CN111434775B - 一种发酵制备达托霉素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种发酵制备达托霉素的方法。在发酵培养过程中，其包含添加邻氨基苯甲酸和/或邻氨基苯甲酸盐的步骤。本发明从达托霉素的生物合成机制出发，探究影响其合成的生物分子，通过在在达托霉素发酵培养基中加入邻氨基苯甲酸和/或邻氨基苯甲酸盐后，可以显著提高达托霉素的产量，从而降低工业生产成本。

Description

一种发酵制备达托霉素的方法
技术领域
本发明涉及一种发酵制备达托霉素的方法。
背景技术
色氨酸是达托霉素合成过程中最重要的氨基酸之一，其不仅是环肽合成的第一步，也是合成犬尿氨酸的前体物。而有一种物质与这两种氨基酸都有着莫大的关系，即邻氨基苯甲酸。
与色氨酸相关，邻氨基苯甲酸是色氨酸合成的前体物质。色氨酸由构成芳香族氨基酸的先导物分支酸合成，其生物合成途径包含5个连续的酶促反应。第一步反应包含分支酸和谷氨酰胺转运途径形成邻氨基苯甲酸，谷氨酸和丙酮酸。其催化需要邻氨基苯甲酸合成酶。后邻氨基苯甲酸再经四步反应生成色氨酸。TrpE和trpD基因分别编码邻氨基苯甲酸合成酶I和II(Journal of Biological Chemistry,1973,248(3):901-14)。扩增质粒中trp操纵子能够提高色氨酸的表达水平(Gene,1977,1(2):141)。TrpEfbr突变体(解除了色氨酸终产物反馈抑制)能够在邻氨基苯甲酸存在使色氨酸的产量达到54.6g/L。其中，31.2g/L的色氨酸由邻氨基苯甲酸合成，而23.4g/L的色氨酸来源于葡萄糖(Applied Microbiology&Biotechnology,1993,39(4-5):471-476)。
与犬尿氨酸相关，邻氨基苯甲酸是其代谢产物。在哺乳动物中，色氨酸经代谢生成L-犬尿氨酸；犬尿氨酸被犬尿氨酸单加氧酶催化，生成3-羟基邻氨基苯甲酸和L-丙氨酸(Journal of the American Chemical Society,2005,127(3):840-1)。而在大多数微生物中，犬尿氨酸经犬尿氨酸酶催化生成邻氨基苯甲酸(Chemistry&Biology,2003,10(12):1195-1204)，即犬尿氨酸途径。如在CDA的产生菌S.coelicolor中，当将犬尿氨酸酶kynU敲除后，CDA的产量增加(ApplMicrobiolBlot,2012,94:719-728)；西南大学研究者在2012年确定了玫瑰胞链霉菌中存在犬尿氨酸途径。并且，当将犬尿氨酸酶基因kyn敲除后，达托霉素的产量提高了33％。
2013年，华中科技大学的杨夏露对达托霉素产生菌进行紫外诱变和原生质体融合处理，最终获得菌株产量达到1388mg/L(A21978C发酵条件优化及高产菌株选育[D].华中科技大学,2013)；上海医药工业研究院的吴远杰通过亚硝基胍诱变和二甲基硫抗性筛选，结合癸酸的添加，使菌株产量达到1680mg/L(达托霉素的菌种选育及补料发酵工艺[J].中国医药工业杂志,2013,44(9):864-867)；2015年，浙江大学的杨一恭通过菌种选育，使A21978C在摇瓶中的产量达到6952mg/L，发酵罐上通过对发酵参数的调控，在发酵的208h达托霉素的产量达到2498mg/L(达托霉素的菌种选育及发酵条件的优化研究[D].浙江工业大学,2015)。
目前提高达托霉素产量的方法，一般是向培养基中添加无机盐及氨基酸等，但对其生产的促进作用较小，且大多欠理论依托。现有技术中的达托霉素发酵产量低，不仅增加生产成本，也会大大增加后续分离纯化的难度。然而，目前国内的工业发酵水平还比较弱，达托霉素的价格较贵，对普通患者造成巨大的经济负担。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服目前提高达托霉素产量的方法，一般是向培养基中添加无机盐及氨基酸等，而且达托霉素产量较低的缺陷，提供了一种发酵制备达托霉素的方法。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种发酵制备达托霉素的方法，在发酵培养过程中，其包含添加邻氨基苯甲酸和/或邻氨基苯甲酸盐的步骤。
本发明中，优选，在发酵培养过程中，加入所述邻氨基苯甲酸盐。
本发明中，所述邻氨基苯甲酸盐可为本领域常规的盐类，优选邻氨基苯甲酸钠、邻氨基苯甲酸钾和邻氨基苯甲酸铵中的一种或多种，更优选邻氨基苯甲酸钠。
其中，所述邻氨基苯甲酸钠可通过本领域常规方法制得，例如可将邻氨基苯甲酸甲酯与氢氧化钠水溶液反应生成邻氨基苯甲酸钠。优选，通过下述步骤制得：在50～70℃下，向邻氨基苯甲酸甲酯中滴加氢氧化钠水溶液进行反应完全，得反应液；更佳地通过下述步骤制得：在60℃下，在搅拌条件下，向70mL邻氨基苯甲酸甲酯中滴加3M氢氧化钠水溶液进行反应完全，得反应液。
优选，将所得反应液离心，取上清液，用活性炭吸附后，旋蒸浓缩，重结晶即可。所述浓缩一般将体系浓缩至膏状即可。所述重结晶的操作和条件可为本领域常规的操作和条件，一般向浓缩后的产物中加入过量的无水乙醇后，在0～5℃下静置结晶即可。
检测体系是否反应完全的方法均为本领域常规，一般将所得反应液于干燥的离心管中离心，取上清，稀释至1000倍进行液相检测，通过邻氨基苯甲酸和邻氨基苯甲酸甲酯的含量，确定反应是否完全。
本发明中，所述发酵培养的菌种本领域技术人员知晓一般为玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)。所述玫瑰孢链霉菌可以是任何能主要产生达托霉素的玫瑰孢链霉菌，例如：玫瑰孢链霉菌NRRL11379菌株(在美国农业研究菌种保藏中心保藏)。
本发明中，所述发酵培养过程中，采用的达托霉素发酵培养基在进行接种前，一般用无机酸或有机酸、碱类调节进行pH值调节。所述达托霉素发酵培养基在进行接种前的pH值优选为7.3-7.7，更优选7.5。
本发明中，所述邻氨基苯甲酸和/或邻氨基苯甲酸盐的添加形式可为本领域常规，例如可直接加入固体或者以溶液的形式添加。考虑到添加量的可控性和操作的方便性，优选以溶液的形式添加。
当所述邻氨基苯甲酸和/或邻氨基苯甲酸盐以溶液的形式添加时，所选溶剂可为本领域常规的能够溶解邻氨基苯甲酸和/或邻氨基苯甲酸盐的溶剂，因为发酵过程如引入有机溶剂，可能对菌体产生毒性，优选为水。
当所述邻氨基苯甲酸和/或邻氨基苯甲酸盐以溶液的形式添加时，所述溶液中，所述邻氨基苯甲酸和/或邻氨基苯甲酸盐的浓度可为本领域常规，优选为0.05～2g/mL，更优选0.1g/mL。
当所述邻氨基苯甲酸和/或邻氨基苯甲酸盐以溶液的形式添加时，所述溶液的可为一次性加入，也可采用流加模式。当所述溶液采用流加模式时，所述溶液的流速可为本领域常规，优选为0.05～0.1g/L/h，例如0.06g/L/h或0.08g/L/h。
本发明中，所述邻氨基苯甲酸和/或邻氨基苯甲酸盐在添加前，优选需进行灭菌处理。所述灭菌条件可为本领域常规，通常采用121℃灭菌20min，高压蒸汽灭菌(例如0.12MPa)。
本发明中，在所述邻氨基苯甲酸和/或邻氨基苯甲酸盐的添加时机可为本领域常规，优选在所述发酵培养的0h、24h、48h、72h或96h加入，更优选在所述发酵培养的24h加入。
本发明中，所述邻氨基苯甲酸和/或邻氨基苯甲酸盐的添加量可为本领域常规，当采用摇瓶发酵培养时，在发酵液中，邻氨基苯甲酸和/或邻氨基苯甲酸盐的浓度优选大于0小于1.5g/L，更优选为大于0小于等于1.2g/L，例如0.6g/L或者0.9g/L；当采用发酵罐培养时，在发酵液中，发酵罐中邻氨基苯甲酸和/或邻氨基苯甲酸盐的浓度优选大于0小于0.667g/L，更优选大于0小于等于0.53g/L，例如0.333g/L或者0.4g/L。
本发明中，优选将玫瑰胞链霉菌(Streptomyces roseosporus)接种于达托霉素发酵培养基中培养生产达托霉素，其中，在发酵培养过程中添加邻氨基苯甲酸钠水溶液。
其中，所述达托霉素发酵培养基发酵培养玫瑰胞链霉菌生产达托霉素时，使用常规的方法即可，即将玫瑰胞链霉菌接种于前述培养基，然后进行常规发酵即可。
优选，所述常规发酵包括下述步骤：将玫瑰胞链霉菌种子液按质量比5～45％的接种量接种于如前所述的达托霉素发酵培养基，然后进行摇瓶发酵培养或者发酵罐发酵培养；
当进行摇瓶发酵培养时，所述玫瑰胞链霉菌种子液的接种量优选为5～15％，例如10％，当进行所述发酵罐发酵培养时，所述玫瑰胞链霉菌种子液的接种量优选为15～45％，例如40％。
其中，所述摇瓶发酵培养的操作和条件可为本领域常规的操作和条件，优选为：接种于摇瓶发酵培养基后，在28-32℃、转速200-280rpm的摇床上培养5-6天，更优选接种于摇瓶发酵培养基后，在30℃、转速240rpm的摇床上培养5天。其中，所述摇瓶发酵培养基可为本领域常规，优选含有麦芽糊精7.2g/100mL，糖蜜1.1g/100mL，葡萄糖0.72g/100mL，榴花酵母粉1.65g/100mL，硫酸亚铁铵0.086g/100mL。
其中，所述发酵罐培养的操作和条件可为本领域常规的操作和条件，优选为：先接种于一级种子罐培养基进行一级种子罐发酵培养，再接种于二级发酵罐培养基进行二级发酵罐发酵培养。
所述一级种子罐发酵培养条件可为本领域常规。所述一级种子罐发酵培养中通气量优选为0.9～1.0VVM，更优选为1.0VVM。
所述一级种子罐发酵培养中，所述一级种子罐发酵培养优选为28～32℃培养45～51h，更优选为30℃培养48h。所述一级种子罐中，罐压优选为0.04～0.06MPa，更优选为0.05MPa。所述一级种子罐培养基可为本领域常规，优选为麦芽糊精2.5g/100mL，蔗糖糖蜜1.0g/100mL，榴花酵母粉0.4g/100mL，黄豆粉1.2g/100mL，硫酸亚铁铵0.086g/100mL，硝酸钾0.1g/100mL，泡敌0.03g/100mL，硅油0.02g/100mL，pH值7.0。
所述一级种子罐发酵培养中，搅拌条件优选0～15h搅拌速度为240～260rpm(例如250rpm)，15～24h搅拌速度为280～320rpm(例如300rpm)，24～30h搅拌速度为330～370rpm(例如350rpm)，30～48h搅拌速度为380～420rpm(例如400rpm)。
所述二级发酵罐发酵培养条件可为本领域常规。所述二级发酵罐发酵培养中，优选接种量为40％，pH值为6.3。所述二级发酵罐发酵培养中，优选在发酵7～9h(例如8h)后流加癸酸与油酸甲酯混合液，22～26h(例如24h)后补加稀料，76～80h(例如78h)后流加浓度为10％的麦芽糊精，28～32℃发酵166～170h(例如30℃发酵168h)。其中，癸酸与油酸甲酯混合液中，所述癸酸与所述油酸甲酯的质量比优选为1：2。所述癸酸与油酸甲酯混合液的滴加速度优选为6～8g/L，更优选为7g/h。所述稀料的加入量优选为：400mL/次，2次/天。所述稀料的配方优选为：榴花酵母粉0.4g/100mL，黄豆粉1.2g/100mL，硫酸亚铁铵0.086g/100mL，硫酸铜0.01g/100mL，谷氨酸钠0.01g/100mL，泡敌0.05g/100mL，硅油0.03g/100mL，pH值7.5。
所述二级发酵罐发酵培养中，所述二级发酵罐培养基优选为：麦芽糊精2.5g/100mL，蔗糖糖蜜1.0g/100mL，榴花酵母粉0.4g/100mL，黄豆粉1.2g/100mL，硫酸亚铁铵0.086g/100mL，硝酸钾0.3g/100mL，硫酸铜0.005g/100mL，谷氨酸钠0.01g/100mL，泡敌0.03g/100mL，硅油0.02g/100mL，pH值7.0。
其中，培养生产达托霉素之后优选还包括收集达托霉素的步骤，所述收集达托霉素采用的方法为将发酵液离心取上清，向上清中加入4倍体积的甲醇，混匀，再次离心后取上清即得。
本领域技术人员知晓，在用所述玫瑰胞链霉菌种子液发酵培养生产达托霉素之前，按照本领域常规将玫瑰胞链霉菌菌种进行菌种活化，一般包括如下步骤：
(1)将玫瑰胞链霉菌接种于斜面培养基上进行活化；
(2)将活化得到的菌落接种于种子培养基培养得到种子液。
优选地，所述菌种活化包括如下步骤：
(1)将玫瑰胞链霉菌接种于斜面培养基上进行活化；
(2)将活化得到的菌落接种于种子培养基，于25-30℃、转速200-280rpm的摇床上培养40-46h得到种子液，所述种子培养基包括2.0-4.0g/100mL TSB胰蛋白胨大豆肉汤，3.0-4.0g/100mL麦芽糊精和去离子水，所述种子培养基灭菌前的pH为6.8～7.0。
更优选地，所述菌种活化包括如下步骤：
(1)将玫瑰胞链霉菌接种于斜面培养基上于30℃培养箱中培养进行活化，所述斜面培养基包括酵母浸粉0.4g/100mL、麦芽浸粉1g/100mL、葡萄糖0.4g/100mL和琼脂粉1.5g/100mL，所述斜面培养基灭菌前pH值为7.2～7.4；
(2)将活化得到的菌落接种于种子培养基，于28℃、转速240rpm的摇床上培养40～46小时得到种子液，所述种子培养基包括TSB胰蛋白胨大豆肉汤3g/100mL，麦芽糊精3.5g/100mL和去离子水，所述种子培养基灭菌前pH值为6.8～7.0。
其中，步骤(1)中所述活化的程度优选为培养基基体变至玫瑰色。
其中，步骤(2)中所述接种的量优选为0.8cm×1.5cm大小的步骤(1)中活化后的斜面培养基。
其中，步骤(2)中所述种子液优选镜检菌丝成团状，向四周发散，菌丝较长，无杂菌，pH值7.2-7.6。
本文中，所述摇瓶发酵培养基、所述一级种子罐培养基、所述稀料配方、所述二级发酵罐培养基、所述斜面培养基、所述种子发酵培养基和所述达托霉素发酵培养基配制完成后均需要灭菌处理，通常采用121℃灭菌20～30min，高压蒸汽灭菌。
本发明中，A21978C是对革兰氏阳性菌有抑制作用的脂肽类抗生素，包括达托霉素(A21978C0)及其衍生物A21978C1～C5。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明从达托霉素的生物合成机制出发，探究影响其合成的生物分子，通过在在达托霉素发酵培养基中加入邻氨基苯甲酸后，可以显著提高达托霉素的产量，从而降低工业生产成本。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，所使用的玫瑰胞链霉菌为购自Agricultural Research ServiceCulture Collection(美国农业研究菌种保藏中心，ARS)，编号为NRRL11379的玫瑰胞链霉菌菌株。
下述实施例中，所使用仪器的型号和厂家如下表1所示。
表1
Figure BDA0001943159950000081
下述实施例中，所使用试剂的规格和厂家如下表2所示。
表2
Figure BDA0001943159950000082
Figure BDA0001943159950000091
下述实施例中，采用高效液相测达托霉素发酵单位，具体方法为：
HPLC检测方法：采用Agilent 1200一体化液相色谱仪，色谱条件：色谱柱：AgilentEclipse Plus C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A为3mM磷酸二氢钾(pH值2.60)，流动相B为乙腈；柱温：30℃；检测波长：223nm；进样量：20μL；流速：1.0ml·min-1；具体洗脱条件如表3所示：
表3
Figure BDA0001943159950000092
此条件下达托霉素主峰的保留时间为9.5min左右。
下述实施例中，邻氨基苯甲酸钠的制备方法如下：邻氨基苯甲酸甲酯与氢氧化钠水溶液反应生成邻氨基苯甲酸钠与甲醇。具体操作方法：
取邻氨基苯甲酸甲酯70mL于200mL锥形瓶中，并将锥形瓶置于磁力搅拌器上，转速，温度60℃，缓慢滴加3M的氢氧化钠水溶液，待溶液反应后下层邻氨基苯甲酸甲几乎消耗完毕，此时pH应在9左右。取干燥的离心管将反应液离心，取上清，稀释到1000倍进行液相检测，通过邻氨基苯甲酸和邻氨基苯甲酸甲酯的含量，确定反应是否完全。反应完全后，将上清用活性炭吸附，后收集到蒸馏瓶中，旋蒸。待浓缩至膏状，向内加入过量无水乙醇，放到4℃冰箱中使其结晶，获得邻氨基苯甲酸钠结晶。最后将邻氨基苯甲酸钠配制成0.1g/mL的水溶液，121℃，20min，高压蒸汽灭菌后备用。
实施例1～5
摇瓶中添加邻氨基苯甲酸钠
(1)菌种活化：
在无菌条件下，用已灭菌的接种针将保存有玫瑰孢链霉菌的冻干管中接种到装有斜面培养基的茄子瓶中培养；斜面培养基包括酵母浸粉0.4g/100mL、麦芽浸粉1g/100mL、葡萄糖0.4g/100mL和琼脂粉1.5g/100mL，斜面培养基灭菌前pH值为7.2-7.4；斜面培养第三天可见表面玫瑰色菌体，第四天或者第五天，颜色加深，并看到少量灰白色孢子生成，继续培养直到可以看到培养基表面产生大量灰白色孢子，培养基基体本身由于玫瑰孢链霉菌色素的产生变成玫瑰色。此斜面可进行传代或者接种使用。
(2)摇瓶种子培养：
在无菌条件下，用灭菌接种铲轻轻划破长有孢子的斜面培养基，挖取尽量薄的0.8cm×1.5cm左右的长满孢子的斜面培养基，接种于灭好菌的80mL/500mL(“80mL/500mL”是指的500mL的摇瓶装量是80mL)摇瓶种子培养基中；于28℃、转速240rpm的摇床上培养45小时，得摇瓶种子液；摇瓶中培养物颜色由黄色澄清透明变成黄色浑浊物，摇之，有流动感，粘度较大，贴壁均匀滑下。种子液镜检菌丝成团状，向四周发散，菌丝较长，无杂菌，pH值为7.2-7.6；
摇瓶种子培养基：TSB胰蛋白胨大豆肉汤3g/100mL，麦芽糊精3.5g/100mL，去离子水配制，种子培养基的pH值为6.8～7.0；
(3)摇床发酵培养：
根据摇瓶发酵培养基配方，配制发酵培养基，250mL锥形瓶装量35mL，灭菌。无菌条件接种3.5mL(种子液的接种量为10％)步骤(2)制得的摇瓶种子液，置于摇床30℃，240rpm，发酵培养5天，得发酵液。
摇瓶发酵培养基：麦芽糊精7.2g/100mL，糖蜜1.1g/100mL，葡萄糖0.72g/100mL，榴花酵母粉1.65g/100mL，硫酸亚铁铵0.086g/100mL，pH调至7.5。
在发酵培养的0h、24h、48h、72h、96h(依次为实施例1～5)分别添加邻氨基苯甲酸钠水溶液(浓度0.1g/mL)，用量为0.2mL，分别得发酵液。发酵液中，邻氨基苯甲酸钠的浓度为0.6g/L。
(4)收集达托霉素：取1mL发酵液12000rpm离心，取上清0.2mL加0.8mL甲醇，混匀，离心，取上清进行高效液相检测A21978C类物质总面积。
设置对照组不添加(该对照组是指的不添加邻氨基苯甲酸钠，即为对比例1)。
当在发酵的第24h添加邻氨基苯甲酸钠的促进作用最大，发酵培养5天时A21978C总峰面积达21360mV*s。较对比例1的总峰面积18150mV*s提高了17.6％。
实施例6
摇瓶中添加邻氨基苯甲酸钠
本实施例除下述条件外，其它参数和条件均与实施例1相同：
在步骤(3)摇瓶发酵培养过程中，在摇瓶发酵的24h向摇瓶添加浓度为0.1g/mL邻氨基苯甲酸钠0.3mL。发酵液中，邻氨基苯甲酸钠的浓度为0.9g/L。
设置对照组不添加(该对照组是指的不添加邻氨基苯甲酸钠，即为对比例1)。
在发酵培养5天时A21978C总峰面积达22660mV*s，较对比例1的总峰面积18150mV*s提高了22.1％。
实施例7
摇瓶中添加邻氨基苯甲酸钠
本发明除下述条件外，其它参数和条件均与实施例1相同：
在步骤(3)摇瓶发酵培养过程中，在摇瓶发酵的24h向摇瓶添加浓度为0.1g/mL邻氨基苯甲酸钠0.4mL。发酵液中，邻氨基苯甲酸钠的浓度为1.2g/L。设置对照组不添加(该对照组是指的不添加邻氨基苯甲酸钠，即为对比例1)。
在发酵培养5天时A21978C总峰面积达20340mV*s，较对比例1的总峰面积18150mV*s提高了7.9％。
实施例8
发酵罐中流加邻氨基苯甲酸钠
(1)菌种活化：同实施例1的步骤(1)；
(2)摇瓶种子培养：同实施例1的步骤(2)；
(3)发酵罐发酵培养：
将摇瓶种子液80mL转接到25L一级种子罐中，通气量1.0(VVM)；搅拌转速0～15h250rpm，15～24h 300rpm，24～30h 350rpm，30～48h 400rpm；罐压0.05MPa。30℃培养48h后，转接到二级发酵罐中，接种量为40％；使用氨水控制pH在6.3；发酵8h后流加癸酸与油酸甲酯混合液(癸酸：油酸甲酯＝1：2)7g/h，24h后开始补加稀料，400mL/次，2次/天；78h后流加浓度为10％的麦芽糊精50g/h；30℃发酵168h。
一级种子罐培养基(g/100mL)：麦芽糊精2.5，蔗糖糖蜜1.0，榴花酵母粉0.4，黄豆粉1.2，硫酸亚铁铵0.086，硝酸钾0.1，泡敌0.03，硅油0.02，pH 7.0，计料15L，消后15L，121℃蒸汽灭菌30min。
二级发酵罐培养基(g/100mL)：麦芽糊精2.5，蔗糖糖蜜1.0，榴花酵母粉0.4，黄豆粉1.2，硫酸亚铁铵0.086，硝酸钾0.3，硫酸铜0.005，谷氨酸钠0.01，泡敌0.03，硅油0.02，pH值7.0，计料7L，消后7L，121℃蒸汽灭菌30min。
二级发酵罐稀料配方(g/100mL)：榴花酵母粉0.4，黄豆粉1.2，硫酸亚铁铵0.086，硫酸铜0.01，谷氨酸钠0.01，泡敌0.05，硅油0.03，pH值7.5，121℃蒸汽灭菌30min。
在发酵罐中，采取流加模式，在二级发酵罐进行发酵24h后开始流加邻氨基苯甲酸钠溶液(浓度为0.1g/mL)，速度为0.05g/L/h，邻氨基苯甲酸钠溶液总流加量为50g，并设置不添加的对照组(该对照组为对比例2)。发酵液中，邻氨基苯甲酸钠的浓度为0.333g/L。
本实施例在发酵192h(从二级发酵罐开始发酵计时)，达托霉素发酵单位(本发明中“发酵单位”是指发酵液中达托霉素的含量)，较对比例2提高了5.2％，在发酵192h(从二级发酵罐开始发酵计时)达到2938mg/L(采用高效液相方法检测，方法如前所述)。
实施例9
发酵罐中流加邻氨基苯甲酸钠
本实施例除下述条件外，其它参数和条件均与实施例8相同：
在发酵罐中，采取流加模式，在二级发酵罐进行发酵24h后开始流加邻氨基苯甲酸钠溶液，速度为0.06g/L/h，邻氨基苯甲酸钠溶液总流加量为60g，并设置不添加的对比例2。发酵液中，邻氨基苯甲酸钠的浓度为0.4g/L。
本实施例的达托霉素发酵单位，较对比例2提高了10.8％，在发酵192h达到3095mg/L。
实施例10
发酵罐中流加邻氨基苯甲酸钠
本实施例除下述条件外，其它参数和条件均与实施例8相同：
在发酵罐中，采取流加模式，在二级发酵罐进行发酵24h后开始流加邻氨基苯甲酸钠溶液，速度为0.08g/L/h，邻氨基苯甲酸钠溶液总流加量为80g，并设置不添加的对比例2。发酵液中，邻氨基苯甲酸钠的浓度为0.533g/L。
本实施例的达托霉素发酵单位，较对比例2提高了23％，在发酵192h达到3432mg/L。
对比例1
本对比例中，步骤(3)中不添加邻氨基苯甲酸钠，其它操作均与实施例1相同。发酵培养5天时A21978C总峰面积达18150mV*s。
对比例2
本对比例中，步骤(3)发酵罐罐发酵培养过程中不添加邻氨基苯甲酸钠，其它操作均与实施例8相同。发酵192h后，本对比例达托霉素发酵单位为2792mg/L。
对比例3发酵罐中流加色氨酸
本对比例，除下述操作外均与实施例8相同。
步骤(3)中，在发酵罐中，采取流加模式，在二级发酵罐进行发酵24h后，流加色氨酸，速度为0.067g/L/h，总添加量为6.7g，并设置不添加的对比例2。在发酵罐上添加色氨酸的发酵单位，较对比例2提高了2.1％，在发酵的192h，发酵单位达到2850mg/L。但比添加等摩尔的邻氨基苯甲酸钠发酵单位低。而且在发酵的过程中，色氨酸的添加导致菌浓下降，且发酵罐内泡沫较多，难以控制。
对比例4发酵罐上流加色氨酸
本对比例，除下述操作外均与实施例8相同。
步骤(3)中，在发酵罐中，采取流加模式，在二级发酵罐进行发酵24h后，流加色氨酸的速度为0.108g/L/h，总添加量为10.8g，并设置不添加的对比例2。在发酵罐上添加色氨酸的发酵单位，较对比例2提高了8％，在发酵的192h，发酵单位达到3012mg/L，但比添加等摩尔的邻氨基苯甲酸钠发酵单位低。而且在发酵的过程中，色氨酸的添加导致菌浓下降，且发酵罐内泡沫较多，难以控制。
对比例5发酵罐上流加色氨酸
本对比例，除下述操作外均与实施例8相同。
步骤(3)中，在二级发酵罐进行发酵24h后，流加色氨酸的速度为0.135g/L/h，总添加量为13.5g，并设置不添加的对比例2。在发酵罐上添加色氨酸的发酵单位，较对比例2提高了6.3％，在发酵的192h，发酵单位达到2966mg/L。但比添加等摩尔的邻氨基苯甲酸钠发酵单位低。而且在发酵的过程中，色氨酸的添加导致菌浓下降，且发酵罐内泡沫较多，难以控制。
对比例6
摇瓶中添加邻氨基苯甲酸钠
本发明除下述条件外，其它参数和条件均与实施例1相同：
在步骤(3)摇瓶发酵培养过程中，在摇瓶发酵的24h向摇瓶添加浓度为0.1g/mL邻氨基苯甲酸钠0.5mL。发酵液中，邻氨基苯甲酸钠的浓度为1.5g/L。设置对照组不添加(该对照组是指的不添加邻氨基苯甲酸钠，即为对比例1)。
在发酵培养5天时A21978C总峰面积达17500mV*s，较对比例1的总峰面积18150mV*s降低了4.8％。
对比例7
发酵罐中流加邻氨基苯甲酸钠
本实施例除下述条件外，其它参数和条件均与实施例8相同：
在发酵罐中，采取流加模式，在二级发酵罐进行发酵24h后开始流加邻氨基苯甲酸钠溶液，速度为0.1g/L/h，邻氨基苯甲酸钠溶液总流加量为100g，并设置不添加的对比例2。发酵液中，邻氨基苯甲酸钠的浓度为0.667g/L。本实施例的达托霉素发酵单位，较对比例2降低了9.4％，在发酵192h达到2530mg/L。
效果实施例1
采用高效液相测检测实施例2、6、7，对比例1、对比例6发酵单位，结果如表4所示。其中，对比例1为不添加邻氨基苯甲酸钠水溶液的对照组。
表4
Figure BDA0001943159950000161
采用高效液相检测实施例8～10，对比例2、对比例7的发酵单位，结果如表5所示。其中，对比例2为不添加邻氨基苯甲酸钠水溶液。
表5
Figure BDA0001943159950000162

Claims (24)

1.一种发酵制备达托霉素的方法，其特征在于，在发酵培养过程中，加入邻氨基苯甲酸钠；
当采用摇瓶发酵培养时，在发酵液中，所述邻氨基苯甲酸钠的浓度为0.6g/L～1.2g/L；
当采用发酵罐培养时，在发酵液中，发酵罐中所述邻氨基苯甲酸钠的浓度为0.333g/L～0.533g/L；
和，发酵培养的菌种为玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)，所述玫瑰孢链霉菌为玫瑰孢链霉菌NRRL11379菌株；
和，所述发酵培养过程中，采用的达托霉素发酵培养基在进行接种前的pH值为7.3-7.7。
2.根据权利要求1所述的发酵制备达托霉素的方法，其特征在于，所述邻氨基苯甲酸钠通过下述步骤制得：将邻氨基苯甲酸甲酯与氢氧化钠水溶液反应生成邻氨基苯甲酸钠。
3.根据权利要求2所述的发酵制备达托霉素的方法，其特征在于，所述邻氨基苯甲酸钠通过下述步骤制得：在50～70℃下，向邻氨基苯甲酸甲酯中滴加氢氧化钠水溶液进行反应完全，得反应液。
4.根据权利要求3所述的发酵制备达托霉素的方法，其特征在于，所述邻氨基苯甲酸钠通过下述步骤制得：在60℃下，在搅拌条件下，向70mL邻氨基苯甲酸甲酯中滴加3M氢氧化钠水溶液进行反应完全，得反应液。
5.根据权利要求3或4所述的发酵制备达托霉素的方法，其特征在于，将所得反应液离心，取上清液，用活性炭吸附后，旋蒸浓缩，重结晶即可。
6.根据权利要求1所述的发酵制备达托霉素的方法，其特征在于，所述发酵培养过程中，采用的达托霉素发酵培养基在进行接种前的pH值为7.5。
7.如权利要求1所述的发酵制备达托霉素的方法，其特征在于，所述邻氨基苯甲酸钠以溶液的形式添加；
当所述邻氨基苯甲酸钠以溶液的形式添加时，所选溶剂为水；
当所述邻氨基苯甲酸钠以溶液的形式添加时，溶液中，所述邻氨基苯甲酸钠的浓度为0.05～2g/mL； 当所述邻氨基苯甲酸钠采用流加模式添加时，溶液的流速为0.05～0.08g/L/h和/或，所述邻氨基苯甲酸钠在添加前，需进行灭菌处理。
8.如权利要求1所述的发酵制备达托霉素的方法，其特征在于，所述邻氨基苯甲酸钠在所述发酵培养的0h、24h、48h、72h或96h加入。
9.如权利要求8所述的发酵制备达托霉素的方法，其特征在于，所述邻氨基苯甲酸钠在所述发酵培养的24h加入。
10.如权利要求1所述的发酵制备达托霉素的方法，其特征在于，将玫瑰胞链霉菌(Streptomyces roseosporus)接种于达托霉素发酵培养基中培养生产达托霉素，其中，在发酵培养过程中添加邻氨基苯甲酸钠水溶液；
将所述玫瑰胞链霉菌接种于所述达托霉素发酵培养基，然后进行常规发酵即可。
11.如权利要求10所述的发酵制备达托霉素的方法，其特征在于，所述常规发酵包括下述步骤：将玫瑰胞链霉菌种子液按质量比5～45％的接种量接种于如前所述的达托霉素发酵培养基，然后进行摇瓶发酵培养或者发酵罐发酵培养；当进行摇瓶发酵培养时，所述玫瑰胞链霉菌种子液的接种量为5～15％，当进行所述发酵罐发酵培养时，所述玫瑰胞链霉菌种子液的接种量为15～45％。
12.如权利要求11所述的发酵制备达托霉素的方法，其特征在于，当进行摇瓶发酵培养时，所述玫瑰胞链霉菌种子液的接种量为10％。
13.如权利要求11所述的发酵制备达托霉素的方法，其特征在于，当进行所述发酵罐发酵培养时，所述玫瑰胞链霉菌种子液的接种量为40％。
14.如权利要求10所述的发酵制备达托霉素的方法，其特征在于，所述摇瓶发酵培养的操作为：接种于摇瓶发酵培养基后，在28-32℃、转速200-280rpm的摇床上培养5-6天；其中，所述摇瓶发酵培养基含有麦芽糊精7.2g/100mL，糖蜜1.1g/100mL，葡萄糖0.72g/100mL，榴花酵母粉1.65g/100mL，硫酸亚铁铵0.086g/100mL；
和/或，所述发酵罐培养的操作为：先接种于一级种子罐培养基进行一级种子罐发酵培养，再接种于二级发酵罐培养基进行二级发酵罐发酵培养。
15.如权利要求14所述的发酵制备达托霉素的方法，其特征在于，所述摇瓶发酵培养的操作为：接种于摇瓶发酵培养基后，在30℃、转速240rpm的摇床上培养5天。
16.如权利要求14所述的发酵制备达托霉素的方法，其特征在于，所述一级种子罐发酵培养中通气量为0.9～1.0VVM；
和/或，所述一级种子罐发酵培养中，所述一级种子罐发酵培养为28～32℃培养45～51h；
和/或，所述一级种子罐中，罐压为0.04～0.06MPa；
和/或，所述一级种子罐培养基为麦芽糊精2.5g/100mL，蔗糖糖蜜1.0g/100mL，榴花酵母粉0.4g/100mL，黄豆粉1.2g/100mL，硫酸亚铁铵0.086g/100mL，硝酸钾0.1g/100mL，泡敌0.03g/100mL，硅油0.02g/100mL，pH值7.0；
和/或，所述一级种子罐发酵培养中，搅拌条件0～15h搅拌速度为240～260rpm，15～24h搅拌速度为280～320rpm，24～30h搅拌速度为330～370rpm，30～48h搅拌速度为380～420rpm；
和/或，所述二级发酵罐发酵培养中，接种量为40％，pH值为6.3；
和/或，所述二级发酵罐发酵培养中，在发酵7～9h后流加癸酸与油酸甲酯混合液，22～26h后补加稀料，76～80h后流加浓度为10％的麦芽糊精，28～32℃发酵166～170h；
和/或，所述二级发酵罐发酵培养中，所述二级发酵罐培养基为：麦芽糊精2.5g/100mL，蔗糖糖蜜1.0g/100mL，榴花酵母粉0.4g/100mL，黄豆粉1.2g/100mL，硫酸亚铁铵0.086g/100mL，硝酸钾0.3g/100mL，硫酸铜0.005g/100mL，谷氨酸钠0.01g/100mL，泡敌0.03g/100mL，硅油0.02g/100mL，pH值7.0。
17.如权利要求16所述的发酵制备达托霉素的方法，其特征在于，癸酸与油酸甲酯混合液中，所述癸酸与所述油酸甲酯的质量比为1：2；所述癸酸与油酸甲酯混合液的滴加速度为6～8g/L；所述稀料的加入量为：400mL/次，2次/天；所述稀料的配方为：榴花酵母粉0.4g/100mL，黄豆粉1.2g/100mL，硫酸亚铁铵0.086g/100mL，硫酸铜0.01g/100mL，谷氨酸钠0.01g/100mL，泡敌0.05g/100mL，硅油0.03g/100mL，pH值7.5。
18.如权利要求16所述的发酵制备达托霉素的方法，其特征在于，所述一级种子罐发酵培养中通气量为1.0VVM。
19.如权利要求16所述的发酵制备达托霉素的方法，其特征在于，所述一级种子罐发酵培养中，所述一级种子罐发酵培养为30℃培养48h。
20.如权利要求16所述的发酵制备达托霉素的方法，其特征在于，所述一级种子罐中，罐压为0.05Mpa。
21.如权利要求10所述的发酵制备达托霉素的方法，其特征在于，培养生产达托霉素之后还包括收集达托霉素的步骤，所述收集达托霉素采用的方法为将发酵液离心取上清，向上清中加入4倍体积的甲醇，混匀，再次离心后取上清即得。
22.如权利要求10所述的发酵制备达托霉素的方法，其特征在于，在用所述玫瑰胞链霉菌种子液发酵培养生产达托霉素之前，按照本领域常规将玫瑰胞链霉菌菌种进行菌种活化，包括如下步骤：
(1)将玫瑰胞链霉菌接种于斜面培养基上进行活化；
(2)将活化得到的菌落接种于种子培养基培养得到种子液。
23.如权利要求22所述的发酵制备达托霉素的方法，其特征在于，所述菌种活化包括如下步骤：
(1)将玫瑰胞链霉菌接种于斜面培养基上进行活化；
(2)将活化得到的菌落接种于种子培养基，于25-30℃、转速200-280rpm的摇床上培养40-46h得到种子液，所述种子培养基包括2.0-4.0g/100mL TSB胰蛋白胨大豆肉汤，3.0-4.0g/100mL麦芽糊精和去离子水，所述种子培养基灭菌前的pH为6.8～7.0。
24.如权利要求23所述的发酵制备达托霉素的方法，其特征在于，所述菌种活化包括如下步骤：
(1)将玫瑰胞链霉菌接种于斜面培养基上于30℃培养箱中培养进行活化，所述斜面培养基包括酵母浸粉0.4g/100mL、麦芽浸粉1g/100mL、葡萄糖0.4g/100mL和琼脂粉1.5g/100mL，所述斜面培养基灭菌前pH值为7.2～7.4；
(2)将活化得到的菌落接种于种子培养基，于28℃、转速240rpm的摇床上培养40～46小时得到种子液，所述种子培养基包括TSB胰蛋白胨大豆肉汤3g/100mL，麦芽糊精3.5g/100mL和去离子水，所述种子培养基灭菌前pH值为6.8～7.0。
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