CN117660267B - 一种用于防控茶树病原真菌的伯克霍尔德菌及其应用 - Google Patents
一种用于防控茶树病原真菌的伯克霍尔德菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于防控茶树病原真菌的伯克霍尔德菌及其应用，属于农业微生物技术领域。本发明的伯克霍尔德菌（Burkholderia sp.）GS2Y是一个潜在新种，其保藏号为：GDMCC No：64147。该菌株易于培养，细胞为短杆状，有鞭毛；其对Colletotrichum siamense、Diaporthe phaseolorum和Phyllosticta capitalensis等3种茶树病原真菌均具有较强的拮抗活性，其发酵上清液的粗提物也具有良好的热稳定性，能够有效抑制茶树病原真菌的菌丝生长，可用于制备防治茶叶病原真菌的微生物制剂产品，能产生显著的经济和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及一种用于防控茶树病原真菌的伯克霍尔德菌及其应用。
背景技术
茶树[Camellia sinensis(L.) O. Kuntze)]属于山茶科山茶属，是我国最重要的叶用经济作物之一。由于茶树主要生长在热带和亚热带地区，气候温暖湿润有利于各类病原菌的滋生与传播。根据病害发生部位，茶树病害可分为叶病、茎病和根病，其中叶片作为茶叶的收获和加工部位，叶部病害直接影响到最终的茶叶品质。目前已报道的茶树叶部病原菌主要为真菌，常见的包括茶炭疽病(Colletotrichum siamense)、叶斑病(Phyllosticta capitalensis)、枯死病(Diaporthe phaseolorum)、茶饼病、茶白星病、茶轮斑病、茶云纹叶枯病和茶芽枯病等。茶叶作为一种日常直接冲泡的饮品，在病害防控过程中采用化学药物极易造成农残超标，发展绿色、安全、高效的防控技术是保障茶产业的健康可持续发展的重要基础。生物防治具有成本低、安全性高、无污染等优点，尤为适合作为茶叶病害的防治策略。目前，已报道的酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)等对茶饼病表现出了较好的拮抗作用。伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)广泛分布于不同环境中，具有生物固氮、解磷解钾，产植物生长素、抑制病原菌生长等多种功能，在促进植物生长和维持植株健康方面具有重要的应用潜力。充分挖掘和利用绿色安全的植物益生菌资源，能够为我国茶树病害的绿色防控提供重要支撑。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够防控茶树病原真菌的伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.) GS2Y，于2023年12月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院58号楼10楼，邮编：510070，保藏号为：GDMCCNo：64147。
本发明菌株GS2Y的16S rRNA基因序列与伯克霍尔德菌Burkholderia contaminansLMG 23361T的同源性达99.79%，而比较基因组分析的结果表明GS2Y与已发表的亲缘关系最近的伯克霍尔德菌属模式种的核苷酸一致性（ANI）和模拟DNA-DNA杂交值（dDDH）最高为93.897%和52.2%，均明显低于国际分类学公认的ANI 95-96%和dDDH 70%的临界值，表明本发明提供的菌株GS2Y代表了伯克霍尔德菌属中的一个新种。
本发明的第二个目的是提供一种制剂，含有伯克霍尔德菌GS2Y或其培养物。
本发明的第三个目的是提供伯克霍尔德菌GS2Y或所述的制剂在制备防控茶树病原真菌药物中的应用。
优选，是在制备抑制炭疽病菌（Colletotrichum siamense）、Diaporthe phaseolorum和/或Phyllosticta capitalensis的药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种茶树病原真菌的防控方法，是利用所述的伯克霍尔德菌GS2Y或所述的制剂防控茶树病原真菌。
优选，所述的病原真菌是炭疽病菌（Colletotrichum siamense）、Diaporthe phaseolorum和/或Phyllosticta capitalensis。
本发明提供了一种对茶树病原真菌具有良好拮抗作用的伯克霍尔德菌，且该菌株极易培养，其发酵液中的活性物质具有耐热性，有助于后序生防制剂产品的开发。
本发明的Burkholderia sp. GS2Y于2023年12月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院58号楼10楼，邮编：510070，保藏号为：GDMCCNo：64147。
附图说明
图1是伯克霍尔德菌GS2Y抑制茶树病原真菌的平板拮抗效果。
图2是伯克霍尔德菌GS2Y的菌落形态、细胞透射电镜观察图以及基因组系统发育树。
图3是伯克霍尔德菌GS2Y的发酵上清液抑制3种茶树病原真菌结果。A为Colletotrichum siamense；B为Diaporthe phaseolorum；C为Phyllosticta capitalensis。
图4是伯克霍尔德菌GS2Y的发酵上清液的XAD-16树脂粗提物对茶树病原真菌菌丝生长的抑制。
具体实施方式
下面是本发明具体的实施示例。需要指出的是，这些实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。在本发明的思路和范围下对实施方案的细节和形式进行的修改和替换均落入本发明的保护范围内。
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
实施例1 茶树病原真菌拮抗菌株的分离与纯化
1、培养基
R2A培养基：胰蛋白胨 0.25 g，酸水解酪蛋白 0.5 g，酵母浸粉 0.5 g，可溶性淀粉 0.5 g，磷酸氢二钾 0.3 g，硫酸镁 0.1 g，丙酮酸钠 0.3 g，蛋白胨 0.25 g，葡萄糖0.5 g，琼脂粉 15.0 g，用蒸馏水溶解，定容至1 L，将配制好后121 ℃高温蒸汽灭菌20min。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯浸出粉 6.0 g，葡萄糖 20.0 g，琼脂15.0 g，用蒸馏水溶解，定容至1 L，将配制好后121℃高温蒸汽灭菌20 min。
2、实验步骤
（1）样品采集：选择广东省江门市鹤山市鹤山红茶主要种植区域内茶树的根围土，装入采样袋中带回实验室，保存在4 ℃冰箱中待用。
（2）土壤梯度稀释液准备：称取5 g土壤，加入到事先加有玻璃珠和95 mL无菌生理盐水的灭菌三角瓶中，置于30 ℃的摇床中200 rpm震荡培养30 min。取100 µL上清液加入到事先装有900 µL无菌生理盐水的EP管中，依次进行10倍的梯度稀释。
（3）细菌分离：分别取100 μL稀释好的土壤悬液加入到R2A平板上用一次性塑料涂布棒均匀涂开，每个浓度设置三个重复，涂布完成后将平板倒置放于30 ℃恒温培养箱中培养。 隔天观察平板上菌落的生长情况，挑取菌落形态不一致的单菌落在R2A平板上划线，对菌株进行纯化。
（4）平板拮抗实验：利用打孔器将PDA平板上的茶树病原真菌打孔制备菌块，将菌块转接到的R2A平板的中央；然后用灭菌的竹签挑取活化菌株点接到菌块周围，距菌块2 cm处，每个平板点接4个供试菌株，30℃培养3天，观察抑菌圈的有无，并用螺旋测微尺测量抑菌圈的大小。
3、实验结果
我们在古劳生态茶园的土壤中分离到1株对茶树病原真菌具有良好拮抗效果的菌株GS2Y，其对Colletotrichum siamense、Diaporthe phaseolorum和Phyllosticta captalensis等3种茶树病原真菌具有良好的抑制活性（图1）；
实施例2 拮抗菌株GS2Y的分类鉴定
1、实验步骤
（1）参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠主编)对分离菌株进行鉴定。方法如下：利用细菌DNA提取试剂盒提取菌株GS2Y的基因组DNA。利用细菌16S rRNA基因特异性引物27F和1492R对GS2Y的16S rRNA基因序列进行扩增，扩增产物经电泳分析产生约1500 bp左右的条带，切胶回收该条带后送苏州金唯智生物科技有限公司进行Sanger测序，测序得到的序列经DNAMAN软件拼接后获得16S rRNA基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
（2）菌株GS2Y基因组分析：利用细菌DNA提取试剂盒提取GS2Y的基因组DNA，送到上海美吉生物医药科技有限公司进行基因组测序，采用SPAdes v3.13.0对菌株GS2Y的测序下机数据进行组装。从NCBI的数据库中获得已发表模式种的基因组序列，采用UBCG构建基于核心基因组的系统进化树。采用FastANI计算GS2Y的基因组与已发表模式菌种的基因组序列之间平均核苷酸一致性（Average Nucleotide Identity, ANI）。采用在线工具GGDC 2.1（http://ggdc.dsmz.de/home.php）计算菌株GS2Y与已发表的近缘模式菌株的模拟DNA-DNA杂交值（dDDH）。
2、实验结果
菌株GS2Y革兰氏染色为阴性，在LB、NA、R2A等培养基中均生长良好，细胞为短杆状，有鞭毛（图2）。菌株GS2Y的16S rRNA基因序列与伯克霍尔德菌属的已发表模式种Burkholderia contaminansLMG 23361T具有最高的同源性，为99.79％。尽管如此，基于核心基因组的系统发育分析的结果表明菌株GS2Y与模式菌株Burkholderia stabilis ATCCBAA-67T和Burkholderia pyrrociniaDSM 10685T具有更近的亲缘关系。比较基因组分析结果发现菌株GS2Y与伯克霍尔德菌属已发表的亲缘关系较近的模式种ANI为89%~93.9%，dDDH为33.7~52.2%，均低于国际分类学公认的ANI 95-96%和dDDH 70%的临界值，表明菌株GS2Y代表了伯克霍尔德菌属中的一个新种（表1，图2），命名为伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.) GS2Y，于2023年12月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院58号楼10楼，邮编：510070，保藏号为：GDMCCNo：64147。
表1 伯克霍尔德菌GS2Y与伯克霍尔德菌属近缘模式种的ANI和DDH值
实施例3 含毒平板法检测发酵上清液对茶树病原真菌的抑制作用
1、培养基
LB液体培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。
2、实验步骤
（1）GS2Y发酵上清液的制备：将新活化的菌株GS2Y单菌落接种到装有3 mL LB液体培养基的试管中，200 rpm，30 ℃震荡培养1 d。然后，按照1%的接种量接种到装有100 mLLB液体培养基的三角瓶中，200 rpm，30 ℃震荡培养2 d。12000 rpm，离心10 min，收集GS2Y的发酵上清液。
（2）发酵上清液的处理：将GS2Y的发酵上清液分为两部分，一部分用0.22 μm的滤器进行过滤除菌（Supernatant组）；另一部分，用金属浴100℃，加热10 min（失活蛋白），12000 rpm，离心10 min，收集上清液，并用0.22μm的滤器进行过滤除菌（Supernatant heat组）。
（3）含毒平板的制备：将固体的PDA培养基加热融化，待培养基冷却至45℃ 左右后，按10％（V/V）的比例加入处理后的GS2Y发酵上清液，以加入10%的LB液体培养基为对照组，制备含毒平板。将PDA平板上培养3d的茶树病原真菌进行打孔，然后将菌块放置到含毒平板上，培养3d后，用螺旋测微尺测量菌落直径的大小。
3、实验结果
含毒平板的实验结果表明伯克霍尔德菌GS2Y的发酵上清液能够显著抑制3种茶树病原真菌的生长，且加热处理对菌株GS2Y产生的抑菌活性成分未见明显影响（图3）。
实施例4 菌株GS2Y发酵上清液XAD-16粗提物对茶树病原真菌菌丝生长的抑制
1、培养基
LB液体培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）和马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）。
2、实验步骤
（1）菌株GS2Y发酵上清液的制备：将菌株GS2Y的单菌落接种到装有3 mL LB液体培养基的试管中，200 rpm，30℃震荡培养2 d。12000 rpm，离心10 min，收集菌株GS2Y的发酵上清液。
（2）大孔吸附树脂XAD-16的活化：将大孔吸附树脂XAD-16用无水乙醇浸泡24 h，用蒸馏水将乙醇冲洗干净；除去残留的蒸馏水，再用三倍1 mol/L的NaOH溶液振荡漂洗4 h；倒出NaOH溶液，加入新的1 mol/L的NaOH溶液浸泡24 h；最后，用蒸馏水冲洗大孔吸附树脂XAD-16至pH值为中性，除去残留的蒸馏水，待用。
（3）菌株GS2Y发酵产物粗提物制备：在菌株GS2Y的发酵上清液中加入2%大孔吸附树脂XAD-16，30℃，200 rpm，吸附12 h，利用砂板漏斗过滤除去上清液，获得吸附了代谢产物的XAD-16树脂。上述获得的树脂，用50 mL的甲醇洗脱一次，然后用25 mL的甲醇再次洗脱，将两次洗脱液合并后，用旋转蒸发仪将甲醇蒸干，用等体积的超纯水溶解代谢产物，得到GS2Y粗提物。
（4）菌株GS2Y粗提物对茶树病原真菌菌丝生长的抑制：将在PDA平板上生长3 d的茶树病原真菌，接种到新鲜的PDB培养基中，然后按质量体积分数（μg/ml）8、16、24、32加入GS2Y粗提物，200 rpm，30℃震荡培养2天，利用显微镜观察茶树病原真菌菌丝的生长情况。
3、实验结果
研究结果表明加入16μg/ml的菌株GS2Y粗提物能够显著抑制Colletotrichum siamense、Diaporthe phaseolorum和Phyllosticta capitalensis等3种茶树病原真菌菌丝的生长，导致菌丝发生肿胀，尤其是在菌丝生长的顶端（图4）。
以上所述的实施例仅是对本发明的实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (4)
1.伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.) GS2Y，其保藏号为：GDMCC No：64147。
2.一种制剂，其特征在于，含有权利要求1的伯克霍尔德菌GS2Y或其培养物。
3.权利要求1所述的伯克霍尔德菌GS2Y或权利要求2所述的制剂在制备抑制炭疽病菌(Colletotrichum siamense)、Diaporthe phaseolorum和/或Phyllosticta capitalensis的药物中的应用。
4.一种茶树病原真菌的防控方法，其特征在于，是利用权利要求1所述的伯克霍尔德菌GS2Y或权利要求2所述的制剂防控茶树病原真菌，所述的病原真菌是炭疽病菌(Colletotrichum siamense)、Diaporthe phaseolorum和/或Phyllosticta capitalensis。
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| 桑树内生拮抗细菌Burkholderia cepacia Lu10-1的分离鉴定及其内生定殖;牟志美等;微生物学报;20080504(第05期);第623-630页 * |
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