobe XAD-16-kuler
En liter fermenteringsbuljong, som var fremstilt som beskrevet i eksempel 2, ble rørt sammen med 10 g XAD-16-kuler i 6 timer. Blandingen ble deretter sentrifugert, og supernatanten ble fjernet. Pelletten ble overført til en liten kolonne og eluert med deionisert vann, etterfulgt av 90:10 deionisert vann:acetonitril. Fraksjoner inneholdende ansamitosiner ble kombinert, og løsningsmiddel ble avdampet for å gi 112 mg konsentrert ekstrakt. HPLC-analyse indikerte at ekstraktet inneholdt 50 mg ansamitosiner.
Mens oppfinnelsen har blitt beskrevet i detalj, og med referanse til spesifikke utførelsesformer derav, så vil det være åpenbart for fagfolk på området at ulike endringer og modifiseringer kan bli gjort uten å fjerne seg fra ideen og omfanget av oppfinnelsen.
Alle publikasjoner som er referert til her er herved inkorporert ved referanse.

Claims (23)

  1. Patentkrav 1. Fremgangsmåte for fremstilling av rensede ansamitosiner som omfatter trinnene med å: 1) dyrke en ansamitosin-produserende mikroorganisme i et flytende kulturmedium; 2) faststoff-fase-ekstrahere ansamitosiner fra kulturmediet på en hydrofob harpiks; 3) eluere ansamitosinene fra harpiksen ved hjelp av isokratisk eluering eller gradienteluering med et organisk løsningsmiddel eller et organisk løsningsmiddel kombinert med vann; 4) konsentrere de eluerte ansamitosinene, og 5) eventuelt rense ansamitosinene ved hjelp av enhver av a), b), c) og d): a) adsorpsjonskromatografi over silikagel eller alumina, b) krystallisering, c) adsorpsjonskromatografi over silikagel eller alumina etterfulgt av krystallisering, og d) krystallisering etterfulgt av adsorpsjonskromatografi over silikagel eller alumina. og hvor nevnte ansamitosin har den følgende strukturen:
  2. hvor R er H, COCH3, COCH2CH3, COCH(CH3)2, COCH2CH2CH3, COCH2CH(CH3)2 eller COCH2CH2CH2CH3. 2. Fremgangsmåte for fremstilling av rensede ansamitosiner som omfatter trinnene med å: i. dyrke en ansamitosin-produserende mikroorganisme i et flytende kulturmedium som inneholder en hydrofob harpiks; ii. separere harpiksen ved hjelp av filtrering eller sentrifugering; iii. eluere ansamitosinet med et organisk løsningsmiddel eller ett eller flere organiske løsningsmidler kombinert med vann; iv. konsentrere de eluerte ansamitosinene, og v. eventuelt rense ansamitosinene ved hjelp av enhver av a), b), c) og d): a) adsorpsjonskromatografi over silikagel eller alumina, b) krystallisering, c) adsorpsjonskromatografi over silikagel eller alumina etterfulgt av krystallisering, og d) krystallisering etterfulgt av adsorpsjonskromatografi over silikagel eller alumina. og hvor nevnte ansamitosin har den følgende strukturen:
  3. 3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, hvor den ansamitosinproduserende mikroorganisme er Actinosynnema spp.
  4. 4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, hvor den ansamitosinproduserende mikroorganisme er Actinosynnema pretiosum.
  5. 5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, hvor den ansamitosinproduserende mikroorganisme er Actinosynnema pretiosum ATCC 31565 eller en stamme som er avledet fra denne.
  6. 6. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, hvor den ansamitosinproduserende mikroorganisme er Actinosynnema pretiosum PF4-4 (ATCC PTA-3921) eller en stamme som er avledet fra denne.
  7. 7. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 3, hvor ekstraheringen blir utført ved en pH på omtrent 6 til omtrent 7.
  8. 8. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 3, hvor ekstraheringen blir utført ved en temperatur på omtrent 30<o>C til omtrent 45<o>C.
  9. 9. Fremgangsmåte ifølge krav 1-8, hvor nevnte dyrkning foregår i produksjonsmedier ved en pH i området på omtrent 6,5 til omtrent 8.
  10. 10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, hvor pH-en ligger i området på omtrent 7 til omtrent 7,4.
  11. 11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, hvor pH-en er omtrent 7,2.
  12. 12. Fremgangsmåte ifølge krav 9, hvor temperaturen ligger i området på omtrent 15<o>C til omtrent 35<o>C.
  13. 13. Fremgangsmåte ifølge krav 9, hvor temperaturen ligger i området på omtrent 25<o>C til omtrent 30<o>C.
  14. 14. Fremgangsmåte ifølge krav 9, hvor temperaturen er omtrent 28<o>C.
  15. 15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, hvor temperaturen er omtrent 28<o>C og pH-en er omtrent 7,2.
  16. 16. Fremgangsmåte ifølge hvilke av kravene 1-15, hvor minst ett ytterligere næringsmiddel blir tilveiebrakt i løpet av nevnte dyrkning.
  17. 17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, hvor det ytterligere næringsmiddelet er en karbonkilde.
  18. 18. Fremgangsmåte ifølge krav 16, hvor det ytterligere næringsmiddelet er en karbonkilde, etterfulgt av en karbonkilde og et proteinnæringsmiddel.
  19. 19. Fremgangsmåte ifølge krav 16, 17 eller 18, hvor det ytterligere blir tilveiebrakt en alkohol eller et aldehyd som fremmer dannelsen av en C-3-estersidekjede for ansamitosinet i løpet av dyrkningen.
  20. 20. Fremgangsmåten ifølge krav 17 eller 18, hvor karbonkilden er glukose.
  21. 21. Fremgangsmåten ifølge krav 18, hvor proteinnæringsmiddelet er bomullsfrømel eller soyabønnemel.
  22. 22. Fremgangsmåten ifølge krav 19, hvor aldehydet eller alkoholen er valgt fra gruppen som består av isobutanol, isobutyraldehyd, n-butanol, n-butyraldehyd, n-propanol, npropionaldehyd, isopropanol, isopropionaldehyd, pentanol, valeraldehyd, isopentanol, isovaleraldehyd.
  23. 23. Fremgangsmåten ifølge krav 1 eller 2, hvor harpiksen er valgt fra gruppen bestående av Amberlite<TM>XAD-4, Amberlite<TM>XAD-16, Diaion<®>HP20, Diaion<®>HP21, Sepabeads<®>SP825, Sepabeads<®>SP850, Sepabeads<®>SP70, and Sepabeads<®>SP700. mitosiner.
NO20074222A 2005-01-19 2007-08-17 Fremgangsmåte for fremstilling av ansamitosiner. NO342876B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/037,104 US7432088B2 (en) 2003-05-08 2005-01-19 Methods for the production of ansamitocins
PCT/US2005/044783 WO2006078368A1 (en) 2005-01-19 2005-12-12 Methods for the production of ansamitocins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20074222L NO20074222L (no) 2007-10-18
NO342876B1 true NO342876B1 (no) 2018-08-20

Family

ID=36692550

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20074222A NO342876B1 (no) 2005-01-19 2007-08-17 Fremgangsmåte for fremstilling av ansamitosiner.

Country Status (27)

Country Link
US (1) US7432088B2 (no)
EP (2) EP2514828B1 (no)
JP (1) JP5106120B2 (no)
KR (3) KR101515873B1 (no)
CN (2) CN104745655A (no)
AU (1) AU2005325166B2 (no)
BR (1) BRPI0519624B8 (no)
CA (2) CA2834033C (no)
CR (1) CR9228A (no)
CY (1) CY1121372T1 (no)
DK (1) DK2514828T3 (no)
EA (1) EA012524B1 (no)
ES (1) ES2710875T3 (no)
HK (1) HK1211985A1 (no)
HU (1) HUE042312T2 (no)
IL (2) IL183918A (no)
LT (1) LT2514828T (no)
MX (1) MX2007008069A (no)
NO (1) NO342876B1 (no)
NZ (2) NZ555437A (no)
PL (1) PL2514828T3 (no)
PT (1) PT2514828T (no)
SG (1) SG158905A1 (no)
SI (1) SI2514828T1 (no)
TR (1) TR201901647T4 (no)
WO (1) WO2006078368A1 (no)
ZA (1) ZA200704918B (no)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002092771A2 (en) 2001-05-11 2002-11-21 Ludwig Institute For Cancer Research Specific binding proteins and uses thereof
US20100056762A1 (en) 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
CN101309739A (zh) * 2005-10-07 2008-11-19 斯图尔德环境咨询有限公司 用磁性载体去除试剂的方法
WO2007067698A2 (en) * 2005-12-08 2007-06-14 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Isolation of ansamitocins
TW200812687A (en) * 2006-07-10 2008-03-16 Sicor Inc Apparatus for the separation of a resin from a reaction mixture
CN100420754C (zh) * 2006-10-26 2008-09-24 浙江海正药业股份有限公司 一种制备蒽莎姆菌素的方法
EP2126127B1 (en) 2007-01-25 2016-09-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Use of anti-egfr antibodies in treatment of egfr mutant mediated disease
AU2008227123B2 (en) 2007-03-15 2014-03-27 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Treatment method using EGFR antibodies and src inhibitors and related formulations
SG183023A1 (en) 2007-07-16 2012-08-30 Genentech Inc Anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
EP2641618A3 (en) 2007-07-16 2013-10-23 Genentech, Inc. Humanized anti-CD79B antibodies and immunoconjugates and methods of use
EP2188311B1 (en) 2007-08-14 2016-10-05 Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. Monoclonal antibody 175 targeting the egf receptor and derivatives and uses thereof
IL295449A (en) 2008-01-31 2022-10-01 Genentech Inc and fusion antibody-drug-cd79b engineered antibodies cysteine-
EP2644204B1 (en) 2008-03-18 2017-04-19 Genentech, Inc. Combinations of an Anti-HER2 antibody-drug conjugate and pertuzumab
CN101319241B (zh) * 2008-07-17 2011-03-30 上海交通大学 安丝菌素的固体发酵方法
PE20120878A1 (es) 2009-04-01 2012-08-06 Genentech Inc ANTICUERPOS ANTI-FcRH5 E INMUNOCONJUGADOS
US20110165155A1 (en) 2009-12-04 2011-07-07 Genentech, Inc. Methods of treating metastatic breast cancer with trastuzumab-mcc-dm1
CN101921817A (zh) * 2010-09-07 2010-12-22 上海交通大学 安莎霉素发酵产量提高方法
WO2012074757A1 (en) 2010-11-17 2012-06-07 Genentech, Inc. Alaninyl maytansinol antibody conjugates
US8852435B2 (en) * 2011-11-29 2014-10-07 Therapeutics Proteins International, LLC Purification and separation treatment assembly (PASTA) for biological products
CN103255184B (zh) * 2012-02-15 2016-01-27 百奥泰生物科技(广州)有限公司 生产安丝菌素的发酵培养基
CN103805648B (zh) * 2012-11-13 2017-09-15 百奥泰生物科技(广州)有限公司 高产安丝菌素发酵工艺
US10208125B2 (en) 2013-07-15 2019-02-19 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Anti-mucin 1 binding agents and uses thereof
TWI541022B (zh) 2013-12-18 2016-07-11 應克隆公司 針對纖維母細胞生長因子受體－３（ｆｇｆｒ３）之化合物及治療方法
TW201711702A (zh) 2015-06-04 2017-04-01 應克隆公司 使用針對纖維母細胞生長因子受體３（ｆｇｆｒ３）之化合物的療法
ES2731377T3 (es) 2015-07-07 2019-11-15 Hoffmann La Roche Politerapia con un conjugado anticuerpo anti-HER2-fármaco y un inhibidor de bcl-2
CN105907681B (zh) * 2016-05-30 2019-11-19 苏州康聚生物科技有限公司 一种高产安丝菌素p-3的突变株及安丝菌素p-3的制备方法
CN108276427A (zh) * 2018-01-14 2018-07-13 常州大学 一种安丝菌素p-3的提取与分离纯化方法
CN108330113B (zh) * 2018-03-08 2019-05-28 山东省医药生物技术研究中心（山东省病毒研究所） 一株高底物专一性酰基转移酶的珍贵束丝放线菌及其应用
CN113444106A (zh) * 2020-03-25 2021-09-28 重庆乾泰生物医药有限公司 一种高纯度安丝菌素的制备方法
CN112630368A (zh) * 2020-12-18 2021-04-09 卓和药业集团有限公司 安丝菌素含量的高效液相色谱检测分析方法
CN117597450A (zh) * 2021-06-18 2024-02-23 杭州中美华东制药有限公司 安丝菌素p-3的提纯方法
CN115477658A (zh) * 2022-10-12 2022-12-16 道中道（菏泽）制药有限公司 一种有效降低安丝菌素p-3杂质的结晶方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4307016A (en) * 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4322348A (en) * 1979-06-05 1982-03-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
US5208020A (en) * 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2241418A1 (de) 1972-08-23 1974-03-07 S Morris Kupchan Antileukaemische ansamakrolide
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
JPS6034556B2 (ja) * 1977-03-31 1985-08-09 武田薬品工業株式会社 抗生物質ｃ−１５００３
JPS6010718B2 (ja) 1977-03-31 1985-03-19 武田薬品工業株式会社 メイタンシノ−ル，メイタナシンおよびメイタンシノ−ル・プロピオネ−トの製造法
US4162940A (en) 1977-03-31 1979-07-31 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing Antibiotic C-15003 by culturing nocardia
JPS53124692A (en) 1977-04-01 1978-10-31 Takeda Chem Ind Ltd Preparation of maytansinol, maytansine, and maytansinol, propionate
JPS53130495A (en) * 1977-04-01 1978-11-14 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic substance c-15003
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
JPS6016236B2 (ja) 1977-11-18 1985-04-24 武田薬品工業株式会社 抗生物質ｃ―１５００３ ｐ―３の製造法
JPS5529972A (en) 1978-08-24 1980-03-03 Takeda Chem Ind Ltd Preparation of maytansinol
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS56102793A (en) * 1979-12-28 1981-08-17 Takeda Chem Ind Ltd Preparation of antibiotic c-15003 p-3
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
CA2006408A1 (en) 1988-12-27 1990-06-27 Susumu Iwasa Bispecific monoclonal antibody, its production and use
DE10012120A1 (de) 2000-03-13 2001-09-27 Ktb Tumorforschungs Gmbh Therapeutische und diagnostische Ligandensysteme mit Transportmolekülbindenden Eigenschaften und diese enthaltende Arzneimittel
US6573074B2 (en) * 2000-04-12 2003-06-03 Smithkline Beecham Plc Methods for ansamitocin production
AU2001266853B2 (en) 2000-06-14 2005-02-17 Medarex, Inc. Prodrug compounds with an oligopeptide having an isoleucine residue
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US20020156274A1 (en) 2001-03-16 2002-10-24 Terfloth Gerald J. Process for preparing maytansinol
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
US6790954B2 (en) * 2002-01-29 2004-09-14 Immunogen, Inc. Mutant Actinosynnema pretiosum strain with increased maytansinoid production
WO2005020883A2 (en) * 2003-05-08 2005-03-10 Immunogen, Inc. Methods for the production of ansamitocins
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4307016A (en) * 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4322348A (en) * 1979-06-05 1982-03-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
US5208020A (en) * 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use

Also Published As

Publication number Publication date
EP2514828B1 (en) 2018-11-14
AU2005325166B2 (en) 2012-02-02
PT2514828T (pt) 2019-02-15
CA2834033A1 (en) 2006-07-27
MX2007008069A (es) 2007-08-21
BRPI0519624B1 (pt) 2021-01-19
NZ555437A (en) 2010-04-30
CR9228A (es) 2008-03-31
IL183918A0 (en) 2007-10-31
KR20070099576A (ko) 2007-10-09
EP1838863A4 (en) 2011-10-05
HK1211985A1 (en) 2016-06-03
US7432088B2 (en) 2008-10-07
CN101103120A (zh) 2008-01-09
US20050170475A1 (en) 2005-08-04
TR201901647T4 (tr) 2019-02-21
LT2514828T (lt) 2019-02-25
CA2595024C (en) 2014-02-04
EA012524B1 (ru) 2009-10-30
HUE042312T2 (hu) 2019-06-28
SI2514828T1 (sl) 2019-03-29
KR20130051019A (ko) 2013-05-16
EP1838863A1 (en) 2007-10-03
BRPI0519624B8 (pt) 2021-05-25
JP2008526267A (ja) 2008-07-24
NO20074222L (no) 2007-10-18
WO2006078368A1 (en) 2006-07-27
CY1121372T1 (el) 2020-05-29
BRPI0519624A2 (pt) 2009-02-25
DK2514828T3 (en) 2019-03-11
ES2710875T3 (es) 2019-04-29
IL183918A (en) 2013-07-31
CN104745655A (zh) 2015-07-01
IL215686A0 (en) 2011-11-30
ZA200704918B (en) 2008-11-26
EA200701310A1 (ru) 2008-06-30
NZ583446A (en) 2011-08-26
CA2834033C (en) 2017-01-24
KR101515873B1 (ko) 2015-04-29
EP2514828A2 (en) 2012-10-24
EP2514828A3 (en) 2013-07-03
AU2005325166A1 (en) 2006-07-27
KR20120099734A (ko) 2012-09-11
CA2595024A1 (en) 2006-07-27
IL215686A (en) 2013-07-31
JP5106120B2 (ja) 2012-12-26
PL2514828T3 (pl) 2019-04-30
SG158905A1 (en) 2010-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO342876B1 (no) Fremgangsmåte for fremstilling av ansamitosiner.
JPH0698010B2 (ja) 免疫抑制剤の新規な製造方法
WO2005020883A2 (en) Methods for the production of ansamitocins
US4366247A (en) Process for preparing tylactone
US20080269479A1 (en) Process for Isolation of Macrolide Compounds
US20030186394A1 (en) Process to prepare and isolate geldanamycin
AU2012201869B2 (en) Methods for the production of ansamitocins
CN101360832B (zh) 使用地中海拟无枝酸菌细胞制备11β-羟基-9β,10α-类固醇类的方法
CA2007679A1 (en) Microbial transformation product
NZ197869A (en) 5-0-mycarosyl-20-dihydro-20,23-dideoxytylonolide derivatives
JPH05310746A (ja) 抗菌性抗生物質ｔ−２６３６類およびその製造法
GB2185480A (en) Production of avermectins