CN103820369B - 一种萤光假单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种假单胞菌酸A产生菌及其应用。该假单胞菌酸A产生菌是萤光假单胞菌(Pseudomonas？fluorescens)，保藏编号为CGMCC？No.7147。具有非常高的假单胞菌酸A的发酵能力，其生产假单胞菌酸A的能力比现有的产生菌高出很多倍，比出发菌株提高5倍以上，它在5000L发酵罐的发酵单位可达2500mg/L以上。并且，假单胞菌CGMCC？No.7147发酵产物成分简单，无假单胞菌酸A的结构类似物，从而大大降低从发酵液中分离和纯化假单胞菌酸A的成本。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种萤光假单胞菌及其应用。
背景技术
假单胞菌酸A，又称为莫匹罗星，化学名称为9-｛4-【5-2，3-环氧-5-羟基-4-甲基已基】-3，4-二羟基四氢吡喃-2-基｝-3-甲基丁-2-烯酰氧｝壬酸，结构式如式I所示。它于1971年从假单胞菌发酵培养物分离得到的一种具有抗菌活性的化合物。
假单胞菌酸A作用在细菌体内的异亮氨酸—tRNA合成酶与异亮氨酸的结合点上，从而阻碍氨基酸的合成，消耗了细胞内的tRNA，使RNA的合成及蛋白质的合成过程中止，从而抑制细菌的生长。假单胞菌酸A对革兰氏阳性菌，比如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌具有很强的抗菌活性。对一些革兰氏阴性菌，如流感嗜血杆菌，淋球菌等也有效。由于假单胞菌酸A对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的治疗显示出了独特的疗效，具有重要的临床应用前景。
虽然假单胞菌酸A是可以利用液体发酵培养假单胞菌（Pseudomonassp.）来的生产的，但目前假单胞菌酸A发酵生产水平较低，而且假单胞菌的培养过程除了会产生主产物假单胞菌酸A外，还有产生大量的结构类如假单胞菌酸B、C、D组份，导致假单胞菌酸A生产成本昂贵。为了降低生产成本，有必要对现有的产生菌进行改造，提高菌种的生产水平。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对目前假单胞菌酸A的生产菌生产假单胞菌酸A的发酵水平较低的缺陷，提供一种具有非常高的假单胞菌酸A发酵单位的假单胞菌酸A的生产菌及其应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明的技术方案之一是：一种萤光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，其保藏编号为CGMCCNo.7147。
本发明的萤光假单胞菌CGMCCNo.7147的培养方法包括以下步骤：将种子液接种于发酵培养基中，25-30℃，pH5.0-6.0发酵培养。其中，所述的发酵培养基的最适的碳源为：葡萄糖，甘油。最适的氮碳源为蛋白胨，酵母提取物、黄豆饼粉、（NH4）2SO4等。发酵的温度为4-37℃，优选20-30℃，更优选28℃。pH为5.0-6.0，优选pH5.5。
本发明的技术方案之二是：一种如式I所示的假单胞菌酸A的制备方法，包括以下步骤：将萤光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)CGMCCNo.7147发酵，从发酵液中获得如式I所示的假单胞菌酸A，
其中，所述发酵的培养条件是常规的萤光假单胞菌的培养条件，优选4-37℃培养96-120小时。发酵温度可以是4-37℃，优选20-30℃，更优选28℃。pH优选5.0-6.0，更优选pH5.5。发酵培养优选摇瓶培养或者发酵罐培养。
所述发酵的培养基是常规的萤光假单胞菌的培养基，优选LB培养基或者是以克每升（g/L）计组分如下的培养基：甘油50，黄豆饼粉10，蛋白胨10，(NH4)2SO45，MgSO43，K2PO42，pH7.0-7.2。
所述的发酵接种的种子液是常规的，较佳的经过了1-2级的种子培养所得到的种子液。种子液的接种量优选1-2%（v/v）。
其中，所述的种子液是常规的，优选是经过如下种子培养获得的种子液，所述的种子培养包括将斜面培养的菌体接种于种子培养基中，28℃培养20小时。所述的种子培养基优选以克每升（g/L）计组分如下的培养基：葡萄糖10，蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl1，pH7.0-7.2。
所述的斜面培养是常规的，优选的包括将菌种接种于斜面培养基上，30℃培养培养3天。所述的斜面固体培养基优选以克每升（g/L）计组分如下的培养基：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl1，琼脂20，pH7.0-7.2。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供了假单胞菌酸A的高产菌株——假单胞菌CGMCCNo.7147，其是萤光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，是以萤光假单胞菌ATCC49323(美国菌种保藏中心保藏)为出发菌种，经自然选育、物理和化学诱变等手段筛选获得的高产菌株。本发明提供的假单胞菌CGMCCNo.7147，具有非常高的假单胞菌酸A的发酵单位，其生产假单胞菌酸A的能力比现有的产生菌高出很多倍，比出发菌株提高5倍以上，它在5000L发酵罐的发酵单位可达2500mg/L以上。并且，假单胞菌CGMCCNo.7147发酵产物成分单一，假单胞菌酸A的结构类似物极少，从而大大降低从发酵液中分离和纯化假单胞菌酸A的成本。
生物材料保藏信息
本发明的萤光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，已于2013年01月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。该菌株的菌株名称是：RB-MP-1；分类命名是荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）；保藏编号为：CGMCCNo.7147。
附图说明
图1为萤光假单胞菌CGMCCNo.7147菌种选育系谱。其中NS：自然分离；UV：紫外诱变；NTG：NTG诱变。
图2为16SDNAPCR的凝胶电泳结果。其中1，Marker；2，CGMCCNo.7147的16SDNAPCR产物。A是Marker图。B是Marker和16SrDNA图。
图3是CGMCCNo.7147的16SrDNA和Genbank数据库中的16SrDNA的序列对比结果。
图4为萤光假单胞菌CGMCCNo.7147发酵液的HPLC分析图谱。假单胞菌酸A的保留时间为12.365min。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
以下实施例中所用的菌种培养基如下：
斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl1，琼脂20，pH7.0-7.2；
种子培养基（g/L）：葡萄糖10，蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl1，pH7.0-7.2；
发酵培养基（g/L）：甘油50，黄豆饼粉10，蛋白胨10，（NH4）2SO45，MgSO43，K2PO41，pH7.0-7.2。
实施例1菌种的获得
1、出发菌株
萤光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)ATCC49323（购自ATCC）。
2、菌种的培养过程
将出发菌株萤光假单胞菌接种于斜面培养基，30℃培养培养3天，用无菌水洗下菌液，按1%(v/v)接种量接种于种子培养基，28℃培养20小时，按2%(v/v)接种量接种发酵培养基，28℃培养4～5天。可以根据不同的发酵培养规模，设定不同的种子培养级数。
3、单胞菌酸A的HPLC分析条件：
取发酵液，12000rpm离心10min，取上清液进行HPLC分析。
流动相：50mmol/L磷酸二氢钠(pH6.3):乙腈=75:25。
检测波长：229nm
HPLC柱：C18,250*4.6mm
流速：1ml/min
温度：30℃
进样量：20μl
4、菌种的自然分离
取菌株的新鲜斜面，加入无菌水洗下菌体得到菌体的菌悬液。将菌悬液梯度稀释后涂布于平板分离斜面上，于30℃培养得到单菌落。
5、诱变处理
(1)紫外诱变处理
取出菌株的新鲜斜面，加入无菌水洗下菌体，得到菌体的菌悬液，将菌悬液置于波长253.7nm、功率为30W的紫外灯下照射，进行诱变处理。处理后梯度稀释，并涂布于平板分离斜面，于30℃培养3天。
(2)NTG诱变处理
取菌株的新鲜斜面，用磷酸缓冲液洗下菌体，得到菌体的菌悬液，在菌悬液中加入2mg/mL的NTG，于28℃摇床上振荡处理20-60分钟，取样梯度稀释涂布平板分离斜面，于30℃培养3天。
6、摇瓶筛选
将经选育处理得到的单菌落接种于斜面培养基，30℃培养3天，再接种于种子瓶和发酵瓶28℃培养，用HPLC分析假单胞菌酸A效价。取发酵单位高的菌株，经过平板分离后和发酵培养验证后，最终获得发酵单位高的生产菌株，提交保藏，其微生物菌种保藏号为CGMCCNo.7147，菌种选育系谱见图1。
实施例2萤光假单胞菌CGMCCNo.7147的形态和培养特征
萤光假单胞菌CGMCCNo.7147为不产孢的革兰氏阴性菌，在LB培养基培养3天，菌落直径在1-3mm之间，呈圆形菌落，中心较突起，菌落颜色呈乳白色。根据《伯杰氏系统细菌学手册》进行鉴定，菌株的生理反应如表1所示，说明该菌株是Pseudomonasfluorescens。
表1.萤光假单胞菌CGMCCNo.7147的生理反应
实施例3萤光假单胞菌CGMCCNo.7147菌种16SrDNA鉴定
萤光假单胞菌CGMCCNo.7147提取基因组DNA，进行16SrDNA分析。
设计引物，7F5’–CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’，和
1540R5’–AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’；
进行PCR扩增，PCR反应体系组成如下表：
| 试剂 | 体积（μl） |
| 模板（基因组DNA20-50ng/μl） | 0.5 |
| 5×Buffer（含Mg2+） | 2.5 |
| dNTP（各2.5mM） | 1 |
| 7F（10μM） | 0.5 |
| 1540R（10μM） | 0.5 |
| Taq酶 | 0.5 |
| 加双蒸H2O至 | 25 |
PCR条件如下表所示：
PCR产物的琼脂凝胶电泳结果见图2。对PCR产物进行DNA测序，与Genbank数据库中的16SrDNA进行序列比对，结果见图3。由此可见，萤光假单胞菌CGMCCNo.7147菌株与Pseudomonasfluorescens的16SrDNA相同，可以鉴定为荧光假单胞菌。
实施例4摇瓶的发酵培养
将萤光假单胞菌CGMCCNo.7147接种于斜面培养基中，30℃培养3天。将斜面菌体接种于含25ml种子培养液的250ml三角摇瓶中，置于摇床培养20小时，转速220rpm，温度30℃。将培养好的种子液按2%(v/v)接种量转种于含30ml发酵培养液的250ml三角摇瓶中，置于摇床培养，转速220rpm，温度28℃。培养96小时后放瓶，检测假单胞菌A的发酵单位为650mg/L。与出发菌株ATCC49323的对照试验结果如表2。
表2.CGMCCNo.7147与出发菌株ATCC49323的假单胞菌A产量
| 菌种 | ATCC49323 | CGMCC No.7147 |
| 发酵单位 | 95mg/L | 650mg/L |
| 相对发酵单位 | 100％ | 684％ |
| 提高倍数 | 6.84 |
实施例550L发酵罐培养
将萤光假单胞菌CGMCCNo.7147接种于斜面培养基中，30℃培养培养3天。将斜面菌体接种于含100ml种子培养液的1000ml三角摇瓶中。置于摇床培养20小时，转速220rpm，温度28℃。将培养好的种子液按1%(v/v)接种量转种于10L的种子罐，温度28℃，转速200rpm，通气量1:1VVM，培养20小时。将种子液按2％(v/v)接种量接入30L培养液的50L发酵罐中，28℃发酵培养，初始搅拌200rpm，控制相对溶氧30％以上，用氨水控制pH5.5，通气量1:1VVM，培养至20小时，控制开始补加入一定量的甘油以维持pH在5～5.5左右，培养至96小时放罐，检测假单胞菌A的发酵单位为2650mg/L。
实施例65000L发酵罐培养
将萤光假单胞菌CGMCCNo.7147接种于斜面培养基中，30℃培养3天。将斜面菌体接种于含100ml种子培养液的1000ml三角摇瓶中，置于摇床培养20小时，转速220rpm，温度28℃。将培养好的种子液按1%(v/v)接种量转种于含60L培养液的100L种子罐中，转速200rpm，通气量1：1VVM，28℃培养20小时。将种子液按2％(v/v)接种量接入含3000L培养液的50000L发酵罐中，28℃发酵培养，初始搅拌转速80rpm，控制相对溶氧30％以上，用氨水控制pH5.5，通气量1:1VVM，培养至20小时，开始补加入一定量的甘油以维持pH在5～5.5左右，培养至96小时放罐，检测假单胞菌A的发酵单位为2850mg/L。HPLC检测结果如图4所示。与假单胞菌酸A标准品对照，可知保留时间为12.365min为假单胞菌酸A。
可见萤光假单胞菌CGMCCNo.7147生产假单胞菌酸A的能力非常高。并且，发酵产物成分简单，无假单胞菌酸A的结构类似物，可大大降低从发酵液中分离假单胞菌酸A的成本。
实施例7发酵提取物成分的分析
取实施例6所得发酵液10L过滤，分别用1L和0.5L乙酸乙酯萃取两次，合并乙酸乙酯萃取液，40℃真空浓缩至200ml，置于-18℃冰箱结晶16小时，过滤得粗品，取粗品若干用8倍乙酸乙酯加热溶解，加活性炭适量脱色过滤，滴加2倍正庚烷，放置4℃冰箱结晶16小时，过滤，50～60℃真空烘干得成品。
取成品和莫匹罗星的USP标准品进行高分辨率质谱分析：样品精确质量数为501.3061，523.2883；分子式为:C26H45O9,C26H45NaO9;USP对照品精确质量数为501.3059，523.2876；分子式为:C26H45O9,C26H45NaO9。结论：样品的高分辨率质谱测得的分子式与该化学结构分子式加氢[M+H]+，分子式加钠[M+Na]+一致，并与对照品一致。
Claims (10)
1.一种萤光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.7147。
2.一种如式I所示的假单胞菌酸A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将萤光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)CGMCCNo.7147发酵，从发酵液中获得如式I所示的假单胞菌酸A，
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的培养条件是4-37℃培养96-120小时。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的培养基是LB培养基。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的发酵接种的种子液是经1-2级种子培养所得到的种子液。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的发酵接种的种子液的接种量是1-2％，所述百分比是体积百分比。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的种子液是经过如下种子培养获得的种子液，所述的种子培养包括将斜面培养的萤光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)CGMCCNo.7147菌体接种于种子培养基中，28℃培养20小时。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的种子培养基是以克每升计组分如下的培养基：葡萄糖10，蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl1，pH7.0-7.2。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的斜面培养包括将萤光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)CGMCCNo.7147菌种接种于斜面培养基上，30℃培养3天。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的斜面固体培养基是以克每升计组分如下的培养基：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl1，琼脂20，pH7.0-7.2。
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