CN102181503A - 一种发酵生产l-苯丙氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一种发酵生产L-苯丙氨酸的方法，属于生物工程技术领域，具体涉及温度诱导强化丙酮酸激酶基因pykA缺失型大肠杆菌发酵生产L-苯丙氨酸。本发明在丙酮酸激酶基因pykA缺失型大肠杆菌发酵生产L-Phe过程中，采用分阶段温度诱导策略，即13.5-20h采用诱导温度40℃，20-37h降低温度至38℃，38h以后采用36℃进行诱导。本发明的优点在于：显著改善了丙酮酸激酶基因pykA缺失型大肠杆菌生长和生产L-Phe的能力，提高了发酵过程中质粒的稳定性，改善了在发酵后期关键酶活下降的趋势，提高了L-苯丙氨酸的产量、生产强度和对葡萄糖底物的得率系数。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵生产L-苯丙氨酸的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
苯丙氨酸(Phenylalanine)，即D，L-α-氨基-β-苯基丙酸，有外消旋DL-型、L-型和D-型三种，其中具有生物活性的光学异构体为L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine，L-Phe)(图1)。L-Phe作为人和动物体内不能合成的8种必需氨基酸之一，是高甜度低热量的新型甜味剂阿斯巴甜的重要组成部分，在食品、饲料添加剂以及医药等领域具有广泛的应用。
大肠杆菌(E.coli)作为生产L-Phe的主要菌株，其胞内L-Phe生物合成途径如图2所示。其中，由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和4-磷酸赤藓糖(E4P)在3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶(DAHP synthases，DS)的催化下缩合生成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)的反应为第一个限速反应。第二和第三个限速反应分别为由分支酸在分支酸变位酶(Chorismate mutase，CM)的作用下转变为预苯酸，继而在预苯酸脱水酶(Prephenate dehydratase，PDT)的作用下脱水、脱羧后形成PPA。PEP和E4P作为两个重要的限制性底物，它们的供应量决定着中心代谢流的碳源能否有效地导向DAHP的合成，从而为芳香族氨基酸的合成提供充足的前体物质。而PEP作为一个多酶竞争性底物，PTS消耗至少50％的PEP，丙酮酸激酶(Pyruvate kinase，PYK)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase，PPC)利用约32％的PEP，只有3％的PEP用于芳香族氨基酸的合成。因此，通过敲除PYK可有效提高DAHP的产率系数，从而调节PEP在芳香族氨基酸合成中的的供应量，提高L-Phe的产量。
温度作为发酵过程的重要因素之一，影响与生长代谢相关酶类的催化反应速率及稳定性，从而调节微生物的生长和代谢产物的合成。采用适宜的培养温度有望改善PYK突变菌株生产L-Phe的能力。另外，由于生产L-Phe的质粒pAP-B03是一个温度诱导型质粒，诱导温度与参与L-Phe生物合成的关键酶DS和CM-PDT的表达有着密切的联系，而同时，关键酶的活性在不同的温度下表现出不同的稳定性，即温度既影响关键酶的表达，又影响着酶的活力和稳定性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种发酵生产L-苯丙氨酸的方法。
本发明技术方案为：以丙酮酸激酶基因pykA缺失型的大肠杆菌为生产菌株，在诱导阶段，以36-40℃的温度进行诱导合成L-苯丙氨酸。
特别地，当菌体干重(DCW)达到9.5g/L，以36-40℃的温度进行诱导直至发酵结束。
所述丙酮酸激酶基因pykA缺失型的大肠杆菌BR-42ΔpykA(pAP-B03)是在L-苯丙氨酸生产菌株E.coli BR-42(pAP-B03)(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2010008，详见专利申请201010124215.6)的基础上敲除了丙酮酸激酶基因pykA。
培养基成分：
种子培养基(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5，pH调至7.2；接种前加入卡那霉素至40mg/L。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，(NH4)2SO4 5，KH2PO4 3，MgSO4·7H2O 3，NaCl 1，Na-Citrate 1.5，CaCl2·2H2O 0.015，FeSO4·7H2O 0.1125，维生素B1-HCl0.075，L-Tyr 0.3，蛋白胨4，酵母粉2，微量元素营养液(TES)1.5mL/L，卡那霉素0.04，pH调至6.8。
TES(g/L)：Al2(SO4)3·18H2O 2.0，CoSO4·7H2O 0.75，CuSO4·5H2O 2.5，H3BO30.5，MnSO4·7H2O 24，Na2MoO4·2H2O 3.0，NiSO4·6H2O 2.5，ZnSO4·7H2O 15。
培养方法：
三角摇瓶中的种子培养方法：接种量10％，温度37℃，摇床转速200r/min。
3L发酵罐中的发酵培养方法：初始装液量为1.35L，接种量为10％，溶氧水平通过与搅拌转速自动级联控制为30％，通气量为1.5vvm，初始温度为33℃，当DCW达到9.5g/L左右时，以36-40℃的温度进行诱导直至发酵结束。
发酵过程中初始糖耗至5g/L时开始流加700g/L的葡萄糖溶液，每2h取样测定残糖，控制发酵过程中的糖浓度为5±3g/L至发酵结束。通过30％(v/v)磷酸及28％(v/v)氨水将pH维持在6.8±0.3。
所述控制发酵过程中糖浓度的方法为：通过每2h测定实际残糖浓度，通过调节葡萄糖溶液流加速率控制残糖浓度在5±3g/L范围内。
残糖的测定方法：取发酵上清液，稀释一百倍后，使用葡萄糖-谷氨酸盐分析仪SBA-40C测定残糖。
细胞干重(DCW)的测定方法为：取一定量的菌悬液置于10mL容量瓶中，加去离子水定容，摇匀，用722型可见分光光度计，于610nm处比色测OD值，利用细胞干重标准曲线算得细胞干重。
L-苯丙氨酸浓度的测定方法采用氨基酸常用测定方法，高效液相色谱(HPLC)柱前衍生化方法进行测定(Rapid，accurate，sensitive，and reproducible HPLC analysis of amino acids.Henderson，J.W，Ricker，R.D.，Bidlingmeyer，B.A.，Woodward，C.，Agilent Technologies，USA，2000)。
本发明优点在于：
1)改善了菌体在发酵后期的生长，提高了其合成L-苯丙氨酸的能力；
2)提高了质粒的稳定性，减轻了发酵后期关键酶活的下降趋势，使L-Phe生产过程得到加强，提高了L-Phe对葡萄糖底物的的率系数；
3)减少了发酵周期，提高了生产强度。
附图说明
图1，L-Phe的契线式
图2，E.coli中L-Phe合成途径及调控方式
图3，丙酮酸激酶基因pykA缺失型的大肠杆菌的构建流程图
具体实施方式
实施例一
丙酮酸激酶基因pykA缺失型的大肠杆菌的构建方法参照Datsenko和Wanner的方法(Datsenko KA，Wanner BL.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products[J].Proc Natl Acad Sci USA，2000，97：6640-6645)，敲除L-Phe生产菌E.coli BR-42的pykA基因以构建pykA单基因缺失菌株E.coli BR-42ΔpykA。附图3为丙酮酸激酶基因pykA缺失型的大肠杆菌的构建框架图。其中，E.coli BR-42保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2010008；E.coli JW1843-1购自美国耶鲁大学菌种保藏中心(http://cgsc.biology.yale.edu/)；质粒pKD46和pCP20为商品化大肠杆菌质粒。根据NCBI上菌株E.coli W3110的pykA基因上下游序列设计一对引物。
上游引物(AU)：5′-AATTGTAGCGACGGAGACG-3′
下游引物(AD)：5′-GATTTATGATGGCAAGACG-3′
实施例二
培养基组成详见发明内容部分。
三角摇瓶中的种子培养方法：接种量10％，温度37℃，摇床转速200r/min。
3L发酵罐中的发酵培养方法：初始装液量为1.35L，接种量为10％，溶氧水平通过与搅拌转速自动级联控制为30％，通气量为1.5vvm，初始温度为33℃，当DCW达到9.5g/L左右时，以38℃的温度进行诱导直至发酵结束。当培养基中葡萄糖浓度消耗至5g/L时向发酵罐中流加700g/L的葡萄糖溶液维持其浓度在5±3g/L，发酵过程中通过流加30％(v/v)磷酸及28％(v/v)氨水将pH维持在6.8±0.3。
当发酵进行到24h左右时，菌体浓度出现下降的趋势；在发酵后期，有质粒丢失的现象，发酵结束时，约5％的重组大肠杆菌丢失了质粒，这影响着胞内合成L-苯丙氨酸的关键酶的表达水平；通过检测整个发酵过程中胞内关键酶DS、CM和PDT的酶活变化，发现3种酶随着发酵的进行都呈现先升高后降低的趋势。发酵后期菌体浓度的下降、质粒的丢失以及关键酶活的降低都制约着L-苯丙氨酸的合成效率。结果见表1。
实施例三
3L发酵罐中的发酵培养方法：初始装液量为1.35L，接种量为10％，溶氧水平通过与搅拌转速自动级联控制为30％，通气量为1.5vvm，初始温度为33℃，当DCW达到9.5g/L左右时，以40℃的温度进行诱导直至发酵结束。当初始糖耗完至5g/L以内时开始流加700g/L的葡萄糖溶液，每2h取样测定残糖，控制发酵过程中的糖浓度为5±3g/L至发酵结束，通过30％(v/v)磷酸及28％(v/v)氨水将pH维持在6.8±0.3。
与对照相似，当发酵进行到20h左右时，菌体浓度出现逐渐下降的趋势。在发酵后期质粒丢失较对照严重，发酵结束时，约8％的重组大肠杆菌丢失了质粒，这影响着胞内合成L-苯丙氨酸的关键酶的表达水平；整个发酵过程中胞内关键酶DS、CM和PDT的酶活都呈现先升高后降低的趋势。发酵后期菌体浓度的下降、质粒的丢失以及关键酶活的降低都制约着L-苯丙氨酸的合成效率。结果见表1。
实施例四
3L发酵罐中的发酵培养方法：初始装液量为1.35L，接种量为10％，溶氧水平通过与搅拌转速自动级联控制为30％，通气量为1.5vvm，初始温度为33℃，当DCW达到9.5g/L左右时，以36℃的温度进行诱导直至发酵结束。当初始糖耗完至5g/L以内时开始流加700g/L的葡萄糖溶液，每2h取样测定残糖，控制发酵过程中的糖浓度为5±3g/L至发酵结束，通过30％(v/v)磷酸及28％(v/v)氨水将pH维持在6.8±0.3。
与对照不同的是，以36℃进行诱导时，菌体生长得到了改善，在整个诱导发酵过程中，菌体浓度基本维持在18g/L左右，高于38℃和40℃诱导时的菌体浓度；在发酵后期几乎无质粒丢失现象；而整个发酵过程中胞内关键酶DS、CM和PDT的酶活也呈现先升高后降低的趋势，但在发酵的前期，酶活水平均低于其他两个温度下的酶活，这可能与诱导强度有关。虽然发酵后期高的菌体浓度和高的质粒稳定性为L-苯丙氨酸的过量合成提供了保证，但是发酵前期较低的酶活水平并不利于整个诱导阶段的L-苯丙氨酸合成。结果见表1。
实施例五
3L发酵罐中的发酵培养方法：初始装液量为1.35L，接种量为10％，溶氧水平通过与搅拌转速自动级联控制为30％，通气量为1.5vvm，初始温度为33℃，当DCW达到9.5g/L左右时，采用分阶段温度诱导策略，即13.5-20h采用诱导温度40℃，20-37h降低温度至38℃，38h以后的发酵采用36℃进行诱导。当初始糖耗完至5g/L以内时开始流加700g/L的葡萄糖溶液，每2h取样测定残糖，控制发酵过程中的糖浓度为5±3g/L至发酵结束，通过30％(v/v)磷酸及28％(v/v)氨水将pH维持在6.8±0.3。
通过采用分阶段温度诱导策略，可以显著改善菌体生长和合成L-苯丙氨酸的能力，质粒的稳定性很好的维持在95％以上，发酵前期3种关键酶的酶活水平均高于单一温度诱导下的酶活，而发酵后期，酶活降低的趋势有所缓解，有利于整个诱导阶段的菌体生长和L-苯丙氨酸合成。发酵48h时，L-苯丙氨酸的产量达到52.70g/L，分别比在40℃、38℃和36℃时提高了22.39％、13.77％和12.01％。L-苯丙氨酸对葡萄糖的得率和生产强度都有不同程度的提高。详见表1。
表1不同诱导温度条件下E.coli BR-42ΔpykA(pAP-B03)发酵生产L-Phe的参数比较
序列表
<110> 江苏汉光生物工程有限公司
<120> 一种发酵生产L-苯丙氨酸的方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> AU
<220>
<223> 根据基因序列设计用于扩增
<400> 1
aattgtagcg acggagacg 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> AD
<220>
<223> 根据基因序列设计用于扩增
<400> 2
gatttatgat ggcaagacg 19
Claims (3)
1.一种发酵生产L-苯丙氨酸的方法，以丙酮酸激酶基因pykA缺失型的大肠杆菌为生产菌株，其特征在于，在诱导阶段，以36-40℃的温度进行诱导合成L-苯丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当菌体干重达到9.5g/L，以36-40℃的温度进行诱导直至发酵结束。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，13.5-20h采用诱导温度40℃，20-37h降低温度至38℃，38h以后采用36℃进行诱导至发酵结束；发酵过程中初始糖耗至5g/L时开始流加700g/L的葡萄糖溶液，每2h取样测定残糖，控制发酵过程中的糖浓度为5±3g/L至发酵结束，通过30％(v/v)磷酸及28％(v/v)氨水将pH维持在6.8±0.3。
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