JP2728406B2 - 抗性物質ａ／１６６８６複合体の製造方法 - Google Patents
抗性物質ａ／１６６８６複合体の製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
抗生物質A/16686はアクチノプラネス・エスピー（Act
inoplanes sp.）ATCC33076（微工研菌寄第5477号）の
培養物から単離されるデプシペプチド物質であり、下記
式式中、 を有する（The Journal of Antibiotics,Vol.42,No.2,p
p254−267（1989）参照）。 この抗生物質は、主としてグラム陰性バクテリアに対
して活性であり、米国特許第4,303,646号明細書（＝特
公昭62−51274号公報）に記載されているとおり、例え
ば、菌株アクチノプラネス・エス・ピー（Actinoplanes
sp.）ATCC33076を、同化可能な炭素源、同化可能な窒
素源および無機塩類を含有する培地で、深部好気性条件
下に、実質的な量の抗生活性物質が生成するまで培養
し、液体培地および菌糸体を低級アルカノールおよびク
ロロホルムから選ばれる有機溶媒で別々に抽出して該抗
生活性物質を回収し、抽出溶媒から回収した抗生物質を
クロロホルム：エタノール：水の4:7:2の混合物で処理
し、分離した油状生成物を水中に注ぎ入れ、固化した生
成物を分離し、さらにそれを溶離液としてアセトニトリ
ル:0.01NHClの1:1の混合物を用いるシリカゲルカラムク
ロマトグラフイーにより精製し、これによって抗生物質
A/16686塩酸塩を回収し、これを交叉結合したデキスト
ランゲルカラムを用いるクロマトグラフイーにより脱塩
し、そして必要に応じて、抗生物質A/16686塩酸塩を普
通の方法により対応する遊離塩基または他の生理学的に
許容しうる酸付加塩に変えることにより製造することが
できる。 因子A1、A2及びA3と称される３種の密接に関連した成
分が抗生物質A/16686から単離、同定され、それぞれの
理化学的性質と共に報告されている（米国特許第4,427,
656号明細書＝特公昭62−54432号公報参照）。 因子A2は圧倒的な量で得られる成分であり且つ生物学
的活性に対して最も関係し、一方、因子A1及びA3は少量
で得られる。 現在の抗生物質による処置に対する抵抗性及び耐性の
発現の増加のために、新しい抗生物質に対する要求がな
お高い。 極めてよく定義され且つ規格化された組成を有する単
一の単離された形態または複合体の形態の抗生物質が特
に望まれている。 従つて、本発明の一目的は、発酵中にA/16686産生培
養物に所望の抗生物質因子の適当な前駆物質を加えるこ
とからなる因子A2及び／またはA3の単一成分を単離する
か、或いは該成分の１つまたは双方において複合体を富
ませるために抗生物質A/16686の該因子の生成を選択的
に高める方法である。 本発明の方法によれば、例えば工業的大規模発酵にお
いて、抗生物質A/16686複合体の単一の大部分の成分の
比を実際に調節することが可能である。従つて、本方法
は標準仕様を固守するために最終生成物の組成を調節す
る有用な手段を表わす。 更に、本発明の方法に従えば、産生菌株の発酵塊から
直接、抗生物質A/16686因子A2に極めて富んだ粗製の組
成物を得ることができ、次にこのものを高収率及び短期
間工程で純粋な状態において単離することができる。 抗生物質A/16686複合体における因子A2の比を増加さ
せる適当な前駆物質はロイシン、産生微生物に対して無
毒性である酸及び塩基とのその塩、イソ吉草酸、産生微
生物に対して無毒性である塩基とのその塩、モノ−及び
ポリヒドロキシ低級アルカノールとのそのエステル、α
−ケト−イソカプロン酸、産生微生物に対して無毒性で
ある塩基とのその塩、モノ−及びポリヒドロキシ低級ア
ルカノールとのそのエステル、イソアミルアルコール及
び産生微生物に対して無毒性である酸とのそのエステル
から選ばれる。 抗生物質A/16686複合体における因子A3の比を増加さ
せる適当な前駆物質はバリン、産生微生物に対して無毒
性である酸及び塩基とのその塩、α−ケト−イソ吉草
酸、産生微生物に対して無毒性である塩基とのその塩、
モノ−及びポリヒドロキシ低級アルカノールとのそのエ
ステル、イソ酪酸、産生微生物に対して無毒性である塩
基とのその塩、モノ−及びポリヒドロキシ低級アルカノ
ールとのそのエステル、イソブタノール及び産生微生物
に対して無毒性である酸とのそのエステルから選ばれ
る。 微生物に対して無毒性である塩基との塩は、与えたカ
チオンのタイプ及び濃度が、発酵塊に用いた濃度で顕著
な程度に微生物培養物の増殖または所望の抗生物質の産
生をそこなわぬような塩である。該カチオンの例はアル
カリ金属及びアルカリ土類金属、例えばナトリウム、カ
リウム、カルシウムまたはマグネシウムによるカチオ
ン、並びにアミン、例えばアンモニウム、第一、第二ま
たは第三（C1〜C4）アルキルアンモニウム及びヒドロキ
シ（C1〜C4）アルキルアンモニウムによるカチオンであ
る。好ましい塩はナトリウム、カリウムまたはアンモニ
ウムイオンによる塩である。 産生微生物に対して無毒性である酸との塩、即ち、発
酵塊中に存在する濃度で、微生物培養物の増殖または所
望の抗生物質の産生を顕著にそこなわぬ酸による塩の例
は好ましくは鉱酸、例えば塩酸であり、ある場合には、
また有機酸が存在していてもよい。 モノ−及びポリヒドロキシ低級アルカノールとの上に
定義した如き適当な前駆物質のエステルは１分子当り
１、２、３、４、５または６個のヒドロキシ官能基をも
つ（C1〜C6）アルカノールとのエステルである。（C1〜
C4）アルカノールを用いる場合、双方の因子の相伴う増
加を望まぬならば、該アルコールは他の抗生物質因子
（即ち、イソブタノールまたはイソアミルアルコール）
に対する前駆物質として作用するものとは異ならなけれ
ばならない。 ポリヒドロキシアルカノールの好ましい例はグリセリ
ン及びプロピレングリコールである。 本明細書において、低級アルカノールが異なるエナン
チオマー及びエピマー型で存在し得る場合、別個の各単
一型並びにあらゆる割合における該単一型の混合物を意
図する。 微生物に対して無毒性である上に定義した如き適当な
ヒドロキシ含有前駆物質のエステルは（C2〜C22）アル
カノイルエステルであり、その際に、発酵媒質中のアル
カノイル部分のタイプ及び濃度は微生物培養液の増殖ま
たは所望の抗生物質の生成を顕著な程度にそこなわぬよ
うなものである。一般に、直鎖状（C2〜C4）アルカノー
ルが好ましい。 抗生物質A/16686産生培養物は、培養した際に抗生物
質A/16686の回収可能な量を産生し得るアクチノプラネ
ス・エスピーATCC33076様菌株或いはその突然変異体ま
たは変種の培養物である。 本発明の方法には、一般にアクチノプラネスの培養に
対して、そして殊にA/16686産生培養物に公知の普通の
条件下で（上記引用の米国特許第4,303,646号参照）、
同化可能な炭素源、同化可能な窒素源及び無機塩を含有
する栄養培養媒質中で抗生物質A/16686産生培養物を培
養し、そして抗生物質A/16686因子A2及び／または因子A
3の産生を選択的に高めるために適当な前駆物質の有効
量を加えることが含まれる。 適当な前駆物質を発酵中に発酵液に連続的または回分
式に加えるか、或いは発酵前に培養媒質に加えることが
できる。該前駆物質を、発酵温度で適当な液体である場
合、直接加えることができるか、或いは溶液、懸濁液ま
たは乳液として加えることができ、そして好ましくは懸
濁液の水溶液である。 適当な前駆物質の「有効量」とは、発酵液に加えた場
合、産生微生物の増殖培養物に毒性効果をもたらすこと
なく、抗生物質A/16686の特定の因子の選択的増加をも
たらすために十分な選択的前駆物質の濃度を与える上に
定義した如き前駆物質の量を意味する。 前駆物質の添加割合は、発酵に毒性作用を与えること
なく、顕著なまたは最適な程度に所望の因子の収率を高
めるために十分に大きくなければならない。 一般に、発酵の開始時、または生成段階中に適当な前
駆物質の有効量を連続的または一部づつ供給することが
有利である。 発酵に続いて、必要に応じて、抗生物質A/16686複合
体或いは単一因子A2またはA3を公知の方法またはその明
白な変法に従つて回収することができる。 本発明の方法に使用し得るA/16686産生菌株の発酵に
適する栄養発酵媒質は通常次のものを含有する：例えば
糖（例えばグルコース、スクロース、マルトース）、多
糖類（例えば澱粉、デキストラン）、ポリアルコール
（例えばグリセリン、プロピレングリコール）から選ぶ
ことができる適当な炭素源；例えばアンモニウム塩、ア
スパラギン、落花生粉、大豆粉、肉エキス、トリプト
ン、酵母水解物、酵母エキス及びトウモロコシ処理液か
ら選ばれる適当な窒素源；並びに無機塩。培養媒質に混
合し得る無機塩の中には、ナトリウム、カリウム、鉄、
亜鉛、コバルト、マグネシウム、カルシウム、アンモニ
ウム、クロライド、カルボネート、スルフエート、ホス
フエート、ナイトレート等のイオンを与え得る普通の可
溶性塩がある。 通常、抗生物質−産生菌株を振盪フラスコ中で前培養
し、次にこの培養物を用いて、抗生物質の実質的な量を
生成するためのジヤー発酵器に接種する。前培養に用い
る媒質は多量の発酵に用いるものと同一であることがで
きるが、しかし、また他の媒質を用いることもできる。 発酵は25℃乃至35℃間、好ましくは27℃乃至33℃間の
温度で、水中に沈めた好気性条件下で50〜150時間の範
囲で行われる。適当な前駆物質の選択的有効量を産生菌
株の接種前に発酵媒質に添加することができるが、しか
しながら、発酵開始後、24〜48時間目に添加することが
好ましい。添加を１回に、または数回に分けて、或いは
連続的に行うことができる。 本発明を具体化する典型的な実験によれば、オートミ
ール寒天斜面に保持されたA/16686産生菌株の培養物を
植物性媒質100mlを含むフラスコ中に接種する。36時間
後、培養物の試料（5ml）を用いて、発酵媒質100mlを含
む一連の発酵用フラスコに接種する。発酵の24〜48時間
後、前駆物質の選択的有効量を適当に加える。A/16686
複合体の２種の因子の相伴う増加を望む場合には、同一
発酵フラスコに２種の適当な前駆物質を加える。発酵を
更に60〜150時間続け、次に発酵ケーキを除去し、汁試
料をHPLCによつて分析する。 抗生物質の回収は当該分野において公知の方法によつ
て行うことができる。 獣医薬として適用するためには、全体の発酵ケーキま
たは濃縮した汁を用いることができる。 発酵液に前駆物質の添加は、該物質がその前もつて決
められたpH値範囲に顕著に影響を及ぼさぬようにして行
われる。かくして、例えば遊離酸前駆物質を媒質に直接
加える場合、媒質を緩衝するか、または微生物に対して
無毒性の塩基で直ちに中和することによつて、pH値を調
節下で保持する。 加える前駆物質がアミノ酸である場合、このものを産
生微生物に対して無毒性である酸または塩基とのその
塩、例えば塩基酸及びナトリウム塩の水溶液として発酵
液に供給することができ、多くの例があるにしても、ア
ミノ酸を「分子内塩」の溶液として有利に加えることが
できる。前駆物質として、ラセミ混合物及び光学的活性
異性体の双方を用いることができる。 しかしながら、一般にＬ−型の添加により、対応する
Ｄ−型よりも高い収率が得られる。 従つて、本発明の方法の好ましい具体例は、抗生物質
A/16686複合体の因子A3（Ｌ−バリン、その塩またはエ
ステル）及び／または因子A2（Ｌ−ロイシン、その塩ま
たはエステル）の濃度を高めるために、アミノ酸前駆物
質のＬ−型の使用を表わす。この好ましい具体例によれ
ば、また複合体の80％以上に発酵生成物における因子A2
の百分率を増加させることができる。 低級アルカン酸前駆物質（イソ酪酸、イソ吉草酸、α
−ケト−イソ吉草酸及びα−ケト−イソカプロン酸）を
用いて、添加を無毒性の塩基によるその塩の水溶液とし
て行うことができる；通常、アンモニウム及びナトリウ
ム塩が好ましい。 モノヒドロキシ低級アルカノールによる上記低級アル
カン酸及び不飽和脂肪酸のエステルを前駆物質として用
いる場合、該エステルは通常メタノール、エタノール及
びプロパノールから誘導されるが、またC4〜C6アルカノ
ールによるエステルを用いることもできる。この場合、
他の因子の相伴う増加を望まぬならば、C4〜C6アルカノ
ールは他の因子に対して前駆物質として作用し得るもの
とは異ならなければならない（イソブタノールまたはイ
ソアミルアルコール）。 アルカノール前駆物質、例えばイソブタノール及びイ
ソアミルアルコールを通常発酵液にそのまま加える。し
かしながら、またこれらのものを微生物に対して無毒性
である酸のエステルとして供給することもできる。これ
らの酸は、他の因子の相伴う増加を望まぬならば、他の
A/16686因子に対する前駆物質として作用し得るものと
は異ならなければならない。通常、直鎖状（C2〜C4）ア
ルカン酸、例えば酢酸、プロピオン酸及び酪酸によるエ
ステルが好ましい。 本発明による発酵物質に加える「選択的有効量」は前
駆物質のタイプに依存する。通常、低級アルカン酸（イ
ソ酪酸、イソバレリアン酸）によつては、発酵媒質中に
酸の濃度0.1g/乃至5g/間の範囲を与える量を用い、
0.1g/乃至1g/間の範囲が好ましい。低級アルカノー
ル（イソブタノール、イソアミルアルコール）または微
生物に対して無毒性である酸によるそのエステルによつ
て、通常0.5g/乃至5g/間のアルコール濃度範囲を与
える量を用い、1g/乃至2g/間の範囲が好ましい。 アミノ酸（バリン、ロイシン）及びケト−酸（α−ケ
ト−イソ吉草酸、α−ケト−イソカプロン酸）または酸
及び塩基とのその塩によつては、通常、発酵媒質に加え
る「選択的有効量」は0.2g/乃至5g/間、好ましくは
0.5g/乃至4g/間の範囲であり；最も好ましくは２乃
至4g/間の範囲である。 低級アルカン酸（例えばイソ酪酸、イソバレリアン
酸）、またはその塩を発酵媒質に直接加える場合、「選
択的有効量」は通常、0.1g/乃至2.5g/間の範囲であ
り、0.3g/乃至1.5g/間の範囲が好ましい。 上に示したよりも高い濃度がA/16686因子の１つの相
対的百分率を高める際に有効であるが、しかし、一般に
全体の収率は培養液における毒性作用のために抑制され
る。 本発明の他の目的及び好ましい具体例は、酪酸誘導体
または発酵条件下で酪酸を放出し得る前駆物質をA/1668
6産生培養物に加えることからなる抗生物質A/16686複合
体、A/16686因子A2または因子A3の生成を高める方法を
表わす。 驚くべきことに、事実上、本発明の方法によるA/1668
6因子の生成の選択的強化は、A/16686因子の適当な前駆
物質と共に酪酸誘導体または前駆物質を加えた場合、更
に増加することが見出された。 酪酸誘導体または前駆物質の好ましい例は（C1〜C6）
アルキルエステル、モノ−及びポリヒドロキシアルキル
エステルである。 酪酸エチル及びトリ−ブチリンが殊に好ましい。 発酵媒質にいずれかの物質の添加に関連して、殊に適
当な前駆物質及び酪酸またはその誘導体もしくは前駆物
質の添加に関連して、「共に」なる用語には、加えた物
質の合同した効果が発酵において明示され得るような間
隔で、示した物質を同時にまたは逐次的に（かわるがわ
る及び逆に）加えることが包含される。 明らかに、またこの定義には「共に」加える１種また
は双方の物質が培養媒質にすでに加えられているか、或
いはその中にすでに存在している場合が含まれる。 一般に、酪酸誘導体または前駆物質を発酵媒質に0.5g
/〜2g/の酸の濃度を与える量で加える。 一般に、抗生物質複合体の収率が顕著に増加し、また
適当な前駆物質を加えた場合、得られた抗生物質因子の
百分率を約95〜98％に増加させることができる。 ロイシン、そして最も好ましくはＬ−ロイシンをトリ
−ブチリンまたは酪酸エチルと共にA/16686産生培養物
に発酵中に加えることからなる高収率及び純度での抗生
物質A/16686因子A2の製造方法が殊に好ましい。 以下の実施例は本発明の方法のある特定の具体例を更
に詳細に述べるものである。 実施例１ アクチノプラネス・エスピーATCC33076（FERM−P No.
5477）のオートミール寒天斜面を次の栄養媒質100mlを
含む容量500mlのフラスコに接種した（g/）。 大豆粉 13 グルコース 12 澱粉 13 CaCO3 4 回転振盪機上で28〜30℃で36時間後、培養液5mlを用
いて、次の発酵媒質100mlを含む容量500mlのフラスコに
接種した（g/）。 大豆粉 30 グリセリン 20 澱粉 4 グルコース 4 マルトース 20 スクロース 20 CaCO3 6 回転振盪機上で28〜30℃で24時間培養した後、適当な
前駆物質を加えた。90〜96時間培養後、発酵ケーキを遠
心分離によつて除去し、汁を次のHPLC法に従つて、抗生
物質A/16686因子におけるその含有量を分析した： a.グラジエント逆相分配によつて分離 装置：ポンプ：バリアン（Varian）5000A; 検出器バリアン、254nm インジエクター：レオダイン（Rheodyne）モデル7125; インテグレーター：スペクトラ・フイジイクス（Spectr
a Physics）モデル4000。 カラム：シラン処理したシリカゲル： ブラウンリー・ラボラトリイー（Brownlee Lab.）RP18
スフエリイ（Spheri） 移動相:0.05M NaH2PO4/アセトニトリル、 65:35、pH6 流速:1.8ml/分 注入:20μ 操作条件：同一濃度溶媒条件 保持時間:A/16686因子A1 6.69分 A/16686因子A2 10.16分 A/16686因子A3 16.29分 b.％分布 成分を上記の方法によつて分離し、その相対分布を、
面積百分率法によつて、３本のピークの合計の％として
得た。代表的な実験結果を以下に示す：
inoplanes sp.）ATCC33076（微工研菌寄第5477号）の
培養物から単離されるデプシペプチド物質であり、下記
式式中、 を有する（The Journal of Antibiotics,Vol.42,No.2,p
p254−267（1989）参照）。 この抗生物質は、主としてグラム陰性バクテリアに対
して活性であり、米国特許第4,303,646号明細書（＝特
公昭62−51274号公報）に記載されているとおり、例え
ば、菌株アクチノプラネス・エス・ピー（Actinoplanes
sp.）ATCC33076を、同化可能な炭素源、同化可能な窒
素源および無機塩類を含有する培地で、深部好気性条件
下に、実質的な量の抗生活性物質が生成するまで培養
し、液体培地および菌糸体を低級アルカノールおよびク
ロロホルムから選ばれる有機溶媒で別々に抽出して該抗
生活性物質を回収し、抽出溶媒から回収した抗生物質を
クロロホルム：エタノール：水の4:7:2の混合物で処理
し、分離した油状生成物を水中に注ぎ入れ、固化した生
成物を分離し、さらにそれを溶離液としてアセトニトリ
ル:0.01NHClの1:1の混合物を用いるシリカゲルカラムク
ロマトグラフイーにより精製し、これによって抗生物質
A/16686塩酸塩を回収し、これを交叉結合したデキスト
ランゲルカラムを用いるクロマトグラフイーにより脱塩
し、そして必要に応じて、抗生物質A/16686塩酸塩を普
通の方法により対応する遊離塩基または他の生理学的に
許容しうる酸付加塩に変えることにより製造することが
できる。 因子A1、A2及びA3と称される３種の密接に関連した成
分が抗生物質A/16686から単離、同定され、それぞれの
理化学的性質と共に報告されている（米国特許第4,427,
656号明細書＝特公昭62−54432号公報参照）。 因子A2は圧倒的な量で得られる成分であり且つ生物学
的活性に対して最も関係し、一方、因子A1及びA3は少量
で得られる。 現在の抗生物質による処置に対する抵抗性及び耐性の
発現の増加のために、新しい抗生物質に対する要求がな
お高い。 極めてよく定義され且つ規格化された組成を有する単
一の単離された形態または複合体の形態の抗生物質が特
に望まれている。 従つて、本発明の一目的は、発酵中にA/16686産生培
養物に所望の抗生物質因子の適当な前駆物質を加えるこ
とからなる因子A2及び／またはA3の単一成分を単離する
か、或いは該成分の１つまたは双方において複合体を富
ませるために抗生物質A/16686の該因子の生成を選択的
に高める方法である。 本発明の方法によれば、例えば工業的大規模発酵にお
いて、抗生物質A/16686複合体の単一の大部分の成分の
比を実際に調節することが可能である。従つて、本方法
は標準仕様を固守するために最終生成物の組成を調節す
る有用な手段を表わす。 更に、本発明の方法に従えば、産生菌株の発酵塊から
直接、抗生物質A/16686因子A2に極めて富んだ粗製の組
成物を得ることができ、次にこのものを高収率及び短期
間工程で純粋な状態において単離することができる。 抗生物質A/16686複合体における因子A2の比を増加さ
せる適当な前駆物質はロイシン、産生微生物に対して無
毒性である酸及び塩基とのその塩、イソ吉草酸、産生微
生物に対して無毒性である塩基とのその塩、モノ−及び
ポリヒドロキシ低級アルカノールとのそのエステル、α
−ケト−イソカプロン酸、産生微生物に対して無毒性で
ある塩基とのその塩、モノ−及びポリヒドロキシ低級ア
ルカノールとのそのエステル、イソアミルアルコール及
び産生微生物に対して無毒性である酸とのそのエステル
から選ばれる。 抗生物質A/16686複合体における因子A3の比を増加さ
せる適当な前駆物質はバリン、産生微生物に対して無毒
性である酸及び塩基とのその塩、α−ケト−イソ吉草
酸、産生微生物に対して無毒性である塩基とのその塩、
モノ−及びポリヒドロキシ低級アルカノールとのそのエ
ステル、イソ酪酸、産生微生物に対して無毒性である塩
基とのその塩、モノ−及びポリヒドロキシ低級アルカノ
ールとのそのエステル、イソブタノール及び産生微生物
に対して無毒性である酸とのそのエステルから選ばれ
る。 微生物に対して無毒性である塩基との塩は、与えたカ
チオンのタイプ及び濃度が、発酵塊に用いた濃度で顕著
な程度に微生物培養物の増殖または所望の抗生物質の産
生をそこなわぬような塩である。該カチオンの例はアル
カリ金属及びアルカリ土類金属、例えばナトリウム、カ
リウム、カルシウムまたはマグネシウムによるカチオ
ン、並びにアミン、例えばアンモニウム、第一、第二ま
たは第三（C1〜C4）アルキルアンモニウム及びヒドロキ
シ（C1〜C4）アルキルアンモニウムによるカチオンであ
る。好ましい塩はナトリウム、カリウムまたはアンモニ
ウムイオンによる塩である。 産生微生物に対して無毒性である酸との塩、即ち、発
酵塊中に存在する濃度で、微生物培養物の増殖または所
望の抗生物質の産生を顕著にそこなわぬ酸による塩の例
は好ましくは鉱酸、例えば塩酸であり、ある場合には、
また有機酸が存在していてもよい。 モノ−及びポリヒドロキシ低級アルカノールとの上に
定義した如き適当な前駆物質のエステルは１分子当り
１、２、３、４、５または６個のヒドロキシ官能基をも
つ（C1〜C6）アルカノールとのエステルである。（C1〜
C4）アルカノールを用いる場合、双方の因子の相伴う増
加を望まぬならば、該アルコールは他の抗生物質因子
（即ち、イソブタノールまたはイソアミルアルコール）
に対する前駆物質として作用するものとは異ならなけれ
ばならない。 ポリヒドロキシアルカノールの好ましい例はグリセリ
ン及びプロピレングリコールである。 本明細書において、低級アルカノールが異なるエナン
チオマー及びエピマー型で存在し得る場合、別個の各単
一型並びにあらゆる割合における該単一型の混合物を意
図する。 微生物に対して無毒性である上に定義した如き適当な
ヒドロキシ含有前駆物質のエステルは（C2〜C22）アル
カノイルエステルであり、その際に、発酵媒質中のアル
カノイル部分のタイプ及び濃度は微生物培養液の増殖ま
たは所望の抗生物質の生成を顕著な程度にそこなわぬよ
うなものである。一般に、直鎖状（C2〜C4）アルカノー
ルが好ましい。 抗生物質A/16686産生培養物は、培養した際に抗生物
質A/16686の回収可能な量を産生し得るアクチノプラネ
ス・エスピーATCC33076様菌株或いはその突然変異体ま
たは変種の培養物である。 本発明の方法には、一般にアクチノプラネスの培養に
対して、そして殊にA/16686産生培養物に公知の普通の
条件下で（上記引用の米国特許第4,303,646号参照）、
同化可能な炭素源、同化可能な窒素源及び無機塩を含有
する栄養培養媒質中で抗生物質A/16686産生培養物を培
養し、そして抗生物質A/16686因子A2及び／または因子A
3の産生を選択的に高めるために適当な前駆物質の有効
量を加えることが含まれる。 適当な前駆物質を発酵中に発酵液に連続的または回分
式に加えるか、或いは発酵前に培養媒質に加えることが
できる。該前駆物質を、発酵温度で適当な液体である場
合、直接加えることができるか、或いは溶液、懸濁液ま
たは乳液として加えることができ、そして好ましくは懸
濁液の水溶液である。 適当な前駆物質の「有効量」とは、発酵液に加えた場
合、産生微生物の増殖培養物に毒性効果をもたらすこと
なく、抗生物質A/16686の特定の因子の選択的増加をも
たらすために十分な選択的前駆物質の濃度を与える上に
定義した如き前駆物質の量を意味する。 前駆物質の添加割合は、発酵に毒性作用を与えること
なく、顕著なまたは最適な程度に所望の因子の収率を高
めるために十分に大きくなければならない。 一般に、発酵の開始時、または生成段階中に適当な前
駆物質の有効量を連続的または一部づつ供給することが
有利である。 発酵に続いて、必要に応じて、抗生物質A/16686複合
体或いは単一因子A2またはA3を公知の方法またはその明
白な変法に従つて回収することができる。 本発明の方法に使用し得るA/16686産生菌株の発酵に
適する栄養発酵媒質は通常次のものを含有する：例えば
糖（例えばグルコース、スクロース、マルトース）、多
糖類（例えば澱粉、デキストラン）、ポリアルコール
（例えばグリセリン、プロピレングリコール）から選ぶ
ことができる適当な炭素源；例えばアンモニウム塩、ア
スパラギン、落花生粉、大豆粉、肉エキス、トリプト
ン、酵母水解物、酵母エキス及びトウモロコシ処理液か
ら選ばれる適当な窒素源；並びに無機塩。培養媒質に混
合し得る無機塩の中には、ナトリウム、カリウム、鉄、
亜鉛、コバルト、マグネシウム、カルシウム、アンモニ
ウム、クロライド、カルボネート、スルフエート、ホス
フエート、ナイトレート等のイオンを与え得る普通の可
溶性塩がある。 通常、抗生物質−産生菌株を振盪フラスコ中で前培養
し、次にこの培養物を用いて、抗生物質の実質的な量を
生成するためのジヤー発酵器に接種する。前培養に用い
る媒質は多量の発酵に用いるものと同一であることがで
きるが、しかし、また他の媒質を用いることもできる。 発酵は25℃乃至35℃間、好ましくは27℃乃至33℃間の
温度で、水中に沈めた好気性条件下で50〜150時間の範
囲で行われる。適当な前駆物質の選択的有効量を産生菌
株の接種前に発酵媒質に添加することができるが、しか
しながら、発酵開始後、24〜48時間目に添加することが
好ましい。添加を１回に、または数回に分けて、或いは
連続的に行うことができる。 本発明を具体化する典型的な実験によれば、オートミ
ール寒天斜面に保持されたA/16686産生菌株の培養物を
植物性媒質100mlを含むフラスコ中に接種する。36時間
後、培養物の試料（5ml）を用いて、発酵媒質100mlを含
む一連の発酵用フラスコに接種する。発酵の24〜48時間
後、前駆物質の選択的有効量を適当に加える。A/16686
複合体の２種の因子の相伴う増加を望む場合には、同一
発酵フラスコに２種の適当な前駆物質を加える。発酵を
更に60〜150時間続け、次に発酵ケーキを除去し、汁試
料をHPLCによつて分析する。 抗生物質の回収は当該分野において公知の方法によつ
て行うことができる。 獣医薬として適用するためには、全体の発酵ケーキま
たは濃縮した汁を用いることができる。 発酵液に前駆物質の添加は、該物質がその前もつて決
められたpH値範囲に顕著に影響を及ぼさぬようにして行
われる。かくして、例えば遊離酸前駆物質を媒質に直接
加える場合、媒質を緩衝するか、または微生物に対して
無毒性の塩基で直ちに中和することによつて、pH値を調
節下で保持する。 加える前駆物質がアミノ酸である場合、このものを産
生微生物に対して無毒性である酸または塩基とのその
塩、例えば塩基酸及びナトリウム塩の水溶液として発酵
液に供給することができ、多くの例があるにしても、ア
ミノ酸を「分子内塩」の溶液として有利に加えることが
できる。前駆物質として、ラセミ混合物及び光学的活性
異性体の双方を用いることができる。 しかしながら、一般にＬ−型の添加により、対応する
Ｄ−型よりも高い収率が得られる。 従つて、本発明の方法の好ましい具体例は、抗生物質
A/16686複合体の因子A3（Ｌ−バリン、その塩またはエ
ステル）及び／または因子A2（Ｌ−ロイシン、その塩ま
たはエステル）の濃度を高めるために、アミノ酸前駆物
質のＬ−型の使用を表わす。この好ましい具体例によれ
ば、また複合体の80％以上に発酵生成物における因子A2
の百分率を増加させることができる。 低級アルカン酸前駆物質（イソ酪酸、イソ吉草酸、α
−ケト−イソ吉草酸及びα−ケト−イソカプロン酸）を
用いて、添加を無毒性の塩基によるその塩の水溶液とし
て行うことができる；通常、アンモニウム及びナトリウ
ム塩が好ましい。 モノヒドロキシ低級アルカノールによる上記低級アル
カン酸及び不飽和脂肪酸のエステルを前駆物質として用
いる場合、該エステルは通常メタノール、エタノール及
びプロパノールから誘導されるが、またC4〜C6アルカノ
ールによるエステルを用いることもできる。この場合、
他の因子の相伴う増加を望まぬならば、C4〜C6アルカノ
ールは他の因子に対して前駆物質として作用し得るもの
とは異ならなければならない（イソブタノールまたはイ
ソアミルアルコール）。 アルカノール前駆物質、例えばイソブタノール及びイ
ソアミルアルコールを通常発酵液にそのまま加える。し
かしながら、またこれらのものを微生物に対して無毒性
である酸のエステルとして供給することもできる。これ
らの酸は、他の因子の相伴う増加を望まぬならば、他の
A/16686因子に対する前駆物質として作用し得るものと
は異ならなければならない。通常、直鎖状（C2〜C4）ア
ルカン酸、例えば酢酸、プロピオン酸及び酪酸によるエ
ステルが好ましい。 本発明による発酵物質に加える「選択的有効量」は前
駆物質のタイプに依存する。通常、低級アルカン酸（イ
ソ酪酸、イソバレリアン酸）によつては、発酵媒質中に
酸の濃度0.1g/乃至5g/間の範囲を与える量を用い、
0.1g/乃至1g/間の範囲が好ましい。低級アルカノー
ル（イソブタノール、イソアミルアルコール）または微
生物に対して無毒性である酸によるそのエステルによつ
て、通常0.5g/乃至5g/間のアルコール濃度範囲を与
える量を用い、1g/乃至2g/間の範囲が好ましい。 アミノ酸（バリン、ロイシン）及びケト−酸（α−ケ
ト−イソ吉草酸、α−ケト−イソカプロン酸）または酸
及び塩基とのその塩によつては、通常、発酵媒質に加え
る「選択的有効量」は0.2g/乃至5g/間、好ましくは
0.5g/乃至4g/間の範囲であり；最も好ましくは２乃
至4g/間の範囲である。 低級アルカン酸（例えばイソ酪酸、イソバレリアン
酸）、またはその塩を発酵媒質に直接加える場合、「選
択的有効量」は通常、0.1g/乃至2.5g/間の範囲であ
り、0.3g/乃至1.5g/間の範囲が好ましい。 上に示したよりも高い濃度がA/16686因子の１つの相
対的百分率を高める際に有効であるが、しかし、一般に
全体の収率は培養液における毒性作用のために抑制され
る。 本発明の他の目的及び好ましい具体例は、酪酸誘導体
または発酵条件下で酪酸を放出し得る前駆物質をA/1668
6産生培養物に加えることからなる抗生物質A/16686複合
体、A/16686因子A2または因子A3の生成を高める方法を
表わす。 驚くべきことに、事実上、本発明の方法によるA/1668
6因子の生成の選択的強化は、A/16686因子の適当な前駆
物質と共に酪酸誘導体または前駆物質を加えた場合、更
に増加することが見出された。 酪酸誘導体または前駆物質の好ましい例は（C1〜C6）
アルキルエステル、モノ−及びポリヒドロキシアルキル
エステルである。 酪酸エチル及びトリ−ブチリンが殊に好ましい。 発酵媒質にいずれかの物質の添加に関連して、殊に適
当な前駆物質及び酪酸またはその誘導体もしくは前駆物
質の添加に関連して、「共に」なる用語には、加えた物
質の合同した効果が発酵において明示され得るような間
隔で、示した物質を同時にまたは逐次的に（かわるがわ
る及び逆に）加えることが包含される。 明らかに、またこの定義には「共に」加える１種また
は双方の物質が培養媒質にすでに加えられているか、或
いはその中にすでに存在している場合が含まれる。 一般に、酪酸誘導体または前駆物質を発酵媒質に0.5g
/〜2g/の酸の濃度を与える量で加える。 一般に、抗生物質複合体の収率が顕著に増加し、また
適当な前駆物質を加えた場合、得られた抗生物質因子の
百分率を約95〜98％に増加させることができる。 ロイシン、そして最も好ましくはＬ−ロイシンをトリ
−ブチリンまたは酪酸エチルと共にA/16686産生培養物
に発酵中に加えることからなる高収率及び純度での抗生
物質A/16686因子A2の製造方法が殊に好ましい。 以下の実施例は本発明の方法のある特定の具体例を更
に詳細に述べるものである。 実施例１ アクチノプラネス・エスピーATCC33076（FERM−P No.
5477）のオートミール寒天斜面を次の栄養媒質100mlを
含む容量500mlのフラスコに接種した（g/）。 大豆粉 13 グルコース 12 澱粉 13 CaCO3 4 回転振盪機上で28〜30℃で36時間後、培養液5mlを用
いて、次の発酵媒質100mlを含む容量500mlのフラスコに
接種した（g/）。 大豆粉 30 グリセリン 20 澱粉 4 グルコース 4 マルトース 20 スクロース 20 CaCO3 6 回転振盪機上で28〜30℃で24時間培養した後、適当な
前駆物質を加えた。90〜96時間培養後、発酵ケーキを遠
心分離によつて除去し、汁を次のHPLC法に従つて、抗生
物質A/16686因子におけるその含有量を分析した： a.グラジエント逆相分配によつて分離 装置：ポンプ：バリアン（Varian）5000A; 検出器バリアン、254nm インジエクター：レオダイン（Rheodyne）モデル7125; インテグレーター：スペクトラ・フイジイクス（Spectr
a Physics）モデル4000。 カラム：シラン処理したシリカゲル： ブラウンリー・ラボラトリイー（Brownlee Lab.）RP18
スフエリイ（Spheri） 移動相:0.05M NaH2PO4/アセトニトリル、 65:35、pH6 流速:1.8ml/分 注入:20μ 操作条件：同一濃度溶媒条件 保持時間:A/16686因子A1 6.69分 A/16686因子A2 10.16分 A/16686因子A3 16.29分 b.％分布 成分を上記の方法によつて分離し、その相対分布を、
面積百分率法によつて、３本のピークの合計の％として
得た。代表的な実験結果を以下に示す：
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．アクチノプラネス・エスピー（Actinoplanes s
p.）ATCC33076またはその抗生物質A/16686産生突然変異
体の培養物に適当な前駆物質の選択的有効量を加えるこ
とにより、下記式式中、 で示される抗生物質A/16686における因子A2及び／また
はA3に富んだ抗生物質A/16686複合体を製造する方法で
あって、 （ｉ） 抗生物質A/16686複合体における因子A2の比を
増加させるための適当な前駆物質が、ロイシン、該産生
微生物に対して無毒性である酸及び塩基とのその塩、並
びにイソ吉草酸、該産生微生物に対して無毒性である塩
基とのその塩、モノ−及びポリヒドロキシ低級アルカノ
ールとのそのエステルから選ばれ、そして （ii） 抗生物質A/16686複合体における因子A3の比を
増加させるための適当な前駆物質が、バリン、該産生微
生物に対して無毒性である酸及び塩基とのその塩、並び
にイソ酪酸、該産生微生物に対して無毒性である塩基と
のその塩、モノ−及びポリヒドロキシ低級アルカノール
とのそのエステルから選ばれることを特徴とする方法。 ２．加える適当な前駆物質がバリンまたは微生物に対し
て無毒性の酸及び塩基によるその塩であり、そしてそれ
らの選択的有効量が0.2g/乃至5g/、好ましくは0.5g
/乃至4g/の範囲である特許請求の範囲第１項記載の
方法。 ３．加える適当な前駆物質がイソ酪酸または微生物に対
して無毒性の酸及び塩基によるその塩であり、そしてそ
れらの選択的有効量が0.1g/乃至2.5g/、好ましくは
0.3g/乃至1.5g/の範囲である特許請求の範囲第１項
記載の方法。 ４．加える適当な前駆物質がイソ酪酸のモノ−またはポ
リヒドロキシ低級アルカノールとのエステルであり、そ
してそれらの選択的有効量が0.1g/乃至5g/、好まし
くは0.1g/乃至1g/の範囲である特許請求の範囲第１
項記載の方法。 ５．加える適当な前駆物質がロイシンまたは微生物に対
して無毒性の酸及び塩基とのその塩であり、そしてそれ
らの選択的有効量が0.2g/乃至5g/、好ましくは0.5g
/乃至4g/の範囲である特許請求の範囲第１項記載の
方法。 ６．加える適当な前駆物質がイソ吉草酸または微生物に
対して無毒性の酸及び塩基によるその塩であり、そして
それらの選択的有効量が0.1g/乃至2.5g/、好ましく
は0.3g/乃至1.5g/の範囲である特許請求の範囲第１
項記載の方法。 ７．加える適当な前駆物質がイソ吉草酸のモノ−または
ポリヒドロキシ低級アルカノールとのそのエステルであ
り、そしてそれらの選択的有効量が0.1g/乃至5g/、
好ましくは0.1g/乃至1g/の範囲である特許請求の範
囲第１項記載の方法。 ８．微生物に対して無毒性の塩基との塩がナトリウム塩
またはアンモニウム塩である特許請求の範囲第１項、第
２項、第３項、第５項または第６項記載の方法。 ９．エステルが次のアルカノール：メタノール、エタノ
ール、プロパノールエチレングリコール及びグリセリン
の１つとのエステルである特許請求の範囲第１項、第４
項または第７項記載の方法。 １０．アミノ酸がＬ−型である特許請求の範囲第１項、
第２項または第５項記載の方法。 １１．微生物に対して無毒性の酸との塩が塩酸塩または
硫酸塩である特許請求の範囲第１項、第２項または第５
項記載の方法。 １２．菌株がアクチノプラネス・エスピーATCC33076で
ある特許請求の範囲第１〜11項のいずれかに記載の方
法。 １３．発酵を25℃乃至35℃間、好ましくは27℃乃至33℃
間の温度で行う特許請求の範囲第１〜12項のいずれかに
記載の方法。 １４．適当な前駆物質の添加を発酵開始後24〜48時間に
行う特許請求の範囲第１〜13項のいずれかに記載の方
法。 １５．特許請求の範囲第１〜14項のいずれかに記載の方
法において、抗生物質A/16686因子A2またはA3の適当な
前駆物質と共に、酪酸の前駆物質または誘導体の有効量
を添加することを特徴とする方法。 １６．アクチノプラネス・エスピーATCC33076またはそ
の産生突然変異体の培養物に酪酸の前駆物質または誘導
体の有効量を加えることを特徴とする下記式式中、 で示される抗生物質A/16686複合体の生成を増加させる
方法。
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