CN109486877A - 补料发酵工艺生产雷帕霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种补料发酵工艺生产雷帕霉素的方法，其特征在于，以吸水链霉菌(Streptomyees hygroscopicus)作为发酵菌种，将种子液接入装有液体发酵培养基的发酵罐内，采用补料发酵工艺生产雷帕霉素，发酵罐培养时间为168‑216h；其中，发酵48h开始用氨水控制发酵液pH值为4.65‑5.15，发酵96h开始按每天批补葡萄糖水溶液，直至发酵结束。采用本发明的补料工艺，所需原材料成本低廉，操作简便，结果稳定，HPLC法测定发酵单位可达1000ug/ml以上，适合于规模化生产。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体地说，涉及一种补料发酵工艺生产雷帕霉素的方法。
背景技术
雷帕霉素作为新型大环内酯类的抗排斥药物，是目前世界上最新的强效免疫抑制剂，临床上用于器官移植的抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗。它是吸水链霉菌发酵过程中产生的。
在发酵过程中，影响雷帕霉素生物合成的因素很多，如pH、通风、搅拌转速、温度以及培养基营养成分等。其中pH和碳源对代谢影响较大，需加以有效控制。
发明内容
本发明的目的是提供一种补料发酵工艺生产雷帕霉素的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供一种补料发酵工艺生产雷帕霉素的方法，以吸水链霉菌(Streptomyees hygroscopicus)作为发酵菌种，将种子液接入装有液体发酵培养基的发酵罐内，采用补料发酵工艺生产雷帕霉素，发酵罐培养时间为168-216h(优选188-214h)。
其中，发酵48h开始用氨水(浓度为23％)控制发酵液pH值为4.65-5.15，发酵96h开始按如下A-D每天批补葡萄糖水溶液(浓度为50％)，直至发酵结束；
A、发酵96h，补加的葡萄糖水溶液的体积为初始发酵液体积的5.0-7.0％；
B、发酵120h，补加的葡萄糖水溶液的体积为初始发酵液体积的3.2-5.0％；
C、发酵144h，补加的葡萄糖水溶液的体积为初始发酵液体积的2.4-3.2％；
D、发酵168h，补加的葡萄糖水溶液的体积为初始发酵液体积的1.0-2.4％。
优选地，批补葡萄糖水溶液的具体方法为；
a、发酵96h，补加的葡萄糖水溶液的体积为初始发酵液体积的5.4-6.0％；
b、发酵120h，补加的葡萄糖水溶液的体积为初始发酵液体积的3.6-4.6％；
c、发酵144h，补加的葡萄糖水溶液的体积为初始发酵液体积的2.6-3.0％；
d、发酵168h，补加的葡萄糖水溶液的体积为初始发酵液体积的1.6-2.0％。
前述的方法，用氨水控制发酵液pH值的具体方法为：发酵48-144h，用氨水控制发酵液pH值为4.65-4.90；发酵144-216h，用氨水控制发酵液pH值为4.90-5.15。
优选地，用氨水控制发酵液pH值的具体方法为：发酵48-144h，用氨水控制发酵液pH值为4.70-4.80；发酵144-216h，用氨水控制发酵液pH值为4.95-5.05。
前述的方法，发酵条件为：发酵罐的罐温25.0-29.0℃(优选27.0-28.0℃)，搅拌转速350-550rpm(优选400-500rpm)，罐压为0.04-0.06MPa，通气比1:1。
本发明中使用的液体发酵培养基的配方为：棉籽饼粉25g/L、L-赖氨酸盐酸盐15g/L、葡萄糖80g/L、酵母抽提物2g/L、磷酸氢二钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钠5g/L、甘油10g/L和消泡剂0.5g/L。
前述的方法，将菌浓达16-25％(优选20％)的种子液按8-12％v/v(优选10％v/v)的接种量接入液体发酵培养基中，装液量按50L发酵罐容积计为30L。
在本发明的一个具体实施方式中，采用补料发酵工艺生产雷帕霉素的方法包括以下步骤：
1)菌种活化：采用低温保存甘油管菌种传斜面，于28.0-29.0℃培养120h，然后从培养成熟斜面挖块，大小为1.0cm×2.5cm，接入一级母瓶中，在28.0-29.0℃，摇床转速300rpm的条件下培养48h，得到活化后的菌液；所述一级母瓶为容积750ml的三角烧瓶，装有80ml种子培养基；
2)种子液制备：取步骤1)所得菌液30ml接入种子罐内，在27.0-28.0℃，搅拌转速300-400rpm，罐压为0.04-0.06MPa，通气比1:1的条件下培养48h，得到菌浓20％的种子液；所述种子罐的容积为15L，装有10L种子培养基；
3)发酵培养及补料：取步骤2)所得种子液3L接入发酵罐内，在27.0-28.0℃，搅拌转速400-500rpm，罐压为0.04-0.06MPa，通气比1:1的条件下进行发酵培养，发酵罐培养时间为214h；所述发酵罐的容积为50L，装有30L液体发酵培养基；
发酵过程中，按表1控制发酵体系pH值并进行补料：
表1
| 培养时间，h | 发酵体系pH值 | 补糖比例，％ |
| 0 | / | / |
| 22 | / | / |
| 46 | 4.86 | / |
| 48 | 4.80 | / |
| 54 | / | / |
| 70 | 4.70 | / |
| 94 | 4.78 | / |
| 96 | / | 5.4 |
| 118 | 4.76 | / |
| 120 | / | 4.0 |
| 142 | 4.70 | / |
| 144 | 4.95 | 2.6 |
| 151 | 5.00 | / |
| 166 | 4.95 | / |
| 168 | / | 2.0 |
| 190 | 4.95 | / |
| 196 | / | / |
| 214 | 5.01 | / |
注：补糖比例(％)指葡萄糖水溶液的体积占初始发酵液体积的体积比，葡萄糖水溶液浓度为50％。用浓度为23％的氨水调节发酵体系的pH值。
前述的方法，步骤1)和2)所述种子培养基的配方为：豆粕粉21g/L、L-赖氨酸盐酸盐6g/L、葡萄糖20g/L、酵母抽提物6g/L和消泡剂2g/L。
214h培养结束，放罐，所得发酵液经HPLC法测定，雷帕霉素的发酵单位达1090ug/mL。
本发明中，所述棉籽饼粉中蛋白质含量为50～55％，所述豆粕粉中蛋白质含量为42～45％。所述消泡剂为聚醚类非离子表面活性剂，外观无色透明液体，比重1.0115，羟值55.1-57.8，含量99％。优选美国陶氏聚醚消泡剂DOWFAXTMDF103，含量99％。
本发明中，“通气比”是指每分钟内通入的空气体积与发酵液体积之比。
优选地，用吸水链霉菌(Streptomyees hygroscopicus)CGMCC No.5145作为发酵菌种。有关该菌株可参见ZL201110356249.2。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明将发酵温度控制在25.0-29.0℃。温度过低会导致菌丝生长缓慢，进入代谢滞后，导致前期单位增长缓慢；而温度过高会导致菌丝提前老化，提前自溶，单位降解，发酵效果不理想。
(二)本发明将搅拌转速控制在350-550rpm。搅拌转速过低会导致菌丝呼吸受阻，菌丝形态异常，生长代谢受限；而搅拌转速过高可能导致菌丝受剪切力影响和氧中毒。
(三)本发明将发酵罐培养时间控制在168-216h。培养时间过短，代谢正处于较稳定状态，容易使产量降低，不经济；培养时间过长，发酵单位增长变缓，投入和产出不成比例，且菌丝容易自溶，单位下降，且增加提炼后工段压力和风险。
(四)采用本发明的补料工艺，所需原材料成本低廉，操作简便，结果稳定，测定发酵单位可达1000ug/mL以上，最高可达1090ug/mL。本方法具有安全无污染、高纯度、低成本，适于工业化生产等特点。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
本发明中，“菌浓”是指体积测量法测菌丝浓度的方法。通过测定一定体积培养液中菌丝的量来反映微生物的生长状况。具体方法为：取一定量的待测培养液(一般取10ml)，放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间(一般10min)和转速(一般3000rpm)，离心后倒出上清液，测出上清液体积V，则菌丝浓度为(10-V)/10。
以下实施例使用吸水链霉菌(Streptomyees hygroscopicus)CGMCC No.5145作为发酵菌种。
以下实施例中种子液的制备方法如下：
采用低温保存甘油管菌种传斜面，于28.0-29.0℃培养120h，然后在无菌操作间超净工作台上从培养成熟斜面挖块(大小约1.0cm×2.5cm)，接入一级母瓶(750ml规格三角烧瓶中装量80ml种子培养基)中，将母瓶转移到28.0-29.0℃，摇床转速300rpm条件下培养48h。然后在无菌操作间超净工作台上吸取30ml菌液到预先处理好的种子罐内，在27.0-28.0℃搅拌转速300-400rpm，罐压为0.04-0.06MPa，通气比1:1的条件下培养48h，得到菌浓16-25％的种子液。其中，所述种子罐的容积为15L，装有10L种子培养基。
种子培养基的配方及灭菌条件如下：
种子培养基的配方：豆粕粉21g/L、L-赖氨酸盐酸盐6g/L、葡萄糖20g/L、酵母抽提物6g/L和消泡剂2g/L。
灭菌条件：119.0-123.0℃灭菌30分钟。
以下实施例中发酵培养基的配方及灭菌条件如下：
棉籽饼粉25g/L、L-赖氨酸盐酸盐15g/L、葡萄糖80g/L、酵母抽提物2g/L、磷酸氢二钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钠5g/L、甘油10g/L和消泡剂0.5g/L。
灭菌条件：120.0-123.0℃灭菌30分钟。
以下实施例中使用的消泡剂为美国陶氏聚醚消泡剂DOWFAXTMDF103，含量99％，购自上海康谬贸易有限公司。棉籽饼粉购自河南恩希培养基技术有限公司。豆粕粉购自河南焦作振新生物技术股份有限公司。
以下实施例中用HPLC法测定发酵液中雷帕霉素的含量。
实施例1补料发酵工艺生产雷帕霉素的方法
1、配制液体发酵罐培养基，发酵罐为50L，计料体积为30L，常规条件灭菌，灭菌后体积为27L左右。
2、将制备的菌浓20％的种子液转入50L发酵罐，种子液体积3L。
3、将接种后的液体发酵罐在27.0-28.0℃，罐压0.04-0.06MPa，通气比1:1，转速400-500rpm条件下培养。发酵罐培养时间为214h。
4、补料工艺实施情况及过程数据见表2：
表2补料发酵工艺情况
注：1、补糖比例(％)指葡萄糖水溶液的体积占初始发酵液体积的体积比，葡萄糖水溶液浓度为50％。
2、用浓度为23％的氨水调节发酵体系的pH值。
本实施例得到发酵单位为1090ug/mL的雷帕霉素发酵液。
实施例2补料发酵工艺生产雷帕霉素的方法
1、配制液体发酵罐培养基，发酵罐为50L，计料体积为30L，常规条件灭菌，灭菌后体积为27L左右。
2、将制备的菌浓22％的种子液转入50L发酵罐，种子液体积3L。
3、将接种后的液体发酵罐在27.0-28.0℃，罐压0.04-0.06MPa，通气比1:1，转速400-500rpm条件下培养。发酵罐培养时间为190h。
4、补料工艺实施情况及过程数据见表3：
表3补料发酵工艺情况
注：1、补糖比例(％)指葡萄糖水溶液的体积占初始发酵液体积的体积比，葡萄糖水溶液浓度为50％。
2、用浓度为23％的氨水调节发酵体系的pH值。
本实施例得到发酵单位为1018ug/mL的雷帕霉素发酵液。
对比例1
本对比例提供了一种雷帕霉素常规发酵制备方法，与实施例1-2的主要区别在于以下条件：培养温度范围宽，搅拌转速范围宽，培养时间延长，缺少补料工艺。工艺实施情况及过程数据见表4：
表4工艺实施情况
本对比例得到发酵单位为428ug/mL的雷帕霉素发酵液。
对比例2
本对比例提供了一种雷帕霉素常规发酵制备方法，与实施例1-2的主要区别在于以下条件：培养温度范围宽，搅拌转速范围宽，培养时间延长，缺少补料工艺。工艺实施情况及过程数据见表5：
表5工艺实施情况
本对比例得到发酵单位为345ug/mL的雷帕霉素发酵液。
本发明通过对雷帕霉素的补料发酵生产工艺进行优化，特别是对发酵体系pH值的控制以及补糖时机的协同改进，使得最终发酵液中雷帕霉素的发酵单位大幅提升。本方法具有安全无污染、高纯度、低成本，适于工业化生产，提高经济效益等特点。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.补料发酵工艺生产雷帕霉素的方法，其特征在于，以吸水链霉菌(Streptomyeeshygroscopicus)作为发酵菌种，将种子液接入装有液体发酵培养基的发酵罐内，采用补料发酵工艺生产雷帕霉素，发酵罐培养时间为168-216h；
其中，发酵48h开始用氨水控制发酵液pH值为4.65-5.15，发酵96h开始按如下A-D每天批补葡萄糖水溶液，直至发酵结束；
A、发酵96h，补加的葡萄糖水溶液的体积为初始发酵液体积的5.0-7.0％；
B、发酵120h，补加的葡萄糖水溶液的体积为初始发酵液体积的3.2-5.0％；
C、发酵144h，补加的葡萄糖水溶液的体积为初始发酵液体积的2.4-3.2％；
D、发酵168h，补加的葡萄糖水溶液的体积为初始发酵液体积的1.0-2.4％；
所述葡萄糖水溶液的浓度为50％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵96h开始按如下a-d每天批补葡萄糖水溶液；
a、发酵96h，补加的葡萄糖水溶液的体积为初始发酵液体积的5.4-6.0％；
b、发酵120h，补加的葡萄糖水溶液的体积为初始发酵液体积的3.6-4.6％；
c、发酵144h，补加的葡萄糖水溶液的体积为初始发酵液体积的2.6-3.0％；
d、发酵168h，补加的葡萄糖水溶液的体积为初始发酵液体积的1.6-2.0％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用氨水控制发酵液pH值的具体方法为：
发酵48-144h，用氨水控制发酵液pH值为4.65-4.90；
发酵144-216h，用氨水控制发酵液pH值为4.90-5.15；
所述氨水的浓度为23％。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，用氨水控制发酵液pH值的具体方法为：
发酵48-144h，用氨水控制发酵液pH值为4.70-4.80；
发酵144-216h，用氨水控制发酵液pH值为4.95-5.05。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵条件为：发酵罐的罐温25.0-29.0℃，搅拌转速350-550rpm，罐压为0.04-0.06MPa，通气比1:1；优选地，发酵条件为：27.0-28.0℃，400-500rpm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体发酵培养基的配方为：棉籽饼粉25g/L、L-赖氨酸盐酸盐15g/L、葡萄糖80g/L、酵母抽提物2g/L、磷酸氢二钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钠5g/L、甘油10g/L和消泡剂0.5g/L；
其中，所述棉籽饼粉中蛋白质含量为50～55％；和/或
所述消泡剂为聚醚类非离子表面活性剂，比重1.0115，羟值55.1-57.8，含量99％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将菌浓达16-25％的种子液按8-12％v/v的接种量接入液体发酵培养基中，装液量按50L发酵罐容积计为30L。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)菌种活化：采用低温保存甘油管菌种传斜面，于28.0-29.0℃培养120h，然后从培养成熟斜面挖块，大小为1.0cm×2.5cm，接入一级母瓶中，在28.0-29.0℃，摇床转速300rpm的条件下培养48h，得到活化后的菌液；所述一级母瓶为容积750ml的三角烧瓶，装有80ml种子培养基；
2)种子液制备：取步骤1)所得菌液30ml接入种子罐内，在27.0-28.0℃，搅拌转速300-400rpm，罐压为0.04-0.06MPa，通气比1:1的条件下培养48h，得到菌浓为20％的种子液；所述种子罐的容积为15L，装有10L种子培养基；
3)发酵培养及补料：取步骤2)所得种子液3L接入发酵罐内，在27.0-28.0℃，搅拌转速400-500rpm，罐压为0.04-0.06MPa，通气比1:1的条件下进行发酵培养，发酵罐培养时间为214h；所述发酵罐的容积为50L，装有30L液体发酵培养基；
发酵过程中，按表1控制发酵体系pH值并进行补料：
表1
其中，步骤1)和2)所述种子培养基的配方为：豆粕粉21g/L、L-赖氨酸盐酸盐6g/L、葡萄糖20g/L、酵母抽提物6g/L和消泡剂2g/L；
所述豆粕粉中蛋白质含量为42～45％；和/或
所述消泡剂为聚醚类非离子表面活性剂，比重1.0115，羟值55.1-57.8，含量99％。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190319 |