CN102010847A - 一种抗噬菌体l-苯丙氨酸生产菌及选育方法和其应用 - Google Patents

Abstract

一种抗噬菌体L-苯丙氨酸生产菌及选育方法和其应用属于生物工程技术领域。本发明利用亚硝基胍(NTG)诱变重组大肠杆菌的宿主菌WSH-Z06，以从WSH-Z06(pAP-B03)(CCTCC M2010009)发酵液中分离出的噬菌体做为筛子，选育得到具有噬菌体(CCTCC M)抗性的菌株，转化含L-苯丙氨酸合成酶基因的质粒pAP-B03，最终得到抗噬菌体L-苯丙氨酸生产菌WSH-BR42(pAP-B03)(CCTCC M 2010008)；与出发菌株相比，抗噬菌体L-苯丙氨酸重组菌WSH-BR42(pAP-B03)具有噬菌体(CCTCC M)的抗性，而且不影响菌体生长速度和产酸能力；本发明解决了L-苯丙氨酸发酵生产中长期受到噬菌体污染的难题。

Description

一种抗噬菌体L-苯丙氨酸生产菌及选育方法和其应用 

技术领域：

一种抗噬菌体L-苯丙氨酸高产菌及选育方法和其应用，属于生物工程技术领域，特别涉及一种生物法生产L-苯丙氨酸的方法。 

背景技术：

L-苯丙氨酸(L-phenylalanine，简称L-Phe)是人和动物体内不能合成的8种氨基酸之一，人们称其为必需氨基酸。L-苯丙氨酸在生物体内是转化成L-酪氨酸的原料，因而L-苯丙氨酸成为一些氨基酸输液和氨基酸饮膳所必须的成分；而且，L-苯丙氨酸是合成药物麦角胺、抗生物质和维生素B6的重要原料；同时，L-苯丙氨酸也是合成一些抗癌药物的中间体；在食品工业中，L-苯丙氨酸最主要的用途是合成二肽甜味剂阿斯巴甜，俗称蛋白糖；近年来，L-苯丙氨酸的应用领域还在不断拓展。目前，L-苯丙氨酸的生产方法有化学合成法、酶法、发酵法等三种，直接发酵法由于具有可利用廉价原料直接生产、对环境无污染、发酵条件温和等优点，成为国内外研究的重点。在国外，发酵法生产L-苯丙氨酸已经取得了可喜的成绩，据报道目前基因工程改造菌株可以达到5％的产酸率，而在我国该行业还处于起步阶段，发展潜力较大。最近几年来，基于阿斯巴甜的巨大需求量，已有十多家公司纷纷投产建立微生物发酵法生产L-苯丙氨酸的生产线。 

然而，噬菌体污染成为影响很多公司稳定发展的制约因素。众所周知，氨基酸生产中很容易发生噬菌体污染的现象，轻则使发酵周期延长，发酵产量降低，增加提取的难度；重则造成倒罐，公司被迫停产，使人力、物力、财力遭到浪费，严重影响经济的发展和进步。本实验室前期开发的L-苯丙氨酸生产菌WSH-Z06(pAP-B03)(CCTCC M2010009)，已实现工业化生产，但是在生产过程中，容易受到噬菌体的污染，导致大量的倒罐，严重影响了生产企业的经济效益。 

噬菌体污染的来源一般可归纳为三种：一是生产菌种携带有噬菌体，有的发生在接种、并种过程中；有的发生在种子培养过程中。二是污染发生在发酵过程中，例如原材料灭菌不彻底、发酵设备密封不好等。三是生产和实验过程中许多活菌被排放到环境中，使生产环境中本来存在的噬菌体有了宿主而不断增殖，导致环境中噬菌体的密度逐渐增高而形成污染源。要解决噬菌体污染问题，要从多方面综合治理，首先要注重预防，杜 绝噬菌体污染的一切可能来源，再者选育抗噬菌体的优良菌株进行发酵，或者采用多个菌株轮番使用的方法。由于发酵生产环境是一个开放的体系，其空气、土壤、水源等很难彻底进行消毒；再者噬菌体是一种个体极小、繁殖速度较快的病毒，会随着空气流动、尘土的飞动等到处传播，控制起来极其困难，而选育一种抗噬菌体菌株进行发酵生产可以从根本上解决噬菌体污染这一难题。 

目前抗噬菌体菌株的选育方法很多，但从根本上来说可分为三大类：一是采用从自然环境中筛选野生菌；二是利用生产菌株的自发突变或物理化学方法进行诱变；三是采用基因工程的手段在生产菌种中转化一个带有可以编码切割噬菌体DNA的相关酶的基因的质粒。本发明是采用传统的诱变育种与基因工程相结合的手段构建了一株抗噬菌体的L-苯丙氨酸生产菌株。 

发明内容

为解决L-苯丙氨酸生产菌易被噬菌体污染的问题，本发明提供了一种抗噬菌体的L-苯丙氨酸生产菌WSH-BR42（pAP-B03），该菌株为重组大肠杆菌，具有对重组大肠杆菌易感染噬菌体（CCTCC M 2010054）抗性，该噬菌体保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2010年3月15日，地址：中国武汉，武汉大学，分类学命名为：大肠杆菌噬菌体（Bacteriophage）；WSH-BR42（pAP-B03）含有重组质粒，质粒上携带L-苯丙氨酸合成酶基因，现已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC M  2010008，保藏日期：2010年1月14日，地址：中国武汉，武汉大学，分类学命名为：大肠杆菌（Escherichia coli）。 

所述重组质粒pAP-B03，其上携带L-苯丙氨酸合成的关键酶CM/PDT和DS的基因pheA^fbr和aroF，其中pheA^fbr基因来源于E.coli K12的突变株，aroF来源于E.coli K12(具体构建方法见参考文献：Enhanced L-phenylalanine biosynthesis by co-expressionof pheA^fbr and aroF^wt.Haiyan Zhou，Xianyan Liao，Tianwen Wang，Guocheng Du，JianChen.Bioresource Technology)。 

为解决抗噬菌体基因工程菌的选育的问题，本发明还提供了一种抗噬菌体L-苯丙氨酸生产菌的选育方法，对容易受到噬菌体污染的重组大肠杆菌的宿主菌WSH-Z06(来源见参考文献：Enhanced L-phenylalanine biosynthesis by co-expression of pheA^fbr andaroF^wt.Haiyan Zhou，Xianyan Liao，Tianwen Wang，Guocheng Du，Jian Chen.Bioresource Technology)进行诱变处理，筛选得到具有噬菌体抗性的菌株WSH-BR42，用编码L-苯丙氨酸合成酶基因的质粒(pAP-B03)转化WSH-BR42，得到抗噬菌体L-苯丙氨酸生产菌WSH-BR42(pAP-B03)(CCTCC M 2010008)。 

所述诱变处理，采用0.2-0.8mg/mL亚硝基胍(NTG)作为诱变剂对重组大肠杆菌宿 主菌处理30-60min。 

所述筛选方法，具体方法为：离心、收集、培养诱变后的菌体，挑取形态、大小、颜色各不相同的菌落逐一涂布单层平板，然后在平板的4个象限处分别滴加10μL噬菌体裂解液，做好标记，培养24h后，挑取在4处滴加噬菌体的地方均没有出现噬菌斑的菌株。 

所述噬菌体裂解液取样于受噬菌体污染的WSH-Z06(pAP-B03)发酵液，经过分离、培养后获得，具体方法为：发酵液离心后的上清液经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，取出一定上清液放入装有肉膏蛋白胨培养基的试管中，同时加入一定量的敏感菌WSH-Z06菌悬液，培养一段时间，待长出单个噬菌斑后，用接种针穿刺法挑取形态、大小不一的单个空斑分别接入含有敏感菌WSH-Z06的液体培养基中，37℃振荡培养16-24h。 

所述噬菌体抗性检测培养基，采用肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖10g/L，NaCl 5g/L)，pH 7.0-7.2，琼脂2％。 

为解决抗噬菌体L-苯丙氨酸生产菌应用的问题，本发明还提供了一种抗噬菌体L-苯丙氨酸生产菌的培养基组成；其中种子培养基采用LB培养基；发酵培养基以葡萄糖、L-酪氨酸、碳酸钙、七水合硫酸镁、二水合氯化钙、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸铵、七水合硫酸亚铁、柠檬酸钠、硫胺素(thiamine·HCl)、硫酸卡那霉素、微量元素溶液(TES)为主要成分。 

所述抗噬菌体L-苯丙氨酸生产菌，其优选培养基组成为： 

(1)种子培养基： 

使用LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)，pH 7.3，固体培养基加2％的琼脂。 

(2)发酵培养基(g/L)： 

葡萄糖25，L-酪氨酸0.4，碳酸钙12.5，七水合硫酸镁3.0，二水合氯化钙0.015，磷酸二氢钾3.0，氯化钠1.0，硫酸铵5.0，七水合硫酸亚铁0.075，柠檬酸钠1.0，硫胺素(thiamine·HCl)0.075，硫酸卡那霉素0.04，微量元素溶液(TES)1.5mL/L，pH 7.0。 

TES溶液(g/L)：Al₂(SO₄)₃·18H₂O 2.0，CoSO₄·7H₂O 0.75，CuSO₄·5H₂O 2.5，H₃BO₃ 0.5，MnSO₄·H₂O 24，Na₂MoO₄·2H₂O 3.0，NiSO₄·6H₂O 2.5，ZnSO₄·7H₂O 15，用1N的HCl溶解。 

所述抗噬菌体L-苯丙氨酸生产菌，其发酵培养方法为： 

(1)摇瓶培养方法 

将37℃、200rpm下培养12h的种子以10％的接种量分别转入装有50mL发酵培养基的500mL锥形瓶中，于37℃、200rpm条件下培养48h。 

(2)发酵罐培养方法 

将37℃、200rpm下培养12h的种子以10％的接种量分别接入装有3.6L发酵培养基的7L发酵罐中，pH由28％的氨水控制在7.0±0.1，温度33℃，待菌体浓度达到OD₆₁₀＝30以后，升温至37℃。初始转速400rpm，DO降至20％时逐步提高转速或通气量使DO维持在20％以上，培养基中的残余葡萄糖浓度通过流加的方式控制在5g/L左右。 

细胞干重(DCW)的测定方法为：取一定量的菌悬液置于10mL容量瓶中，加去离子水定容，摇匀，用722型可见分光光度计，于610nm处比色测OD值，利用细胞干重标准曲线算得细胞干重，若测摇瓶发酵培养中的菌体浓度则在定容前加2mL 2N的盐酸溶解菌悬液中的碳酸钙。 

L-苯丙氨酸浓度的测定方法采用氨基酸常用测定方法，高效液相色谱(HPLC)柱前衍生化方法进行测定(Henderson，J.W.，Ricker，R.D.，Bidlingmeyer，B.A.，Woodward，C.，2000.Rapid，accurate，sensitive，and reproducible HPLC analysis of amino acids.Agilent Technologies，USA(Agilent App Note 5980-1193E)。 

有益效果： 

本发明利用亚硝基胍(NTG)诱变重组大肠杆菌WSH-Z06(pAP-B03)(CCTCC M2010009)的宿主菌WSH-Z06，以从WSH-Z06(pAP-B03)发酵液中分离出的噬菌体做为筛子，选育得到具有噬菌体抗性的菌株WSH-BR42，转化含L-苯丙氨酸合成酶基因的质粒pAP-B03，最终得到抗噬菌体L-苯丙氨酸高产菌WSH-BR42(pAP-B03)(CCTCCM 2010008)；本发明成功构建了一株抗噬菌体L-苯丙氨酸生产菌；与原生产菌株相比，可以抵抗噬菌体的感染，且细胞生长速度和L-苯丙氨酸产量不受影响，并且具有良好的遗传稳定性，从根本上解决了L-苯丙氨酸生产过程中容易受到噬菌体污染的问题，提高了L-苯丙氨酸生产企业的经济效益。 

附图说明：

图1不同E.coli菌株对噬菌体的抗性检测。A为WSH-Z06；B为WSH-BR130；C为WSH-BR42。其中A中有4处明显的噬菌斑，而B、C的相应位置无噬菌斑出现，说明B、C两株突变菌株对噬菌体具有抗性。 

图2三株重组大肠杆菌菌株的摇瓶发酵比较。■L-苯丙氨酸□菌体干重 

图3发酵进行到14h时(右罐已停罐)的发酵液外观比较。其中左罐菌种为WSH-BR42(pAP-B03)，右罐菌种为WSH-Z06(pAP-B03)。 

图4抗噬菌体重组菌WSH-BR42(pAP-B03)(A图)与原始菌株WSH-Z06(pAP-B03)(B图)在外源添加噬菌体条件下的发酵过程曲线比较。◇L-苯丙氨酸▲菌体干重 

具体实施方式

实施例1重组大肠杆菌WSH-Z06(pAP-B03)易感染噬菌体BP-1的分离、纯化 

菌株来源：本实验室前期开发的L-苯丙氨酸生产菌重组大肠杆菌WSH-Z06(pAP-B03)，菌种保藏编号为CCTCC M 2010009，现已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2010年1月14日，地址：中国武汉，武汉大学，分类学命名为：大肠杆菌（Escherichia coli）。 

取某工厂受到噬菌体感染的重组大肠杆菌WSH-Z06(pAP-B03)发酵液4mL，8000rpm离心10min后，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，取出100μL到50℃装有6mL上层肉膏蛋白胨培养基的试管中，同时加入WSH-Z06(pAP-B03)(CCTCC M2010009)菌悬液100μL，立即混匀，倒入已凝固的底层培养基上，铺匀，置37℃培养箱内培养16-24h。待长出单个噬菌斑后，用接种针穿刺法挑取形态、大小不一的单个空斑分别接入含有WSH-Z06(pAP-B03)的液体培养基中，37℃振荡培养16-24h。重复上述步骤进行噬菌斑形态、大小的检验，直至得到纯化的噬菌体。 

噬菌体分离纯化培养基：肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖10g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0-7.2，上层琼脂0.8％，下层琼脂2％)。 

实施例2抗噬菌体大肠杆菌的选育 

A.出发菌株 

已工业化用于生产L苯丙氨酸的重组大肠杆菌的宿主菌WSH-Z06。 

大肠杆菌(Escherichia coli)WSH-Z06(pAP-B03)(CCTCC M 2010009)，为本研究室选育抗噬菌体重组菌的出发菌株。 

B.噬菌体 

噬菌体为BP-1，通过实施例1分离得到。 

C.培养基 

种子培养基：LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)；若菌体含有质粒则添加硫酸卡那霉素40μg/mL，pH 7.3，固体培养基加2％的琼脂。 

噬菌体抗性检测培养基：肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖10g/L，NaCl 5g/L)，pH 7.0-7.2，琼脂2％。 

D.突变株的诱变和分离筛选 

从新鲜斜面上接一环WSH-Z06入LB培养基中(25mL/250mL锥形瓶)，在37℃、200rpm的条件下培养12h后，离心收集菌体，用磷酸钾缓冲液(pH7.5)洗涤两次。然后加入2mL磷酸钾缓冲液，混匀悬浮菌体。取4个5mL离心管，分别加入0.2mL菌悬液及适量亚硝基胍(NTG)母液(1g/L)和磷酸钾缓冲液，配制成总体积为2mL、亚硝基胍(NTG)浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL的悬浮体系(体积组成见表1)；于37℃、200rpm下振荡处理30-60min。离心收集菌体，并用缓冲液洗涤3次后将其分别接入种子培养基中作中间培养6h，而后稀释、涂布LB平板，置于37℃培养箱中培养过夜，挑取形态、大小、颜色各不相同的菌落逐一涂布单层平板，然后在平板的4个象限处分别滴加10μL噬菌体裂解液，做好标记，培养24h后，挑选出在4处滴加噬菌体的地方均没有出现噬菌斑的菌株，将每株菌分别在斜面培养基上连续传代10次，再分别检测各菌株每一代的噬菌体抗性，结果选出噬菌体抗性遗传稳定的菌株2株(附图1)，分别命名为WSH-BR42和WSH-BR130，以待复筛。 

表1  诱变体系的体积组成 

实施例3质粒pAP-B03转化WSH-BR42和WSH-BR130 

采用高效制备感受态细胞试剂盒(上海生工)提供的方法分别制备大肠杆菌WSH-Z06突变株WSH-B42和WSH-BR130的感受态细胞。将制备好的感受态细胞置于冰上，往各管中(110μL)分别加入质粒pAP-B03(前期构建，EnhancedL-phenylalanine biosynthesis by co-expression of pheA^fbr and aroF^wt)2μL，轻轻旋转以混匀内容物，冰上放置30min，然后静置于42℃水浴中90s后，快速转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min。向各管中分别加入液体种子培养基600μL，37℃水浴2h。分别移取50μL已转化的感受态细胞于含有硫酸卡那霉素的LB平板上，涂布均匀，置于37℃培养箱中培养过夜。待有单菌落长出，将其接入含有硫酸卡那霉素的LB斜面上保藏备用。 

实施例4重组大肠杆菌WSH-BR42(pAP-B03)、WSH-BR130(pAP-B03)和原生产菌株WSH-Z06(pAP-B03)的摇瓶发酵培养 

分别从重组大肠杆菌WSH-BR42(pAP-B03)、WSH-BR130(pAP-B03)和原生产菌株WSH-Z06(pAP-B03)的保藏斜面上接一环到装有25mL种子培养基的250mL锥形瓶中，37℃、200rpm条件下培养至菌体浓度达到OD₆₁₀＝2，然后以10％的比率分别接入装有50mL发酵培养基的500mL锥形瓶中，37℃、200rpm条件下培养48h。种子培养基和发酵培养基组成如本说明书中所述，每组实验做三个平行。发酵结束后取样品稀释50倍后检测菌体浓度；离心发酵液，取上清液稀释10倍后检测L-苯丙氨酸产量，结果见附图2。从图2可以看出，突变株WSH-BR42(pAP-B03)菌体浓度和L-苯丙氨酸产量均比WSH-BR130(pAP-B03)高出30％以上，而与原生产菌株相比没有明显差异。对突变株WSH-BR42(pAP-B03)进行传代培养，发现传代后菌体浓度和L-苯丙氨酸产量都保持较高的水平。 

实施例5重组大肠杆菌WSH-BR42(pAP-B03)和原生产菌株WSH-Z06(pAP-B03)的7L罐发酵培养 

种子培养和发酵接种条件均同实施例4，7L发酵罐中发酵培养基(添加1％(v/v)的效价为10¹⁰PFU/mL的噬菌体BP-1的裂解液)体积为3.6L。通气量为1vvm，搅拌转速为400rpm，待DO降至20％，通过调节搅拌转速和通气量维持DO在20％以上。温度33℃，菌体浓度达到OD₆₁₀＝30时，升温至37℃。用28％氨水控制pH在7.0左 右，使用流加700g/L的葡萄糖溶液的方式维持培养基中残余葡萄糖浓度在5g/L左右。发酵设备为韩国发酵罐公司生产的型号为KBT-7L的全自动发酵罐。发酵至L-苯丙氨酸产量不再上升为止。结果见附图3和附图4。WSH-Z06(pAP-B03)在发酵进行2h左右时，菌体浓度逐渐下降，显微镜观察见大量菌体裂解，菌体形态模糊，发酵液变得澄清，14h被迫下罐，而WSH-BR42(pAP-B03)菌体生长一直较正常，发酵48h后产L-苯丙氨酸约40g/L。 

Claims (9)

1.一种生产L-苯丙氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于，该菌株具有对重组大肠杆菌易感染噬菌体(CCTCC M)抗性；含有重组质粒，质粒上携带L-苯丙氨酸合成酶基因，现已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2010008。

2.权利要求1所述易感染噬菌体，其特征在于，该噬菌体分离自容易受到噬菌体污染的L-苯丙氨酸生产菌WSH-Z06(pAP-B03)(CCTCC M 2010009)的发酵液；该噬菌体现已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M。

3.一种抗噬菌体L-苯丙氨酸生产菌的选育方法，其特征在于，对容易受到噬菌体污染的重组大肠杆菌的宿主菌WSH-Z06进行诱变处理，筛选得到具有噬菌体(CCTCCM)抗性的菌株WSH-BR42，用编码L-苯丙氨酸合成酶基因的质粒(pAP-B03)转化WSH-BR42，得到抗噬菌体L-苯丙氨酸生产菌WSH-BR42(pAP-B03)(CCTCCM 2010008)。

4.权利要求3所述诱变处理，其特征在于，采用0.2-0.8mg/mL亚硝基胍(NTG)作为诱变剂对重组大肠杆菌宿主菌处理30-60min。

5.权利要求3所述噬菌体抗性菌株筛选方法，其特征在于，离心、收集、培养诱变后的菌体，挑取形态、大小、颜色各不相同的菌落逐一涂布单层平板，然后在平板的4个象限处分别滴加10μL噬菌体裂解液，做好标记，培养24h后，挑取在4处滴加噬菌体的地方均没有出现噬菌斑的菌株。

6.权利要求5所述噬菌体裂解液，其特征在于，取一定体积的受到噬菌体污染的L-苯丙氨酸生产菌WSH-Z06(pAP-B03)的发酵液离心，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后移入噬菌体抗性检测培养基中，同时加入一定量的WSH-Z06菌悬液，培养一段时间，待长出单个噬菌斑后，用接种针穿刺法挑取形态、大小不一的单个空斑分别接入含有WSH-Z06的液体培养基中，37℃振荡培养16-24h。

7.权利要求6所述噬菌体抗性检测培养基，其特征在于，优选肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖10g/L，NaCl 5g/L)，pH 7.0-7.2，琼脂2％。

8.一种抗噬菌体L-苯丙氨酸生产菌的应用，其特征在于，种子培养基采用LB培养基；发酵培养基以葡萄糖、L-酪氨酸、碳酸钙、七水合硫酸镁、二水合氯化钙、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸铵、七水合硫酸亚铁、柠檬酸钠、硫胺素(thiamine.HCl)、硫酸卡那霉素、微量元素溶液(TES)为主要成分。

9.权利要求8所述发酵培养基，其特征在于，优选发酵培养基为(g/L)：葡萄糖25，L-酪氨酸0.4，碳酸钙12.5，七水合硫酸镁3.0，二水合氯化钙0.015，磷酸二氢钾3.0，氯化钠1.0，硫酸铵5.0，七水合硫酸亚铁0.075，柠檬酸钠1.0，硫胺素(thiamine.HCl)0.075，硫酸卡那霉素0.04，微量元素溶液(TES)1.5mL/L，pH 7.0；其中TES溶液(g/L)为：Al2(SO4)3.18H2O 2.0，CoSO4.7H2O 0.75，CuSO4.5H2O 2.5，H3BO3 0.5，MnSO4.H2O 24，Na2MoO4.2H2O 3.0，NiSO4.6H2O 2.5，ZnSO4.7H2O15，用1N的HCl溶解。

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