CN112608952B - 一种高效发酵产大环内酰胺化合物fw05328-1的方法 - Google Patents

一种高效发酵产大环内酰胺化合物fw05328-1的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种高效发酵产大环内酰胺化合物FW05328‑1的方法。本发明所述高效发酵产大环内酰胺化合物FW05328‑1的方法，在现有报道的生物合成途径基础上，通过对发酵培养基的优化，并添加3‑氨基丁酸进行产物诱导，建立了适应于菌株产目标产物的发酵培养基及培养工艺，在10L‑500L发酵罐发酵实验中，发酵产FW05328‑1能力由249.8mg/L提高至654.2mg/L，大幅提高目标产物的产生能力(提高261.9％)；并且，发酵液中FW05328‑1化合物组分比例由22.3％提高至74.8％(HPLC方法)，提高幅度达到335.4％，从而为FW05328‑1的规模化制备提供基础。

Description

一种高效发酵产大环内酰胺化合物FW05328-1的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种高效发酵产大环内酰胺化合物FW05328-1的方法，更具体涉及一种基于氨基酸诱导提高大环内酰胺化合物FW05328-1发酵产量的方法。
背景技术
随着医疗技术的不断进步，越来越多的医学难题得到攻克，人类寿命得到较大程度的延长。但是，癌症依然是人类需要克服的重大医疗难题之一，无论是在发达国家还是发展中国家，癌症都是死亡率最高的疾病，并且其发生率和死亡率仍不断增高。目前，癌症的主要治疗手段包括手术、放射性疗法以及抗肿瘤药物治疗，尤其是抗肿瘤药物治疗，随着全球癌症发病率的持续增长将推动抗肿瘤药物市场的快速发展。
FW05328-1化合物是福建省微生物研究所于2017年从海洋小单孢菌FIM05-328的微生物次级代谢产物中分离到一个新结构的26元多烯大环内酰胺类化合物(详见中国专利CN107287131A)。药效实验表明，该化合物在体外对人食管鳞癌细胞株KYSE30、KYSE180、EC109具有优良的抑制活性，对人食管鳞癌细胞株EC109的抑制活性尤为突出，与结构相似物Salinilactam A及药物顺铂相比，其抑制活性分别是Salinilactam A的165倍、顺铂的95倍。因此，FW05328-1化合物是具有较好研究前景的抗肿瘤药物先导物，具有较大的开发价值。
Figure BDA0002678573720000021
但是，作为天然产物来源的化合物FW05328-1，其产物发酵效价极低，难以实现大规模发酵生产。因此福建省微生物研究所通过诱变育种获得高产菌株Micromonosporasp.FIM-MA181224并对其发酵工艺进行优化(详见中国专利CN 110283747 B)，在10L-500L发酵罐的发酵实验中，Micromonospora sp.FIM-MA181224发酵生产化合物FW05328-1的效价达到249.8mg/L，为化合物FW05328-1的工业化生产奠定基础。
尽管如此，大环内酰胺类化合物FW05328-1的发酵效价仍无法满足工业化生产的需求，这主要是因为，除了发酵效价期待进一步提高外，在Micromonospora sp.FIM-MA181224发酵产生化合物FW05328-1的过程中，会伴随着一系列FW05328-1同系物的产生，不利于后续目标产物的分离机提取。因此，如何通过发酵工艺的优化以提高发酵液中目标产物FW05328-1含量，以及有效提高目标化合物在发酵液中的组分比例，对FW05328-1化合物的工业化研究具有重要的意义。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种高效发酵产大环内酰胺化合物FW05328-1的方法，以解决现有技术中FW05328-1化合物发酵效价及产物比例较低的问题。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种高效发酵产大环内酰胺化合物FW05328-1的方法，包括将海洋小单孢菌发酵菌株接种至含3-氨基丁酸的发酵培养基中进行发酵培养的步骤。
具体的，所述发酵培养基中，所述3-氨基丁酸的质量浓度为0.005-0.01wt％。
具体的，所述发酵培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉1.6-2.0％，葡萄糖0.3-0.6％，蛋白胨0.4-0.6％，黄豆饼粉0.20-0.30％，酵母粉0.15-0.25％，K2HPO4·3H2O0.03-0.06％，(NH4)2SO4 0.03-0.06％，CaCO3 0.08-0.12％，海盐0.8-1.2％，3-氨基丁酸0.005％-0.01％，调pH值6.2-6.8。
优选的，所述发酵培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉1.8％，葡萄糖0.5％，蛋白胨0.5％，黄豆饼粉0.25％，酵母粉0.2％，K2HPO4·3H2O 0.05％，(NH4)2SO40.05％，CaCO3 0.1％，海盐1％，3-氨基丁酸0.0075％，自来水配制，调pH值为6.6。
具体的，所述发酵培养步骤的条件为：以1.0-2.0％的接种量将种子液进行接种，控制罐压0.02-0.04Mpa，控制转速180-220r/min，通气0.8-1.2vvm，于26-30℃进行发酵培养5-7d。
优选的，所述发酵培养步骤中，发酵前期控制转速180r/min，当菌体浓度达到7％时，提高转速至200r/min，并根据发酵过程中DO参数及菌丝生长的变化，逐步提高转速至220r/min。
更优选的，所述发酵培养步骤的条件为：以1.8％的接种量进行接种，控制罐压0.03Mpa，发酵前期控制转速180r/min，通气1.0vvm，随着菌丝的增长，当菌浓达到7％时，提高转速至200r/min，并根据发酵过程中DO参数及菌丝生长的的变化，逐步提高转速至220r/min。
具体的，所述方法还包括将所述发酵菌株接种于种子培养基中进行种子液培养的步骤，所述种子培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉1.0-2.0％，葡萄糖0.4-0.6％，蛋白胨0.4-0.8％，酵母粉0.4-0.6％，(NH4)2SO40.04-0.06％，K2HPO4·3H2O 0.03-0.06％，CaCO30.15-0.25％，海盐1.4-2.0％，自来水配制，调pH值pH7.0-7.4。
优选的，所述种子培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉1.5％，葡萄糖0.5％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，(NH4)2SO40.05％，K2HPO4·3H2O 0.05％，CaCO3 0.20％，海盐1.6％，自来水配制，调pH值为pH7.2。
具体的，所述种子液培养步骤包括摇瓶种子液培养及种子罐培养步骤。
具体的，所述摇瓶种子液培养步骤条件为：将新鲜斜面挖块接入所述种子培养基，于27-29℃、控制转速200-240r/min培养68-80h得到摇瓶种子培养液。
优选的，所述摇瓶种子液的培养步骤为：将培养好的新鲜斜面按0.5cm×0.5cm挖块接入种子培养基，28℃、220r/min培养72h得到摇瓶种子培养液。
具体的，所述种子罐种子液培养步骤条件为：将培养好的摇瓶种子培养液以3.0-5.0％的接种量接种到含所述种子培养基的种子罐中，控制温度27-29℃，罐压0.02-0.04Mpa，控制转速200-240r/min，发酵40-56h得到所需种子液。
优选的，所述种子罐的培养步骤为：将培养好的摇瓶种子以4.0％的接种量接种于种子罐中，发酵温度28℃，罐压0.03Mpa，发酵期间控制转速220r/min，发酵48h种子罐培养成熟。
具体的，所述方法还包括将所述菌株接种于高氏天冬素固体斜面培养基进行活化培养的步骤，所述固体斜面培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉1.5-3.5％，L-天冬素0.04-0.06％，KNO3 0.08-0.12％，K2HPO4·3H2O 0.04-0.06％，NaCl 0.04-0.06％，MgSO4·7H2O 0.04-0.06％，CaCO3 0.08-0.12％，琼脂1-2％，调pH值pH7.0-7.4。
优选的，所述固体斜面培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉2.0％，L-天冬素0.05％，KNO3 0.1％，K2HPO4·3H2O 0.05％，NaCl 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCO30.1％，琼脂1.5％，调pH值7.2。
优选的，所述海洋小单孢菌株，其分类命名为Micromonospora sp.FIM-MA181224，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.17139。
本发明还公开了一种3-氨基丁酸用于制备高效发酵产大环内酰胺化合物FW05328-1的发酵培养基的用途。
具体的，本发明还公开了一种高效发酵产大环内酰胺化合物FW05328-1的发酵培养基，具体包括质量浓度为0.005-0.01wt％的3-氨基丁酸。
本发明所述高效发酵产大环内酰胺化合物FW05328-1的方法，在现有报道的生物合成途径基础上，通过对发酵培养基的优化，并添加3-氨基丁酸进行产物诱导，建立了适应于菌株Micromonospora sp.FIM-MA181224产目标产物的发酵培养基及培养工艺，使菌株Micromonospora sp.FIM-MA181224在10L-500L发酵罐发酵实验中，发酵产FW05328-1能力由249.8mg/L提高至654.2mg/L，大幅提高目标产物的产生能力(提高261.9％)；并且，该方法在提高微生物药物产量的同时，也能使微生物生物合成的代谢途径发生改变，使微生物药物同系物的代谢途径被阻止，从而代谢流量更多地转向生产目标药物，提高发酵代谢产物中目标药物的组分比例，发酵液中FW05328-1化合物组分比例由22.3％提高至74.8％(HPLC方法)，提高幅度达到335.4％，有利于将目标产物从一系列的同系物中分离出来，简化其分离纯化步骤，从而为FW05328-1的规模化制备提供基础。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为本发明实施例5中，菌株Micromonospora sp.FIM-MA181224的500L发酵罐的发酵曲线图。
图2为本发明实施例5中，菌株Micromonospora sp.FIM-MA181224发酵液中FW05328-1组分比例的HPLC图。
具体实施方式
本发明下述实施例中，发酵的所述目标化合物FW05328-1的结构式如下：
Figure BDA0002678573720000061
本发明下述实施例中，涉及化合物FW05328-1发酵培养的菌株为海洋小单孢菌株Micromonospora sp.FIM-MA181224，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为CGMCC NO.17139，保藏日期为2019年01月07日。
本发明下述实施例中，对于发酵液中大环内酰胺化合物FW05328-1的含量检测采用现有技术中已知的HPLC-DAD方法，具体包括：Agilent 1260InfinityⅡHPLC系统，DAD检测器，色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6╳250mm、5μm)，柱温：40℃，检测波长298nm，流动相：33％乙腈，流速：1.0mL/min。
实施例1
将保存的海洋小单孢菌菌株Micromonospora sp.FIM-MA181224于高氏天冬素固体培养基上35℃培养15d，得到海洋小单孢菌Micromonospora sp.FIM-MA181224的新鲜斜面。
将海洋小单孢菌Micromonospora sp.FIM-MA181224的新鲜斜面挖块(0.5cm×0.5cm)接种于摇瓶种子培养基，于28℃、220r/min培养72h得到摇瓶种子，将摇瓶种子按4％接种量接种于摇瓶发酵培养基，于28℃、220r/min培养6d后放瓶，经HPLC法测定发酵液中FW05328-1含量及组分比例。
所述种子培养基配制方法：玉米淀粉6g，蛋白胨5g，豆粕5g，酵母粉3g，K2HPO4·3H2O 0.5g，CaCO3 1g，海盐16g，自来水1L，调pH值为pH7.2。
发酵培养基配制方法：可溶性淀粉10g，蛋白胨5g，黄豆饼粉2.5g，酵母粉2g，K2HPO4·3H2O 0.5g，CaCO3 1g，海盐10g，3-氨基丁酸0.1g，自来水1L，调pH值为pH 6.6。
对比例1
本对比例所述化合物FW05328-1的发酵方法同实施例1，其区别仅在于，所述摇瓶发酵培养基中不添加所述3-氨基丁酸。
对比例2
本对比例所述化合物FW05328-1的发酵方法同实施例1，其区别仅在于，所述摇瓶发酵培养基中不添加所述3-氨基丁酸，而添加等量的3-天冬氨酸。
对比例3
本对比例所述化合物FW05328-1的发酵方法同实施例1，其区别仅在于，所述摇瓶发酵培养基中不添加所述3-氨基丁酸，而添加等量的赖氨酸。
对比例4
本对比例所述化合物FW05328-1的发酵方法同实施例1，其区别仅在于，所述摇瓶发酵培养基中不添加所述3-氨基丁酸，而添加等量的谷氨酸。
对比例5
本对比例所述化合物FW05328-1的发酵方法同实施例1，其区别仅在于，所述摇瓶发酵培养基中不添加所述3-氨基丁酸，而添加等量的甘氨酸。
上述实施例1及对比例1-5中摇瓶发酵放瓶后，经HPLC法测定菌株Micromonosporasp.FIM-MA181224应用上述各方案培养基进行发酵的发酵液，证实上述方案所得发酵液中均发酵得到目标化合物，进一步测定发酵液中FW05328-1化合物的含量及比例，测试结果见下表1。
表1不同氨基酸对FW05328-1发酵效价及组分的影响
实施例1 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4 对比例5
发酵效价(μg/ml) 238.5 125.8 120.3 117.3 127.6 128.7
组分比例(％) 74.2％ 22.3％ 20.7％ 18.6％ 24.1％ 25.3％
如表1中结果所示，本发明所述发酵产化合物FW05328-1的方法中，通过在发酵培养基中添加3-氨基丁酸进行诱导，可添加显著提高Micromonospora sp.FIM-MA181224发酵生产FW05328-1的能力，其发酵效价提高189.6％，同时发酵液中FW05328-1组分比例由22.3％提高至74.2％，大大有利于后期的分离纯化工作。
实施例2
本实施例进一步对所述发酵方法中的发酵培养基进行优化，筛选出更适宜的种子液培养基及发酵培养基。
本实施例所述化合物FW05328-1的发酵方法同实施例1，其区别仅在于：
所述种子培养基成分及含量如下：可溶性淀粉18g，葡萄糖6g，蛋白胨4g，酵母粉5g，(NH4)2SO40.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，CaCO3 2.0g，海盐16g，自来水1L，调pH值为pH7.2；
所述发酵培养基成分及含量如下：可溶性淀粉16g，葡萄糖4g，蛋白胨6g，黄豆饼粉2.5g，酵母粉2g，K2HPO4·3H2O 0.5g，(NH4)2SO40.5g，CaCO3 1.0g，海盐10g，3-氨基丁酸0.1g，自来水1L，调pH值为6.6。
对比例6
本对比例所述化合物FW05328-1的发酵方法同实施例2，其区别仅在于：
所述种子培养基成分及含量如下：玉米淀粉6g，蛋白胨5g，豆粕5g，酵母粉3g，K2HPO4·3H2O 0.5g，CaCO3 1g，海盐16g，自来水1L，调pH值为pH7.2；
所述发酵培养基成分及含量如下：可溶性淀粉10g，蛋白胨5g，黄豆饼粉2.5g，酵母粉2g，K2HPO4·3H2O 0.5g，CaCO3 1g，海盐10g，3-氨基丁酸0.1g，自来水1L，调pH值为pH6.6。
上述实施例2及对比例6中摇瓶发酵放瓶后，经HPLC法测定发酵液中FW05328-1含量及组分比例，结果如表2所示。
表2不同培养基对FW05328-1发酵效价及组分的影响
实施例2 对比例6
发酵效价(mg/L) 336.7 241.2
组分比例(％) 73.2％ 72.8％
由表2中结果可知，本发明优化后的种子液培养基和发酵培养基可使Micromonospora sp.FIM-MA181224发酵产抗肿瘤化合物FW05328-1的能力提高39.6％，达336.7mg/L，发酵液中FW05328-1组分比例达到73.2％。
实施例3 10L发酵罐发酵培养
将保存的海洋小单孢菌菌株Micromonospora sp.FIM-MA181224于高氏天冬素固体培养基上35℃培养15d，得到海洋小单孢菌Micromonospora sp.FIM-MA181224的新鲜斜面。
将海洋小单孢菌Micromonospora sp.FIM-MA181224的新鲜斜面挖块(0.5cm×0.5cm)接种于摇瓶种子培养基，于28℃、220r/min培养72h得到摇瓶种子。
将上述培养好的摇瓶种子以1.5％的接种量接种到10L发酵罐中，发酵罐培养基装量7L，发酵温度28℃，罐压0.03Mpa，发酵0-48h控制转速180r/min，通气量为1：1.0vvm，随着菌丝的增长，发酵约48h后菌浓达到7％时，提高转速至200r/min，通气量调整至1：1.2vvm，发酵90h后根据发酵过程中DO参数及菌丝生长的变化，再逐步提高转速至220r/min，发酵48-72h内发酵罐内培养基起泡时补加泡敌2ml，发酵144h时发酵终止进行放罐。
上述种子培养基成分及配制方法：可溶性淀粉15g，葡萄糖5g，蛋白胨5g，酵母粉5g，(NH4)2SO40.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，CaCO32g，海盐16.5g，自来水1L，调pH值为pH7.2。
上述发酵培养基成分及配制方法：可溶性淀粉18g，葡萄糖5g，蛋白胨5g，黄豆饼粉2.5g，酵母粉2.0g，K2HPO4·3H2O 0.5g，(NH4)2SO40.5g，CaCO3 1.0g，海盐10g，3-氨基丁酸0.075g，自来水1L，调pH值为6.6。
本实施例中，整个发酵过程通过HPLC检测发酵液中化合物FW05328-1的含量及组分比例，发酵终止时发酵效价为383.2mg/L，发酵液中FW05328-1组分比例为73.3％。
实施例4 100L发酵罐发酵培养
本实施例的发酵过程同实施例3，其区别在于，在100L发酵罐中培养基装量为70L，接种量为1.8％，以种子罐培养好的种子液按1.8％的接种量接到100L发酵罐中，发酵48-72h内发酵罐内培养基起泡时补加泡敌20ml。
种子罐培养方法：将按照上述实施例3中摇瓶培养工艺培养好的摇瓶种子以4.0％的接种量接种到10L发酵罐中，种子罐装液量7L，发酵温度28℃，罐压0.03Mpa，发酵期间控制转速220r/min，发酵48h种子罐培养成熟。
整个发酵过程中，通过HPLC检测发酵液中化合物FW05328-1的含量及组分比例，发酵终止时发酵效价为603.8mg/L，发酵液中FW05328-1组分比例为74.1％。
实施例5 500L发酵罐发酵培养
本实施例的发酵过程同实施例4，其区别在于，在500L发酵罐中装液量为350L，接种量为1.8％，以种子罐培养好的种子以1.8％的接种量接到500L发酵罐中，发酵48-72h内发酵罐内培养基起泡时补加泡敌100ml。
种子罐培养方法：将按照上述实施例3中摇瓶培养工艺培养好的摇瓶种子以4.0％的接种量接种到20L发酵罐中，种子罐装液量14L，发酵温度28℃，罐压0.03Mpa，发酵期间控制转速220r/min，发酵48h种子罐培养成熟。
整个发酵过程中，通过HPLC检测发酵液中化合物FW05328-1的含量及组分比例，发酵罐的发酵曲线图如附图1所示，发酵液中FW05328-1组分比例的HPLC图见附图2。可见，发酵终止时发酵效价为654.2mg/L，发酵液中FW05328-1组分比例为74.8％。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (5)

1.一种高效发酵产大环内酰胺化合物FW05328-1的方法，其特征在于，所述大环内酰胺化合物FW05328-1具有如下式所示的结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
，
所述方法包括将海洋小单孢菌发酵菌株接种至含质量浓度为0.005-0.01wt%的3-氨基丁酸的发酵培养基中进行发酵培养的步骤；
所述海洋小单孢菌株，其分类命名为Micromonosporasp. FIM-MA181224，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.17139；
所述发酵培养步骤的条件为：以1.0-2.0%的接种量将种子液进行接种，控制罐压0.02-0.04Mpa，控制转速180-220r/min，通气0.8-1.2vvm，于26-30℃进行发酵培养5-7d；
所述发酵培养步骤中，发酵前期控制转速180r/min，当菌体浓度达到7%时，提高转速至200r/min，并根据发酵过程中DO参数及菌丝生长的变化，逐步提高转速至220r/min。
2.根据权利要求1所述高效发酵产大环内酰胺化合物FW05328-1的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉1.6-2.0%，葡萄糖0.3-0.6%，蛋白胨0.4-0.6%，黄豆饼粉0.20-0.30%，酵母粉0.15-0.25%，K2HPO4·3H2O 0.03-0.06%，(NH4)2SO4 0.03-0.06%，CaCO3 0.08-0.12%，海盐0.8-1.2%，3-氨基丁酸0.005%-0.01%，调pH值6.2-6.8。
3.根据权利要求1或2所述高效发酵产大环内酰胺化合物FW05328-1的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述发酵菌株接种于种子培养基中进行种子液培养的步骤，所述种子培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉1.0-2.0%，葡萄糖0.4-0.6%，蛋白胨0.4-0.8%，酵母粉0.4-0.6%，(NH4)2SO40.04-0.06%，K2HPO4·3H2O 0.03-0.06%， CaCO30.15-0.25%，海盐1.4-2.0%，自来水配制，调pH值 pH7.0-7.4。
4.根据权利要求3所述高效发酵产大环内酰胺化合物FW05328-1的方法，其特征在于，所述种子液培养步骤包括摇瓶种子液培养及种子罐培养步骤；
所述摇瓶种子液培养步骤条件为：将新鲜斜面挖块接入所述种子培养基，于27-29℃、控制转速200-240r/min培养68-80h得到摇瓶种子培养液；
所述种子罐种子液培养步骤条件为：将培养好的摇瓶种子培养液以3.0-5.0%的接种量接种到含所述种子培养基的种子罐中，控制温度27-29℃，罐压0.02-0.04Mpa，控制转速200-240r/min，发酵40-56h得到所需种子液。
5.根据权利要求1或2所述高效发酵产大环内酰胺化合物FW05328-1的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述菌株接种于高氏天冬素固体斜面培养基进行活化培养的步骤，所述固体斜面培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉 1.5-3.5%，L-天冬素0.04-0.06%，KNO3 0.08-0.12%，K2HPO4·3H2O 0.04-0.06%，NaCl 0.04-0.06%，MgSO4·7H2O 0.04-0.06%，CaCO3 0.08-0.12%，琼脂1-2%，调pH值pH7.0-7.4。
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