CN110157642A - 海藻糖生产用大肠杆菌的筛选和优化方法 - Google Patents

海藻糖生产用大肠杆菌的筛选和优化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种海藻糖生产用大肠杆菌的筛选和优化方法，包括步骤一、在发酵罐中接取噬菌体侵染的细菌液体培养基，并在抗性LB平板上涂布培养，剩余菌液在无菌条件下与细菌分离并收集上清液待用；步骤二、待平板长出透明圈后继续培养至透明圈中长出单菌落，将多个单菌落分别接种于装有LB液体培养基的试管中培养；步骤三、待试管中的细菌长至对数生长期后，按2％传代液体培养基培养，待菌浓达到OD600≥2时，接入终浓度为5％步骤一中的上清液；步骤四、将步骤三中能够继续正常生长的细菌对应的试管菌液按一定的接种量进行自诱导发酵验证，将转化实验验证转化率高的试管菌液液体培养基扩培冻存待用；这样既降低了生产成本，又达到了较好的转化效果。

Description

海藻糖生产用大肠杆菌的筛选和优化方法
技术领域
本发明涉及大肠杆菌发酵技术领域，尤其涉及一种海藻糖生产用大肠杆菌的筛选和优化方法。
背景技术
海藻糖是由两个葡萄糖分子通过α, α-1,1糖苷键结合的非还原性糖，它广泛存在于细菌、酵母、藻类、真菌、昆虫以及一些抗逆性植物中。海藻糖对细胞膜、蛋白质、核酸等生物大分子具有非特异性的保护作用，具有良好的吸水性、稳定、且不易焦糖化。外源性的海藻糖同样对生物体和生物大分子有非特异性的保护作用，海藻糖这种独特的生物学性质使其在食品、医药、化妆品、疫苗等领域有重要的应用。
以淀粉为底物的反应是在麦芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶的作用下进行的，首先，麦芽寡糖基海藻糖合成酶是一种分子内转糖基酶, 催化麦芽寡糖(淀粉液化液) 还原端的葡萄糖基和相邻的葡萄糖基间的α-1,4-葡萄糖苷键转化成α-1,1-葡萄糖苷键, 生成麦芽寡糖基海藻糖; 麦芽寡糖基海藻糖水解酶专一水解麦芽寡糖基海藻糖的麦芽寡糖基和海藻糖基间的α-1,4-糖苷键, 以上两种酶联合作用, 每次从麦芽寡糖生成海藻糖和少两个葡萄糖单位的麦芽寡糖。1995年，Nakada等人从Arthrobactersp.Q36菌株中分离得到一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶及一种麦芽寡糖基海藻糖水解酶。麦芽寡糖基海藻糖合成酶可将直链麦芽寡糖的还原端的葡萄糖基和相邻的葡萄糖基间的α,α-1,4葡萄糖苷键转化成α,α-1,4葡萄糖苷键, 生成麦芽寡糖基海藻糖，麦芽寡糖基海藻糖水解酶可将生成的麦芽寡糖基海藻糖水解得到海藻糖及少了两个葡萄糖基的麦芽寡糖，他们将这两种酶用于海藻糖的工业化生产。目前的方法普遍存在，转化时间长的问题，转化效率也有待提高。
发酵法则是现如今最常用的生产海藻糖的方法其一般是先经过诱变、细胞融合、基因重组等方法选育海藻糖的高产菌株，然后采用高浓度培养基及高渗条件发酵，并在发酵结束前进行饥饿处理，从而得到海藻糖较高的培养物。这些菌株包括节杆菌属、棒杆菌属、短杆菌属、微球菌属等。但是杂菌的污染，噬菌体的侵染是当今微生物发酵培养的难题，优化发酵条件，筛选对相应噬菌体有抗性的菌株是一件相当难的课题，高产菌株选育也相对困难，转化率低，副产物多，提取精制困难，因此阻碍了发酵法生产海藻糖的工业化生产进程。
综上所述，在酶法制造海藻糖领域中缺乏对相应工程菌抗噬菌体菌株的筛选和高表达菌株的优化工艺。
发明内容
为了解决现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种海藻糖生产用大肠杆菌的筛选和优化方法，用于酶法制造海藻糖过程中麦芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶两种基因改造工程菌的抗噬菌体菌株的筛选和高酶活表达的优化。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种海藻糖生产用大肠杆菌的筛选和优化方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、在发酵罐中接取噬菌体侵染的细菌液体培养基，并在抗性LB平板上涂布培养，剩余菌液在无菌条件下与细菌分离并收集上清液待用；
步骤二、待涂布培养的平板长出透明圈后继续培养至透明圈中长出单菌落，将多个单菌落分别接种于一一对应的且装有LB液体培养基的试管中培养；
步骤三、待试管中的细菌长至对数生长期后，按2％传代液体培养基培养，待菌浓达到OD600≥2时，接入终浓度为5％步骤一中的上清液，继续培养观察；
步骤四、将步骤三中能够继续正常生长的细菌对应的试管菌液按一定的接种量进行自诱导发酵验证，将转化实验验证转化率高的试管菌液液体培养基扩培冻存待用。
所述细菌液体培养基的菌种为麦芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶克隆菌，购买自中科院北京微生物所。
所述菌种在发酵罐中进行高密度培养，采用的高密度培养基包括按质量配比的以下各组分：1.5％-2%碳源、13g/L-13.3g/L磷酸二氢钾、3.8g/L-4g/L磷酸氢二铵、1.5g/L-1.8g/L柠檬酸、微量元素150mg/L-152 mg/L、1.5g/L-1.8g/L硫酸镁、0.8g/L-2g/L阿拉伯糖，余量为水。
所述步骤一中的LB平板采用的培养基包括按质量配比的以下各组分：0.8％-1.2％蛋白胨、0.5％-0.7％酵母粉、0.8％-1.2％氯化钠、1.5％-2％琼脂粉，余量为水；将上述各组分混合均匀后调至PH值为6.8-7，并通过温度为120-123℃、时间为15-25min的高压灭菌处理后待温度冷却至45-55℃时加入1‰-1.2‰的硫酸卡那霉素获得培养基；且每个LB平板倒入18ml-22ml培养基，经无菌验证后使用。
所述步骤一中的剩余菌液为高密度发酵液，通过高速离心机离分离的转速12000rpm、时间为5-10min，分离后留取上清液，并在超净工作台中，无菌操作过0.22um滤膜，将过滤后的上清液放至4℃冰箱中待用。
所述步骤二中透明圈的培养时间为5-6h，再长出单菌落的培养时间为5-6h。
所述步骤二中的LB液体培养基包括按质量配比的以下各组分：0.8％-1.2％蛋白胨、0.5％-0.7％酵母粉、0.8％-1.2％氯化钠，余量为水；将上述各组分混合均匀后调至PH值为6.8-7并分装于试管中，试管中的LB液体培养容量为10-12ml，并通过温度为120-123℃、时间为15-25min的高压灭菌处理后待温度冷却至45-55℃时加入1‰-1.2‰的硫酸卡那霉素获得培养基，经无菌验证后使用。
所述步骤三中细菌的对数生长期的菌浓为OD600=1.0-1.4，液体培养基与步骤二的LB液体培养相同。
所述步骤三中通过摇床设备进行培养，摇床设备的温度36-37℃，摇床设备的转速180-220rpm。
所述步骤四中的试管菌液为步骤三中在上清液中继续培养5-6h后、OD600≥6的菌液。
所述步骤四中自诱导发酵验证所使用的自诱导培养基包括按质量配比的以下各组分：0.8％-1.2％蛋白胨、0.5％-0.7％酵母粉，余量为水；将上述各组分混合均匀后调至PH值为6.8-7，并分装于500ml三角瓶中，三角瓶中的自诱导培养基容量为190-200ml，并通过温度为120℃-123℃、时间为15-25min的高压灭菌处理。
所述步骤四中试管菌液在接种前加入按质量配比的以下各组分：0.892％-0.915％的Na2HPO4•12H2O、0.34％-0.38％的KH2PO4、0.2676％-0.2865％的NH4cl、0.0708％-0.0785％的Na2SO4、0.5％-0.6％的甘油、0.05％-0.06％葡萄糖、0.0493％-0.0514％的七水硫酸镁、0.095‰-0.105‰的微量元素、1‰-1.2‰的卡那霉素、0.18％-0.2％的L-阿拉伯糖，余量为水；将上述各组分混合均匀后，通过温度为115-118℃、时间为15-25min的高压灭菌处理后待温度冷却至45-55℃，并按1.8％-2％接种量接入细菌。
所述步骤四中自诱导发酵的培养条件为温度27-28℃、发酵罐的搅拌转速为160 -200rpm、时间为14h-16h后破碎细菌。
所述步骤四中转化实验验证转化率不低于78％。
所述步骤四中冻存条件为：将甘油：菌液按照体积比1:5混合均匀，在温度为-40℃的环境下保存。
其中，上述内容中涉及的OD600名词解释为：OD值为吸光值，本实验用大肠杆菌在波长600的情况下有最大吸光值，通过测定此波长下的吸光值可以通过线性计算菌液浓度。
本发明的有益效果是：通过该方法进行大肠杆菌抗噬菌体菌种的筛选，高酶活表达菌株的优化，通过层层淘汰实验最终得到符合要求的菌种，该菌种应用于车间高密度发酵，保证了细菌的存活率，后期还得到高酶活表达的菌种通过验证转化率可达到78％以上超过同产业转化实验数据，这样既降低了生产成本，又达到了较好的转化效果。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
本实施例提供一种海藻糖生产用大肠杆菌的筛选和优化方法，包括以下步骤：
步骤一、在发酵罐中接取噬菌体侵染的细菌液体培养基，并在抗性LB平板上涂布培养，剩余菌液在无菌条件下与细菌分离并收集上清液待用；
步骤二、待涂布培养的平板长出透明圈后继续培养至透明圈中长出单菌落，将12个单菌落分别接种于一一对应的且装有LB液体培养基的12只试管中培养；
步骤三、待试管中的细菌长至对数生长期后，按2％传代液体培养基培养，待菌浓达到OD600≥2时，接入终浓度为5％步骤一中的上清液，继续培养观察；
步骤四、将步骤三中能够继续正常生长的细菌对应的试管菌液按一定的接种量进行自诱导发酵验证，将转化实验验证转化率高的试管菌液液体培养基扩培冻存待用。
上述各个步骤的具体实施工艺为：
在步骤一中，发酵罐中的细菌液体培养基的菌种为麦芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶克隆菌，购买自中科院北京微生物所，发酵罐中使用高密度培养基，高密度培养基包括按质量配比的以下各组分：2%碳源、13.3g/L磷酸二氢钾、4g/L磷酸氢二铵、1.7g/L柠檬酸、152 mg/L微量元素、1.7g/L硫酸镁、2g/L阿拉伯糖，余量为水。
高密度培养基的具体灭菌方式：13.3g/L磷酸二氢钾、4g/L磷酸氢二铵、1.7g/L柠檬酸经过温度为115℃、时间为20min的高温高压灭菌; 152 mg/L微量元素、1.7g/L硫酸镁经过温度为115℃、时间为20min的高温高压灭菌；2g/L阿拉伯糖经过温度为115℃、时间为20min的高温高压灭菌，2%碳源经过温度为115℃、时间为20min的高温高压灭菌，根据培养需求将以上配料混合；
发酵罐的控制条件：转速50rpm、风量100L/h、罐压0.02mpa、温度37℃；
菌种平板培养和上清液制备：LB平板采用的培养基包括按质量配比的以下各组分：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠、2％琼脂粉，余量为水；将上述各组分混合均匀后调至PH值为7，并通过温度为121℃、时间为20min的高压灭菌处理后待温度冷却至50℃时加入1‰的硫酸卡那霉素获得培养基；且每个LB平板倒入20ml培养基，经无菌验证后使用；使用时吸取150ul发酵罐中菌液均匀涂布在上述板子上，温度在37℃中倒置培养；
在剩余菌液为高密度发酵液中，分别取两只1.5ml灭菌后的离心管，每管加发酵液1ml，通过高速离心机离分离的转速12000rpm、时间为5min，分离后留取上清液，并在超净工作台中，无菌操作过0.22um滤膜，将过滤后的上清液放至4℃冰箱中待用。
在步骤二中，倒置平板在37℃下培养5-6h左右可看到明显的透明圈，用记号笔标记透明圈继续培养5-6h后在透明圈范围内发现单菌落，小号枪头挑取单菌落12个，分别接种于LB液体培养基的试管中；
LB液体培养基包括按质量配比的以下各组分：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠，余量为水；将上述各组分混合均匀后调至PH值为7并分装于试管中，试管中的LB液体培养容量为10ml，并通过温度为121℃、时间为20min的高压灭菌处理后待温度冷却至45-55℃时加入1‰的硫酸卡那霉素获得培养基，经无菌验证后使用；在接种单菌落，通过摇床设备在温度为36-37℃、转速为220rpm的环境下培养；
在步骤三中，试管中的细菌在摇床培养3h后测菌浓，当OD600=1.0-1.4时，取1ml接种于含50ml液体LB培养基中；
LB液体培养基包括按质量配比的以下各组分：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠，余量为水；将上述各组分混合均匀后调至PH值为7并分装于150ml三角瓶中，每瓶培养基50ml包装，并通过温度为121℃、时间为20min的高压灭菌处理后待温度冷却至45-55℃时加入1‰的硫酸卡那霉素获得培养基，经无菌验证后使用，在接种菌液后，通过摇床设备在温度为37℃、转速为220rpm的环境下培养；
培养5小时后菌液OD600≥2后，每只三角瓶中加入步骤一中提到的上清液2.5ml，继续培养5-6h后观察菌液浑浊度，将OD600＞6的菌液视为有噬菌体抗性，菌浓过低表示被噬菌体侵染破碎淘汰掉；
在步骤四中，自诱导发酵验证所使用的自诱导培养基包括按质量配比的以下各组分：1％蛋白胨、0.5％酵母粉，余量为水；将上述各组分混合均匀后调至PH值为7，并分装于500ml三角瓶中，三角瓶中的自诱导培养基容量为190ml，并通过温度为121℃、时间为20min的高压灭菌处理；
试管菌液在接种前加入按质量配比的以下各组分：0.892％的Na2HPO4•12H2O、0.34％的KH2PO4、0.2676％的NH4cl、0.0708％的Na2SO4、0.5％的甘油、0.05％葡萄糖、0.0493％的七水硫酸镁、0.1‰的微量元素、1‰的卡那霉素、0.2％的L-阿拉伯糖，余量为水；
将上述各组分混合均匀后，并按1.8％-2％接种量接入细菌，具体实施步骤包括：
配制100ml的50*M无机盐：将44g的Na2HPO4•12H2O、17g的KH2PO4、13.38g的NH4cl、3.54g的Na2SO4溶解混合均匀定容至100ml，通过温度为115℃、时间为20min的高压灭菌处理后待温度冷却至45-55℃，接种前每只三角瓶中加入4ml；
配制100ml的50*5052：:25g甘油、2.5g葡萄糖溶解后定容100ml，通过温度为115℃、时间为20min的高压灭菌处理后待温度冷却至45-55℃，接种前每只三角瓶中加入4ml；
100ml镁盐：24.65g七水硫酸镁溶解定容100ml，通过温度为115℃、时间为20min的高压灭菌处理后待温度冷却至45-55℃，接种前每只三角瓶中加入400ul；
1‰的微量元素：通过温度为115℃、时间为20min的高压灭菌处理后待温度冷却至45-55℃，接种前每只三角瓶中加入200ul；
1‰的卡那霉素：50mg/ml卡那霉素通过0.22ul滤膜过滤除菌，接种前每只三角瓶中加入200ul；
L-阿拉伯糖：20g L-阿拉伯糖溶解定容100ml，通过温度为115℃、时间为20min的高压灭菌处理后待温度冷却至45-55℃，接种前每只三角瓶中加入1.8-2ml；
培养条件为通过摇床设备在温度为28℃、转速为180rpm的环境下培养14-16h后，然后纯水洗菌液2-3次后用细胞破碎仪进行破碎，按照工艺标准将酶液与底物麦芽糊精添加在一起反应，反应结束后液相检测转化率，转化率在78％为合格，相对应的试管菌液通过上述步骤三中的LB液体培养基进行扩培至OD600=1.0-1.2后，用40％甘油按与菌液1:1的体积比比例混匀后-40℃冰箱中冻存待用。
以上所述仅为本发明的优先实施方式，只要以基本相同手段实现本发明的目的技术方案，都属于本发明的保护范围之内。

Claims (15)

1.一种海藻糖生产用大肠杆菌的筛选和优化方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、在发酵罐中接取噬菌体侵染的细菌液体培养基，并在抗性LB平板上涂布培养，剩余菌液在无菌条件下与细菌分离并收集上清液待用；
步骤二、待涂布培养的平板长出透明圈后继续培养至透明圈中长出单菌落，将多个单菌落分别接种于一一对应的且装有LB液体培养基的试管中培养；
步骤三、待试管中的细菌长至对数生长期后，按2％传代液体培养基培养，待菌浓达到OD600≥2时，接入终浓度为5％步骤一中的上清液，继续培养观察；
步骤四、将步骤三中能够继续正常生长的细菌对应的试管菌液按一定的接种量进行自诱导发酵验证，将转化实验验证转化率高的试管菌液液体培养基扩培冻存待用。
2.根据权利要求1所述的海藻糖生产用大肠杆菌的筛选和优化方法，其特征在于：所述细菌液体培养基的菌种为麦芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶克隆菌，购买自中科院北京微生物所。
3.根据权利要求1所述的海藻糖生产用大肠杆菌的筛选和优化方法，其特征在于：所述菌种在发酵罐中进行高密度培养，采用的高密度培养基包括按质量配比的以下各组分：1.5％-2%碳源、13g/L-13.3g/L磷酸二氢钾、3.8g/L-4g/L磷酸氢二铵、1.5g/L-1.8g/L柠檬酸、微量元素150mg/L-152 mg/L、1.5g/L-1.8g/L硫酸镁、0.8g/L-2g/L阿拉伯糖，余量为水。
4.根据权利要求1所述的海藻糖生产用大肠杆菌的筛选和优化方法，其特征在于：所述步骤一中的LB平板采用的培养基包括按质量配比的以下各组分：0.8％-1.2％蛋白胨、0.5％-0.7％酵母粉、0.8％-1.2％氯化钠、1.5％-2％琼脂粉，余量为水；将上述各组分混合均匀后调至PH值为6.8-7，并通过温度为120-123℃、时间为15-25min的高压灭菌处理后待温度冷却至45-55℃时加入1‰-1.2‰的硫酸卡那霉素获得培养基；且每个LB平板倒入18ml-22ml培养基，经无菌验证后使用。
5.根据权利要求1所述的海藻糖生产用大肠杆菌的筛选和优化方法，其特征在于：所述步骤一中的剩余菌液为高密度发酵液，通过高速离心机离分离的转速12000rpm、时间为5-10min，分离后留取上清液，并在超净工作台中，无菌操作过0.22um滤膜，将过滤后的上清液放至4℃冰箱中待用。
6.根据权利要求1所述的海藻糖生产用大肠杆菌的筛选和优化方法，其特征在于：所述步骤二中透明圈的培养时间为5-6h，再长出单菌落的培养时间为5-6h。
7.根据权利要求1所述的海藻糖生产用大肠杆菌的筛选和优化方法，其特征在于：所述步骤二中的LB液体培养基包括按质量配比的以下各组分：0.8％-1.2％蛋白胨、0.5％-0.7％酵母粉、0.8％-1.2％氯化钠，余量为水；将上述各组分混合均匀后调至PH值为6.8-7并分装于试管中，试管中的LB液体培养容量为10-12ml，并通过温度为120-123℃、时间为15-25min的高压灭菌处理后待温度冷却至45-55℃时加入1‰-1.2‰的硫酸卡那霉素获得培养基，经无菌验证后使用。
8.根据权利要求1所述的海藻糖生产用大肠杆菌的筛选和优化方法，其特征在于：所述步骤三中细菌的对数生长期的菌浓为OD600=1.0-1.4，液体培养基与步骤二的LB液体培养相同。
9.根据权利要求1所述的海藻糖生产用大肠杆菌的筛选和优化方法，其特征在于：所述步骤三中通过摇床设备进行培养，摇床设备的温度36-37℃，摇床设备的转速180-220rpm。
10.根据权利要求1所述的海藻糖生产用大肠杆菌的筛选和优化方法，其特征在于：所述步骤四中的试管菌液为步骤三中在上清液中继续培养5-6h后、OD600≥6的菌液。
11.根据权利要求1所述的海藻糖生产用大肠杆菌的筛选和优化方法，其特征在于：所述步骤四中自诱导发酵验证所使用的自诱导培养基包括按质量配比的以下各组分：0.8％-1.2％蛋白胨、0.5％-0.7％酵母粉，余量为水；将上述各组分混合均匀后调至PH值为6.8-7，并分装于500ml三角瓶中，三角瓶中的自诱导培养基容量为190-200ml，并通过温度为120℃-123℃、时间为15-25min的高压灭菌处理。
12.根据权利要求1所述的海藻糖生产用大肠杆菌的筛选和优化方法，其特征在于：所述步骤四中试管菌液在接种前加入按质量配比的以下各组分：0.892％-0.915％的Na2HPO4•12H2O、0.34％-0.38％的KH2PO4、0.2676％-0.2865％的NH4cl、0.0708％-0.0785％的Na2SO4、0.5％-0.6％的甘油、0.05％-0.06％葡萄糖、0.0493％-0.0514％的七水硫酸镁、0.095‰-0.105‰的微量元素、1‰-1.2‰的卡那霉素、0.18％-0.2％的L-阿拉伯糖，余量为水；将上述各组分混合均匀后，通过温度为115-118℃、时间为15-25min的高压灭菌处理后待温度冷却至45-55℃，并按1.8％-2％接种量接入细菌。
13.根据权利要求1所述的海藻糖生产用大肠杆菌的筛选和优化方法，其特征在于：所述步骤四中自诱导发酵的培养条件为温度27-28℃、发酵罐的搅拌转速为160 -200rpm、时间为14h-16h后破碎细菌。
14.根据权利要求1所述的海藻糖生产用大肠杆菌的筛选和优化方法，其特征在于：所述步骤四中转化实验验证转化率不低于78％。
15.根据权利要求1所述的海藻糖生产用大肠杆菌的筛选和优化方法，其特征在于：所述步骤四中冻存条件为：将甘油：菌液按照体积比1:5混合均匀，在温度为-40℃的环境下保存。
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