HU198229B

HU198229B - Process for intensifying production of a/16686 antibiotics complex and for selective increasing balance of determined components in the complex

Info

Publication number: HU198229B
Application number: HU874033A
Authority: HU
Inventors: Giancarlo Lancini; Angelo Borghi; Piero Antonini
Original assignee: Lepetit Spa
Priority date: 1986-09-11
Filing date: 1987-09-10
Publication date: 1989-08-28
Also published as: JP2728406B2; ZA876773B; DK166628B1; DK461787A; DE3784988D1; ATE87335T1; IL83736A0; ES2038974T3; EP0259780B1; CA1301689C; KR960013576B1; KR880004094A; IE872421L; IE60223B1; IL83736A; HUT46362A; DE3784988T2; GB8621911D0; JPS6377891A; EP0259780A2

Description

A találmány tárgya eljárás az A/16686 antibiotikum komplex valamint az A2 és/vagy Aa faktorban feldúsított A/16686 antibiotikum előállítására oly módon, hogy egy Actinoplanes sp. ATCC 33076 tenyészethez vagy annak valamely Α/16686-ot termelő mutánséhoz hatásos mennyiségű, megfelelő prekurzort adunk.

A szóbanforgó mikroorganizmus törzs morfológiai és fiziológiai jellemzőit a 188.684 számú magyar szabadalmunk leírásában megadtuk.

Az A/16686 antibiotikum egy, az Actinoplanes sp. ATCC 33076 tenyészetből kinyert, depszipeptid (észter- és amid-kötéssel kapcsolódó oC-hidroxi- és cC-aminosavakból álló) anyag.

Ennek az anyagnak - amely főként a Gram-pozitiv baktériumokkal szemben hatásos - a leírása az előállítására szolgáló eljárás és a megfelelő gyógyszerkészítmények ismertetésével együtt megtalálható a 4,303,646 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban.

A későbbiekben megállapították, hogy az A/16686 antibiotikumból három - egymáshoz nagyon hasonló - komponens különíthető el, ezeket elnevezték Ai, Ai illetve A3 faktornak. A legnagyobb mennyiségben kapott A2 faktor a legfontosabb a biológiai hatás szempontjából; az Ai és az Aa faktor kisebb mennyiségben képződik. Ezen anyagoknak, valamint előállításuknak és felhasználásuknak leírása megtalálható a 4,427,656 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban.

Minthogy a mikroorganizmusok tűrő-, sőt, ellenállóképessége is egyre növekszik a jelenlegi antibiotikumos kezelésekkel szemben, még mindig nagy az igény új antibiotikumok előállítására.

Különösen kívánatosak egyedileg izolált vagy komplex formában az olyan antibiotikumok, melyek nagyon jól meghatározott és állandó összetételüek.

Tehát a találmány tárgya egyrészt eljárás az A/16686 antibiotikumban az Az és/vagy az As faktorból képződő mennyiség szelektív növelésére. A cél vagy az egyedi komponensek kinyerése, vagy pedig az, hogy a komplexet a fenti komponensek egyikében vagy mindkettőjében feldúsítsuk. Az eljárás abból áll, hogy a fermentáció során az A/16686 előállítására szolgáló tenyészethez olyan prekurzort (elővegyületet) adunk, mely a kívánt faktor képződését előmozdítja.

A találmány szerinti eljárással pl. egy ipari méretű fermentáció során megváltoztathatjuk az A/16686 antibiotikum fő komponenseinek arányát. Tehát ez a módszer felhasználható arra, hogy a végtermék összetételét az előírásoknak megfelelően állítsuk be.

Továbbá a találmány szerinti eljárással a termelő tenyészet fermentációs masszájából közvetlenül kinyerhetünk egy olyan nyers terméket, mely igen gazdag az A/16686 antibiotikum Az faktorában, s ezt azután magasabb kitermeléssel és kevesebb időt igénylő lépésekben tiszta anyag formájában is izolálhatjuk.

Az A/16686 antibiotikum komplexben az A2 faktor arányának növelésére szolgáló prekurzor lehet leucin vagy annak olyan savakkal vagy bázisokkal képzett sói, melyek a termelő mikroorganizmusokra nézve nem toxikusak, izovaieriánsav vagy annak olyan bázisokkal képzett sói, melyek a termelő mikroorganizmusokra nézve nem toxikusak, az izovaleriánsavnak kis szénatomszámű monovagy polihidroxi-alkanolokkal képzett észterei, alfa-keto-izokapronsav vagy annak olyan bázisokkal képzett sói, melyek a termelő mikroorganizmusokra nézve nem toxikusak, az alfa-keto-izokapronsavnak kis szénatomszámú mono- vagy polihidroxi-alkanolokkal képzett észterei, továbbá izoamil-alkohol vagy annak olyan savakkal képzett észterei, melyek a termelő mikroorganizmusokra nézve nem toxikusok.

Az A/16686 antibiotikum komplexben az As faktor arányának növelésére szolgáló prekurzor lehet valin vagy annak olyan savakkal és bázisokkal képzett sói, melyek a termelő mikroorganizmusokra nézve nem toxikusak, alfa-keto-izovaleriénsav vagy annak olyan bázisokkal képzett sói, melyek a termelő mikroorganizmusokra nézve nem toxikusak, az alfa-keto-izovaleriánsavnak kis szénatomszámú mono- vagy poli-hidroxi-alkanolokkal képzett észterei, izovajsav vagy annak olyan bázisokkal képzett sói, melyek a termelő mikroorganizmusokra nézve nem toxikusai:, az izovajsavnak kis szénatomszámú mono- vagy polihidroxi-alkanolokkal képzett észterei, továbbá izobutanol vagy annak olyan savakkal képzett észterei, melyek a termelő mikroorganizmusokra nézve nem toxikusak.

A mikroorganizmusokra nézve nem toxikus bázisokkal képzett sók azok, melyek olyan típusú és koncentrációjú kationt tartalmaznak, hogy az a fermentációs masszában alkalmazott koncentrációban sem a mikoorganizmus-tenyészet növekedését, sem pedig a kivánt antibiotikum termelését nem csökkenti számottevő mértékben. Ilyen kationok pl. az ammóniumion, továbbá azok, amelyek alkálifémekbói és alkálifőldfémekből (mint pl. nátrium, kálium, kalcium, magnézium) vagy aminokból, pl. 1-4 szénatomszámú primer, szekunder vagy tercier alkil-amino-csoportból vagy 1-4 szénatomszámú hidroxi-amino-alkil-csoportból képződnek. Előnyösen alkalmazhatók a nátrium-, kálium- vagy ammóniumionokat tartalmazó sók.

A mikroorganizmusokra nézve nem toxikus savak - tehát azok a savak, melyek a fermentációs masszában alkalmazott koncentrációban sem a mikroorganizmus-tenyészet növekedését, sem pedig a kívánt antibiotikum termelését nem gátolják számottevő mérték3

HU 198229 Β ben - előnyösen ásványi savak, mint pl. a sósav, de bizonyos esetekben szerves savak is lehetnek jelen.

A fentiek szerint megfelelő prekurzorként használhatók az olyan, kis szénatomszóraü mono- vagy polihidroxi-alkanolokkal képzett észterek, melyeket 1-6 szénatomszámú, molekulánként 1, 2, 3, 4, 5 vagy 6 hidroxicsoportot tartalmazó alkanolokkal állítunk eló. Ha 1-4 szénatomszámú alkanolokat használunk, ezek nem lehetnek azonosak azokkal az alkanolokkal, melyek más faktorok prekurzoraiként működnek (pl. izobutanol vagy izoamil-alkohol), hacsak nem az a célunk, hogy mindkét faktor termelését egyidejűleg növeljük.

Előnyösen alkalmazható polihidroxi-alkanolok pl. a glicerin és a propilénglikol.

Ha a kis szénatomszámú alkanolok különböző enantiomer vagy epimer formákban lehetnek jelen, a leírásban és az igénypontokban mondottak mindegyik formára külön-külőn és a különböző formák tetszőleges arányú keverékére egyaránt érvényesek.

A mikroorganizmusokra nem mérgező, hidroxicsoportot tartalmazó észter-tipusú prekurzorok olyan 2-22 szénatomszámú alkanoil-észterek, melyekben az alkanoil molekularész olyan típusú, és a fermentációs közegben olyan koncentrációban van jelen, hogy az sem a mikroorganizmus-tenyészet növekedését, sem pedig a kívánt antibiotikum termelését nem gátolja számottevő mértékben. Általában előnyösen alkalmazhatók a 2-4 szénatomszámú, egyenes láncú savak.

Az A/16686 antibiotikumot termelő tenyészet az Actinoplanes sp. ATCC 33076 törzs vagy annak olyan termelő mutánsa vagy variánsa, mely a tenyésztés során kinyerhető mennyiségű A/16686 antibiotikumot termel.

A találmány szerinti eljárásban az A/16686 antibiotikumot termelő törzset általában az Actinoplanes, speciálisan pedig az Α/16686-ot termelő törzseknél (ld. a fent idézett 4,303,646 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást) szokásos körülmények között, olyan vizes tápközegben tenyésztjük, mely az emészthető szén és az emészthető nitrogén forrásául szolgáló anyagokat, valamint szervetlen sókat tartalmaz, és a megfelelő prekurzor hatásos mennyiségének hozzáadásával az A/16686 antibiotikum A2 és/vagy Aa faktorának termelését szelektlve megnöveljük.

A megfelelő prekurzort a fermentáció során adagolhatjuk folyamatosan vagy szakaszosan, de hozzáadhatjuk a közeghez a fermentáció előtt is. Az adagolást végezhetjük közvetlenül, ha a prekurzor a fermentáció hőmérsékletén kellőképpen folyékony, vagy pedig oldat, emulzió vagy szuszpenzió - előnyösen vizes oldat vagy szuszpenzió - alakjában.

A megfelelő prekurzor .hatásos mennyisége ‘ a fentiek szerint a prekurzornak azon mennyiségét jelenti, mely a fermentációs közeghez hozzáadva abban a szelektív prekurzornak olyan koncentrációját hozza létre, mely elegendő ahhoz, hogy az A/16686 antibiotikum adott faktorának termelését szelektíve megnövelje, ugyanakkor a termelő mikroorganizmus-tenyészetre toxikus hatást nem fejt ki.

A prekurzor adagolási sebessége elég nagy legyen ahhoz, hogy a kívánt faktor kihozatalát számottevő vagy optimális mértékben növelje, anélkül azonban, hogy a fermentációra toxikus hatást gyakorolna.

Általában előnyös, ha a megfelelő prekurzor hatásos mennyiségét az erjesztés termelő fázisában adagoljuk a közeghez folyamatosan vagy több részletben.

A fermentáció után kívánt esetben az A/16686 antibiotikum komplexet vagy különállóan az A2 vagy Aa faktort az ismert eljárásokkal vagy azok kézenfekvő módosításaival nyerhetjük ki.

A találmány szerinti eljárásban az Α/16686-ot termelő törzs számára alkalmas tépközeg általában a következő komponenseket tartalmazza: valamely alkalmas szén-forrás, ami lehet egyszerű cukor (pl. glükóz, szacharóz, maltóz), poliszacharid (pl. keményítő, dextrán) vagy polialkohol (pl. glicerin, propilénglikol); alkalmas nitrogénforrós, mely lehet pl. valamely ammóniurasó, aszparagin, földimogyoró-liszt, szójababliszt, húskivonat, tripton, pepton, élesztő-hidrolizátum, élesztőkivonat vagy gabonafózet; szervetlen sók. A tenyésztő közegben jelenlévő sók között vannak közönséges oldható sók, melyekből nátrium-, kálium-, vas-, cink-, kobalt-, magnézium-, kalcium-, ammónium-, klorid-, karbonát-, szulfát-, nitrát-, foszfát- stb. ionok képződnek.

Az antibiotikumot termelő törzsből rendszerint lombikban előtenyészetet készítünk, majd ezzel beoltjuk a nagyobb mennyiségű antibiotikum előállítására szolgáló tartályokat. Az előtenyésztéshez használt közeg lehet azonos azzal, amit az erjesztő tartályokban alkalmazunk, de lehet attól eltérő is.

A fermentációt 50-150 óra alatt, sülylyesztett, aerob körülmények között, 25 és 35 °C közötti, előnyösen 27 és 33 °C közötti hőmérsékleten hajtjuk végre. A megfelelő prekurzor szelektive hatásos mennyiségét hozzáadhatjuk a fermentációs közeghez a termelő törzzsel történő beoltás előtt, azonban előnyösebb, ha a fermentáció megindulásától számított 24-48 óra elteltével adjuk hozzá. Az adagolást végezhetjük egy vagy több részletben vagy folyamatosan.

A találmány egyik tipikus kísérleti megvalósítása során egy rézsútos felületű zabpehely-agar táptalajon tenyésztett, Α/16686-ot termelő törzset beoltunk egy 100 ml tenyésztő közeget tartalmazó lombikba. 36 óra múlva e tenyészet 5 ml-es mintáival beoltunk egy sor erjesztő lombikot, melyek egyenként 100

HU 198229 Β ml fermentációs közeget tartalmaznak. Az erjedés kezdetétől számított 24-48 óra múlva megfelelő módon hozzáadjuk a prekurzor szelektive hatásos mennyiségét. A fermentációt további 60-150 órán át folytatjuk, majd a fermentációs iszapot eltávolítjuk, és a fermentléböl vett mintákat nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel elemezzük.

Az antibiotikum kinyerését a szakmában ismert módszerekkel végezzük.

Állatorvosi célokra a teljes ferment-iszap vagy a betőményitett fermentlé is felhasználható.

A prekurzort úgy adjuk hozzá a fermentációs közeghez, hogy ne változtassa meg jelentős mértékben az előre meghatározott pH értéket. Ha pl. szabad savat használunk prekurzorként, és azt közvetlenül adjuk hozzá a közeghez, akkor a pH-t vagy a közeg pufferolásával szabályozzuk, vagy pedig úgy, hogy azonnal semlegesítjük a mikroorganizmusokra nézve nem toxikus bázisokkal.

Ha a prekurzor aminosav, akkor olyan bázisokkal képzett sóinak vizes oldata alakjában adhatjuk hozzá a közeghez, melyek a termelő mikroorganizmusokra nézve nem toxikusak (pl. sósavas sók vagy nátriumsók), de sok esetben az aminosavat egyszerűen .belső só’-jának oldataként is alkalmazhatjuk. Prekurzorként mind a racém keverékek, mind pedig az optikailag aktív izomerek felhasználhatók, de az L-alak általában nagyobb kihozatalt eredményez, mint a megfelelő D-alak.

Ezért a találmány egyik megvalósításában az A/16686 antibiotikum komplexben az As és/vagy az A2 faktor koncentrációjának növelését az aminosav prekurzor L-alakjának alkalmazásával mutatjuk be. Az A3 faktor koncentrációjának növelésére L-valint vagy annak valamely sóját vagy észterét, az A2 faktor koncentrációjának növelésére pedig L-leucint vagy annak valamely sóját vagy észterét alkalmazzuk. A találmány ezen előnyös megvalósításéval az A2 faktor aránya a fermentációs termékben a 80%-ot is meghaladhatja.

A kis szénatomszámú alkánkarbonsav prekurzorokat (izovajsav, izovaleriánsav, alfa-keto-izovaleriánsav vagy alfa-keto-izo-kapronsav) nem toxikus bázisokkal képzett sóik vizes oldata alakjában alkalmazhatjuk; általában előnyösek az aramónium- és a nátriumsók.

Ha a fenti kis szénatomszámú alkánkarbonsavaknak vagy telítetlen zsírsavaknak 1-6 szénatom számú monohidroxi-alkanolokkal képzett észtereit használjuk prekurzorként, ezek rendszerint metanol-, etanol- vagy propanol-származékok, de 4-6 szénatomszámú alkanolokkal képzett észtereket is alkalmazhatunk. Ez esetben a 4-6 szénatomszámú alkanol nem lehet azonos azzal, ami a másik faktor prekurzoraként működhet (izobutanol vagy izoamil-alkohol), hacsak nem az a cél, hogy egyidejűleg a másik faktor koncentrációját is növeljük.

Az alkanol prekurzorokat (mint pl. izobutanol vagy izoamil-alkohol) általában eredeti alakjukban adjuk a fermentációs közeghez, de használhatók a mikroorganizmusokra nem toxikus savakkal képzett észtereik alakjában is. Ezek a savak nem lehetnek azonosak azokkal, melyek az A/16686 másik faktorának prekurzoraként működnek, hacsak nem az a cél, hogy egyidejűleg a másik faktor koncentrációját is növeljük. Általában előnyösen alkalmazhatók a 2-4 szénatomszámú lineáris alkánkarbonsavakkal (pl. ecetsav, propionsav, vajsav) képzett észterek.

A fermentációs közeghez adandó .szelektíve hatásos mennyiség függ a prekurzor típusától. A kis szénatomszámú alkánkarbonsavak (izovajsav, izovaleriánsav) észtereiből olyan mennyiséget alkalmazunk, hogy a fermentációs közegben a sav koncentrációja 0,1-5 g/l, előnyösen 0,1-1 g/l legyen. A kis szénatomszámú alkanolokból (izobutanol, izoamil- alkohol) vagy a mikroorganizmusokra nem toxikus savakkal képzett észtereikből olyan mennyiséget alkalmazunk, amely a közegben 0,5-5 g/l, előnyösen 1-2 g/l koncentrációt eredményez.

Az aminosavakból (valin, leucin) és a kehi-savakból (alfa-keto-izovaleriánsav, alfa-keto-izokapronsav) és savakkal vagy bázisokkal képzett sóikból a .szelektive hatásos mennyiség' 0,2-5 g/l, előnyösen 0,5-4 g/l, a legelőnyösebben 2-4 g/l.

Ha a kis szénatomszámú alkánkarbonsavakat (mint pl. izovaleriánsav, izovajsav) vagy sóikat közvetlenül adjuk a fermentációs közeghez, a .szelektive hatásos mennyiség 0,1-2,5 g/l, előnyösen 0,3/1, 5 g/l.

A fent megadottaknál nagyobb koncentrációk hatásosak lehetnek az A/16686 egyes faktorainak %-os növelésében, de a tenyészetre kifejtett toxikus hatás következtében a teljes kihozatal általában csökken.

A találmány további tárgyét és előnyös megvalósítását képezi az A/16686 antibiotikum komplex termelésének fokozására szolgáló módszer, mely abból áll, hogy egy Α/16686-ot termelő tenyészethez a vajsav valamely 1-6 szénatomos mono- vagy polihidroxi-alkohollal képzett észterét adjuk, melyből a fermentációs körülmények között vajsav szabadul fel.

Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy egy A/16686 faktor termelésének a találmány szerinti eljárással történő szelektív növelése még hatásosabb lesz, ha az A/16686 szóbanforgó faktorának megfelelő prekurzor mellett valamely fent említett vajsav-származékot is adunk a közeghez.

Különösen előnyösen alkalmazható e célra az etil-butirát és a tributirin (glicerin-tributirát).

Ha valamely anyagnak a fermentációs közeghez történő hozzáadásával foglalkozunk, és különösen ha arról van szó, hogy a meg5

HU 198229 Β felelő prekurzor mellett vajsavat vagy annak valamely származékát vagy prekurzorát alkalmazzuk, akkor a .mellett’ kifejezés azt jelenti, hogy a szóbanforgó anyagokat vagy egyidejűleg adjuk a közeghez, vagy egymás után (tetszőleges sorrendben), de olyan rövid időn belül, hogy a fermentációra együttesen fejthessék ki hatásukat.

Nyilvánvaló, hogy ez a definíció olyan esetekre is érvényes, mikor mindkét anyagot előzetesen adtuk hozzá a tenyészethez, vagy abban már eleve jelen vannak.

A fentemlltett vajsav-származékot általában olyan mennyiségben alkalmazzuk, hogy a fermentációs közegben a sav koncentrációja 0,5-2 g/1 legyen.

Az antibiotikum komplex termelése általában jelentős mértékben megnövekszik, és ha megfelelő prekurzort is adunk hozzá, akkor az adott faktor aránya elérheti a 95-98%-ot is.

Az A/16686 antibiotikum A2 faktorénak előállításához különösen előnyös, nagy kihozatalt és tisztaságot biztosit az az eljárás, mely abból áll, hogy egy Α/16686-ot termelő tenyészethez a fermentáció során leucint előnyösen L-leucint - és tributirint vagy etil-butira tót adunk.

Az alábbi példában részletesebben ismertetjük a találmány szerinti eljárás egyes megvalósítási módjait.

1. példa

Rézsútos felületű zabliszt-agar táptalajon tenyésztett Actinoplanes sp 33076 törzszsel beoltunk egy 500 ml-es lombikot, mely 100 ml-t tartalmaz az alábbi összetételű szaporító közegből:

szójababliszt 13 g/1 glükóz 12 g/1 keményítő 13 g/1 kalcium-karbonát 4 g/1

A lombikot 28-30 °C-os hőmérsékleten 36 órára forgó rázógépbe tesszük, majd a tartalmából 5-5 ml-t beoltunk olyan 500 ml-es lombikokba, melyek egyenként 100 ml-t tartalmaznak az alábbi összetételű fermentációs közegből:

szójababliszt 30 g/1 glicerin 20 g/1 keményítő 4 g/1 glükóz 4 g/1 maltóz 20 g/1 szacharóz 20 g/1 kalcium-karbonát 6 g/1

A tenyésztést 28-30 °C-on 24 órán át forgó rázógépben folytatjuk, majd hozzáadjuk a megfelelő prekurzort. A tenyésztést további 90-96 órán át folytatjuk, majd a fermentiszapot centrifugálással eltávolítjuk, és az alábbi nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel meghatározzuk, hogy a fermentlé mennyit tartalmaz az A/16686 antibiotikum egyes faktoraiból.

a. Elválasztás a fordított fázismegoszlási gradiens alapján

Felszerelés: Varian 5000 A szivattyú

Varian detektor 254 mikrométer

Rheodyne 7125 tip. injektor Spectra Physics 4000 tip. integrátor

Oszlop: szilánozott szilikagél;

Brownlee Láb. RP 18 Spheri 5

Mozgó fázis. 0,05 M nátrium-dihidrogén-foszfát-oldat ás acetonitril 65 : 35 arányú elegye, pH = 6

Áramlási sebesség: 1,8 ml/perc

Beinjektált mennyiség: 20 roikroliter A mérést izkroatikus körülmények között végezzük.

Retenciós idők: A/16686 Ai faktor 6,69 perc

A/16686 A2 faktor 10,16 perc A/16686 A3 faktor 16,29 perc

b. Százalékos megoszlás

Az egyes komponenseket a fent leírt módon elválasztjuk, majd a terület-százalékos módszerrel meghatározzuk a három csúcs összegéhez viszonyított arányukat. A kísérleti eredmények az alábbi táblázatban láthatók:

HU 198229 Β

Hozzáadott prekurzor (g/1)	összes kihozatal (mg/1)	Ai faktor (X)	A2 faktor (X)	Aa faktor (X)
Semmi
(-)	102	16	67	17
Valin
1	120	20	42	38
Izovajsav
0,2	110	13	55	32
Leuein
0,5	103	11	82	7
1	130	12	84	4
2	250	6	92	2
Izovaleriánsav
0,1	130	7	87	6
0,5 Etil-butirát	50	5	90	5
0,5	280	19	67	14
Tri-butirin
0,5	390	21	61	18
Leuein + tri-butirin
0,5 + 1 Izobutanol	502	9	84	7
1 Alfa- keto-izovaleriánsav	95	11	58	31
0,5	92	15	56	29
Alfa-keto-izokapronsav
0,5 izoamilalkohol	90	10	73	17
1	98	11	71	18

A fenti eljárás során kapott antibiotikummal végzett farmakológiai vizsgálatok eredménye azonos a 188.684 és a 181.534 számú magyar szabadalmak leírásában ismertetett adatokkal. 5

Az antibiotikum komplex egyes komponensei az alábbi tulajdonságokkal rendelkeznek;

Al faktor bomlás közben 210-220 °C hőmérsékleten olvad, nujolban felvett infravörös abszorpciós spektrumában a következő abszorpciós maximumok figyelhetők meg: 3290, 2930 és 2860 (nujol), 1765, 1630, 1510, 1455 és 1375 (nu- ¹⁵jól), 1260, 1235,1175, 1150, 1130, 1060, 1015,

975, 840 és 810 cm-¹, fajlagos forgatóképessége [dCF°d = +57±4° (c = 0,51, víz);

A2 faktor bomlás közben 210-220 °C hőmérsékleten olvad, nujolban felvett infravörös abszorpciós spektrumában a következő abszorpciós maxi- ^5 mumok figyelhetők meg: 3290, 2930 és 2860 (nujol), 1765, 1635, 1510, 1455 és 1375 (nujol), 1240, 1175, 1130, 1060, 1015, 975, 840 és 815 cm'¹, fajlagos forgatóképessége 30 [oC]»d = +73 ±4° (c = 0,49, viz);

A3 faktor bomlás közben 220 °C hőmérsékleten olvad, nujolban felvett infravörös abszorpciós spektrumában a következő abszorpciós maximumok figyelhetők meg: 3290, 2930 és 2860 (nujol), 1765, 1635, 1510, 1455 és 1375 (nujol), 1260, 1240, 1175, 1100, 1060, 1020, 975, 840 és 805 cm^-1, fajlagos forgatóképessége = +50 ±4° (c = 0,48, 0,01 n sósav).

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás az A/16686 antibiotikum komplex valamint az A2 és/vagy A3 faktorban feldúsított A/16686 antibiotikum előállítására, ahol az antibiotikum komplex egyes komponensei az alábbi tulajdonságokkal rendelkeznek:

Al faktor bomlás közben 210-220 °C hőmérsékleten olvad, nujolban felvett infravörös abszorpciós spektrumában a következő abszorpciós maximumok figyelhetők meg: 3290, 2930 és 2860 (nujol), 1765, 1630, 1510, 1455 és 1375 (nujol), 1260, 1235, 1175, 1150, 1130, 1060, 1015, 975, 840 és 810 cm^-1,

-611

HU 198229 Β fajlagos forgatóképessége [oC]2°d = +57 ±4° (c = 0,51, víz);

A2 faktor bomlás közben 210-220 °C hőmérsékleten olvad, nujolban felvett infravörös abszorpciós spektrumában a következő abszorpciós maximumok figyelhetők meg: 3290, 2930 és 2860 (nujol), 1765, 1635, 1510, 1455 és 1375 (nujol), 1240, 1175, 1130, 1060, 1015, 975, 840 és 815 cm'¹, fajlagos forgatóképessége [oCJ^d = +73 ±4° (c = 0,49, viz);

A 3 faktor bomlás közben 220 °C hőmérsékleten olvad, nujolban felvett infravörös abszorpciós spektrumában a kővetkező abszorpciós maximumok figyelhetők meg: 3290, 2930 és 2860 (nujol), 1765, 1635, 1510, 1455 és 1375 (nujol), 1260, 1240, 1175, 1100, 1060, 1020, 975, 840 és 805 cm^-1, fajlagos forgatóképessége (cCJ^d = +50 ±4° (c = 0,48, 0,01 n sósav), azzal jellemezve, hogy egy Actinoplanes sp. ATCC 33076 deponálási számú mikroorganizmusnak vagy annak valamely Α/16686-ot termelő mutánsának tenyészetéhez hatásos mennyiségű, megfelelő prekurzort adunk az alábbiak szerint:

a) az A/16686 antibiotikum komplex menynyiségének növelésére a vajsav valamely 1-6 szénatomos mono- vagy polihidroxi-alkohollal képzett észteréből olyan mennyiséget adunk, hogy a fermentációs közegben a vajsav-koncentráció 0,5-2 g/1 legyen, vagy

b) az Ας faktorban feldúsított A/16686 antibiotikum előállítására 0,2-5 g/1 mennyiségű leucint, vagy annak a termelő mikroorganizmusra nézve nem toxikus savval vagy bázissal képzett valamely sóját, 0,1-2,5 g/1 mennyiségű izovaleriánsavat, annak a termelő mikroorganizmusra nem toxikus bázissal képzett valamely sóját vagy 0,1-5 g/1 mennyiségű 1-6 szénatomszámú mono- vagy polihidroxi-alkanollal képzett valamely észterét, 0,2-5 g/1 mennyiségű alfa-keto-izokapronsavat, annak a termelő mikroorganizmusokra nem toxikus bázissal képzett valamely sóját vagy 1-6 szénatomszámú mono- vagy polihidroxi-alkanollal képzett valamely észterét, vagy 0,5-5 g/1 mennyiségű izoamil-alkoholt vagy annak a termelő mikroorganizmusra nézve nem toxikus Bavval képzett valamely észterét adunk, és/vagy

c) Az A3 faktorban feldúsított A/16686 antibiotikum előállításéra 0,2-5 g/1 mennyiségű valint, annak a termelő mikroorganizmusra nem toxikus savval vagy bázissal képzett valamely sóját, 0,2-5 g/1 me η n y isé g ű alf a-keto-izovale riánsavat, annak a termelő mikroorganizmusra nem toxikus bázissal képzett valamely sóját vagy 1-6 szénatomszámú mono- vagy polihidroxi-alkanollal képzett észterét,

0,1-2,5 g/1 mennyiségű izovajsavat, annak a termelő mikroorganizmusra nem toxikus bázissal képzett valamely sóját vagy 0,1-5 g/1 mennyiségű 1-6 szénatomszámú mono- vagy polihidroxi-alkanollal képzett észterét vagy 0,5-5 g/1 mennyiségű izobutanolt vagy annak a termelő mikroorganizmusra nem toxikus savval képzett valamely észterét adunk, kívánt esetben a b) vagy c) eljárásnál megadott megfelelő prekurzor mellett a vajsav valamely 1-6 szénatomos monovagy polihidroxi-alkohollal képzett észteréből is olyan mennyiséget adunk, hogy a fermentációs közegben a vajsav koncentráció 0,5-2 g/1 legyen.
2. Az 1. igénypont szerinti c) eljárás, azzal jellemezve, hogy prekurzorként 0,5-4 g/1 mennyiségű valint vagy annak a termelő mikroorganizmusra nem toxikus savval vagy bázissal képzett sóját alkalmazzuk.
3. Az 1. igénypont szerinti c) eljárás, azzal jellemezve, hogy prekurzorként 0,2-1,5 g/1 mennyiségű izovajsavat vagy annak a termelő mikroorganizmusra nem toxikus bázissal képzett sóját alkalmazzuk.
4. Az 1. igénypont szerinti c) eljárás azzal jellemezve, hogy prekurzorként 1-2 g/1 mennyiségű izobutanolt vagy annak a mikroorganizmusra nem mérgező savval képzett észterét alkalmazzuk.
5. Az 1. igénypont szerinti b) eljárás, azzal jellemezve, hogy prekurzorként 0,5-4 g/1 mennyiségű leucint vagy annak a mikroorganizmusra nem mérgező savval vagy bázissal képzett sóját alkalmazzuk.
6. Az 1. igénypont szerinti b) eljárás, azzal jellemezve, hogy prekurzorként 0,3-1,5 g/1 mennyiségű izovaleriánsavat vagy annak a mikroorganizmusra nézve nem toxikus bázissal képzett sóját alkalmazzuk.
7. Az 1. igénypont szerinti b) eljárás, azzal jellemezve, hogy prekurzorként 1-2 g/1 mennyiségű izoamil-alkoholt vagy annak a mikroorganizmusra nézve nem toxikus savval képzett észterét alkalmazzuk.
8. Az 1. igénypont szerinti b) eljárás, azzal jellemezve, hogy prekurzorként 0,5-4 g/1 mennyiségű alfa-keto-izokapronsavat, annak a mikroorganizmusra nézve nem toxikus bázissal képzett sóját vagy 1-6 szénatomszámú mono— vagy polihidroxi-alkanollal képzett észterét alkalmazzuk.
9. Az 1., vagy 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy észterként metanollal, etanollal, propanollal, etilé nglikollal vagy glicerinnel képzett észtert alkalmazunk.
10. Az 1., 2. vagy 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aminosavat L-izomer alakjában alkalmazzuk.
11. Az 1., 4. vagy 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikroorga-713

HU 198229 Β nizmusra nézve nem mérgező savval képzett észterként vajsavas észtert alkalmazunk.
12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az antibiotikumot termelő törzsként Actinoplanes sp ATCC 33076-ot alkalmazunk.
13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fermentálást 25 és 35 °C közötti, előnyösen 27 és 33 °C közötti hőmérsékleten hajtjuk végre.
14. Az 1-13. igénypontok bármelyike 5 szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a megfelelő prekurzort a fermentáció kezdetétől számított 24-48 óra elteltével adjuk a közeghez.