CN117089496A - 一株具有噬菌体抗性的地衣芽孢杆菌及其在制备聚谷氨酸中的应用 - Google Patents

一株具有噬菌体抗性的地衣芽孢杆菌及其在制备聚谷氨酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株具有噬菌体抗性的地衣芽孢杆菌及其在聚谷氨酸制备中的应用。所述的地衣芽孢杆菌，其分类命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，菌株号为PGA11，已于2023年06月07日保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27576。本发明选育的地衣芽孢杆菌能抵抗地衣芽孢杆菌易感染噬菌体PK‑1的侵染，并且不影响菌株的生长速度及聚谷氨酸的合成能力，解决了地衣芽孢杆菌在长期发酵生产中易受噬菌体污染的难题，具有较好的工业应用价值。

Description

一株具有噬菌体抗性的地衣芽孢杆菌及其在制备聚谷氨酸中 的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株具有噬菌体抗性的地衣芽孢杆菌及其在制备聚谷氨酸中的应用。
背景技术
聚γ-谷氨酸(γ-PGA)是一种阴离子多肽。γ-PGA的重复单元来源于D-谷氨酸或L-谷氨酸，或两者都有。单体单元通过α-氨基和γ-羧酸基团之间的酰胺键连接。γ-PGA具有生物相容性、生物可降解性、水溶性、食用性、无毒性和环境友好性，受到广泛关注，广泛应用于食品、医药和化妆品领域。微生物发酵法在聚谷氨酸的生产中极具优势，工业上常用地衣芽孢杆菌来生产聚谷氨酸。
噬菌体是侵染细菌的病毒，具有超显微、无细胞结构、专性活细胞寄生等特征。发酵行业常受到噬菌体的危害，会造成发酵周期延长、发酵产量低、倒罐等问题。地衣芽孢杆菌应用广泛，易感染噬菌体，而利用诱变手段筛选抗噬菌体的菌株是筛选抗性菌株的有效手段。因此，从工厂发酵液中分离出噬菌体，对出发菌株进行诱变，选育出具有噬菌体抗性的生产菌株，具有一定的经济效益。
为解决地衣芽孢杆菌易被污染的问题，本发明拟采用等离子体诱变选育方法，选育一株具有噬菌体抗性的地衣芽孢杆菌。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株具有噬菌体抗性的地衣芽孢杆菌，能够对地衣芽孢杆菌易感染噬菌体PK-1具有抗性。
本发明还要解决的技术问题是，提供上述具有噬菌体抗性的地衣芽孢杆菌在生产聚谷氨酸中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一株具有噬菌体抗性的地衣芽孢杆菌，分类命名为地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis，菌株号为PGA11，已于2023年06月07日保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27576，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
其中，所述的地衣芽孢杆菌对噬菌体PK-1具有抗性。
具体的，所述的噬菌体PK-1分离自聚谷氨酸发酵生产过程中受到噬菌体污染的细胞发酵液。
具体的，将受噬菌体污染的地衣芽孢杆菌发酵液，离心后获得的上清液经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，通过点滴实验验证噬菌体的存在。取一定量的上清液与野生型地衣芽孢杆菌菌悬液加入到适量的半固体培养基中，混合均匀后倒入固体培养基上，37℃培养12-24h。待长出噬菌斑，挑取单个噬菌斑，放入SM缓冲液中离心过滤除菌并梯度稀释，再接入野生型地衣芽孢杆菌菌悬液中，重复上述双层平板法纯化3-5次，获得纯化后的噬菌体PK-1。
上述具有噬菌体抗性的地衣芽孢杆菌的选育方法，包括如下步骤：
(1)等离子体诱变处理：将野生型地衣芽孢杆菌NX-1的菌悬液置于等离子体下照射进行诱变处理，获得诱变处理后的地衣芽孢杆菌；
(2)将步骤(1)诱变处理后的地衣芽孢杆菌制备成菌悬液涂布于平板上，向平板中滴加5-10μL噬菌体PK-1的裂解液，经30-37℃培养12-24h后，获得没有出现噬菌斑的地衣芽孢杆菌；
(3)将步骤(2)获得的没有出现噬菌斑的地衣芽孢杆菌涂布于LB平板上，传代5-10次后经检验，获得具有噬菌体抗性的地衣芽孢杆菌。
其中，步骤(1)中，所述的诱变处理，其参数设置为：照射时间1-10min，仪器功率100-150W，照射距离1-3mm，照射剂量1-10SLM。
其中，步骤(1)和步骤(2)中，所述的菌悬液，其制备方法是将野生型地衣芽孢杆菌接种于种子培养基(蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母浸粉5g/L，pH为6.5-7.2)中，37℃的条件下，振荡培养12-24h后得到的，其浓度范围为107-108CFU/mL。
其中，步骤(2)中，所述的噬菌体PK-1的裂解液是由受噬菌体污染的细胞发酵液，经过分离纯化后，再培养获得的。
具体的，将纯化后的噬菌体PK-1的噬菌斑与野生型地衣芽孢杆菌菌悬液混合加入到适量的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12-24h，再离心过滤除菌后得到噬菌体PK-1的裂解液。
上述具有噬菌体抗性的地衣芽孢杆菌在生产聚谷氨酸中的应用也在本发明所保护的范围之内。
其中，所述的生产聚谷氨酸，其发酵培养基为：谷氨酸或谷氨酸盐，碳源，氮源，无机盐和有机酸，溶剂为水，pH为6.5-7.2。
具体的，所述的谷氨酸或谷氨酸盐为谷氨酸钠，优选10-95g/L谷氨酸钠；
所述的碳源包括葡萄糖、白砂糖、甘油和糖蜜中的任意一种或几种的组合，优选15-100g/L葡萄糖、白砂糖、甘油或糖蜜；
所述的氮源为硫酸铵，优选5-50g/L硫酸铵；
所述的无机盐包括锰离子、镁离子、钾离子、磷离子中的任意一种或几种的组合，优选0-1g/L一水合硫酸锰，0.05-2g/L无水硫酸镁，0.05-35g/L三水合磷酸氢二钾；0.05-35g/L磷酸二氢钾；
所述的有机酸为柠檬酸，优选1-5g/L一水合柠檬酸。
其中，所述的生产聚谷氨酸，其发酵条件为：37℃、700rpm、流速5-6.5L/min，pH不低于6.2。
其中，在一些实施例中，所述的具有噬菌体抗性的地衣芽孢杆菌，通过摇瓶发酵实验产聚谷氨酸中，当发酵液pH为6.37，OD660＝6.90时，可得聚谷氨酸的含量为12.58g/L。
其中，在一些实施例中，所述的具有噬菌体抗性的地衣芽孢杆菌，通过5L发酵罐发酵产聚谷氨酸中，发酵48h时，OD660为5.43，可得聚谷氨酸含量为43.88g/L。
其中，在生产聚谷氨酸时，所述的地衣芽孢杆菌能够抵抗噬菌体的侵染。
具体的，在一些实施例中，所述的具有噬菌体抗性的地衣芽孢杆菌，在7L发酵罐发酵产聚谷氨酸时，以50g/L葡萄糖为碳源时，通过向发酵4h后的发酵培养基中加入噬菌体PK-1的裂解液，发酵48h时，OD660为11.40，可得聚谷氨酸含量为33.56g/L。
具体的，将上述7L发酵罐发酵产聚谷氨酸时的碳源替换为60g/L甘油，发酵48h时，OD660为7.18，可得聚谷氨酸含量为33.56g/L。
具体的，在一些实施例中，所述的具有噬菌体抗性的地衣芽孢杆菌，在40m3发酵罐发酵产聚谷氨酸时，以60g/L糖蜜为碳源时，发酵48h时，OD660为14.40，可得聚谷氨酸含量为38.10g/L。
有益效果：
本发明利用等离子体诱变处理聚谷氨酸的生产菌株地衣芽孢杆菌，以从地衣芽孢杆菌发酵液中分离出的噬菌体为筛子，选育出具有噬菌体抗性的菌株，与原生产菌株相比，可以抵抗噬菌体的感染，且生长速度和聚谷氨酸的产量不受影响，并且具有良好的遗传稳定性，从根本上解决了聚谷氨酸生产过程中易受噬菌体感染的问题，提高了聚谷氨酸生产企业的经济效益。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为双层平板板分离纯化噬菌体PK-1产生的噬菌斑。
图2为诱变选育的本发明PGA11菌株的噬菌体侵染验证实验图片，左为噬菌体PK-1侵染野生型地芽孢杆菌，右为噬菌体PK-1侵染PGA11菌株。
图3为抗噬菌体聚谷氨酸生产菌株在5L罐中发酵48h的OD值、pH、PGA含量的发酵过程曲线。
图4为被噬菌体PK-1裂解液侵染的抗噬菌体聚谷氨酸生产菌株在7L罐中发酵48h的OD值、pH、PGA含量的发酵过程曲线。
图5为以甘油为碳源的抗噬菌体聚谷氨酸生产菌株在7L罐中发酵48h的OD值、pH、PGA含量的发酵过程曲线。
图6为以糖蜜为碳源的抗噬菌体聚谷氨酸生产菌株在40m3罐中发酵48h的OD值、pH、PGA含量的发酵过程曲线。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中，所述的野生型地衣芽孢杆菌为NX-11，于2023年2月由公司自行选育并保存。
下述实施例中，所述的噬菌体抗性地衣芽孢杆菌菌株、抗噬菌体聚谷氨酸生产菌株所表述的意思相同，均指具有噬菌体抗性的聚谷氨酸生产菌株——地衣芽孢杆菌PGA11。
实施例1：地衣芽孢杆菌易感染噬菌体PK-1的分离纯化
野生型地衣芽孢杆菌NX-11菌悬液的制备：将野生型地衣芽孢杆菌NX-11接种于无菌的种子培养基中，在37℃的条件下，振荡培养12-24小时后获得菌悬液，用于菌株的分离培养。其中种子培养基为：蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母浸粉5g/L，pH为6.5-7.2。
将从工厂车间获得的聚谷氨酸发酵生产过程中受到噬菌体污染的细胞发酵液放入50mL的无菌离心管中，2500rpm离心15min，保留上清液。用0.22μm滤膜过滤器对上清液过滤除菌并做无菌检查，通过点滴试验，取100μL野生型地衣芽孢杆菌悬液涂布于LB固体平板，再将20μL处理好的上清液点滴在LB固体平板上，确认了噬菌体的存在。
取100μL处理好的上清液样品与100μL野生型地衣芽孢杆菌菌悬液加入到5mL的半固体培养基中，混合均匀后倒入固体培养基上铺平，等到半固体培养基凝固后，倒置放入培养箱中37℃培养12-24h。待长出噬菌斑后，挑取单个噬菌斑连同琼脂一同戳起放入1mL SM缓冲液中，使用0.22μm滤膜过滤器过滤除菌并梯度稀释(104-105)获得噬菌体稀释液。取100μL噬菌体稀释液与100μL野生型地衣芽孢杆菌菌悬液混匀铺双层平板(上层半固体培养基，下层固体培养基)，置37℃培养12-24h。重复上述双层平板步骤并进行噬菌斑形态、大小的检验，直至得到纯化的噬菌体PK-1(如图1所示)。
其中，半固体培养基：蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母浸粉5g/L，上层琼脂0.7％，pH为6.5-7.2。
其中，固体培养基：蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母浸粉5g/L，下层琼脂2％，pH为6.5-7.2。其中，LB液体培养基：蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母浸粉5g/L，pH为6.5-7.2。
实施例2：噬菌体抗性地衣芽孢杆菌菌株的诱变选育
(1)野生型地衣芽孢杆菌菌悬液的制备：
将野生型地衣芽孢杆菌接种于无菌的种子培养基中，在37℃的条件下，振荡培养12-24小时后获得菌悬液，用于菌株的分离培养。
其中，种子培养基为：蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母浸粉5g/L，pH为6.5-7.2。
(2)等离子体诱变：
将步骤(1)获得的菌悬液放在等离子体下诱变照射4min，仪器功率120W，照射距离2mm，照射剂量10SLM，随后将处理过的菌悬液多次离心洗涤后稀释涂布于LB平板上，并置于37℃培养箱中，培养12-24h。
(3)摇瓶筛选：
挑取一环步骤(2)的LB平板上生长较快，健壮饱满湿润的大菌落接种到发酵培养基中进行摇瓶发酵复筛。其中，发酵复筛的发酵培养基为：葡萄糖21g/L，谷氨酸钠10.5g/L，磷酸氢二钾2.1g/L，鱼粉蛋白胨5g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，pH为6.5-7.2。培养条件为37℃、200rpm培养17h。
经多次传代后挑选粘度较高，耐温性好，菌苔丰满，湿润，有光泽，无不规则菌苔生成的菌落，分离出上述诱变处理的地衣芽孢杆菌。
(4)抗噬菌体聚谷氨酸生产菌株的筛选
将步骤(3)中诱变处理的地衣芽孢杆菌的菌落在LB液体培养基中培养成菌悬液(以野生型地衣芽孢杆菌为对照)，逐一涂布在LB平板，将LB平板分为四个象限，在其中的三个象限中滴加5-10μL噬菌体PK-1的裂解液，培养12-24h后，挑选出在三个象限均没有出现噬菌斑的菌株。
其中，噬菌体PK-1的裂解液制备方法如下：挑取一个噬菌体PK-1的噬菌斑，放入装有10mL LB液体培养基和200μL野生型地衣芽孢杆菌的离心管中，在37℃、200rpm的条件下振荡培养12-24h，将培养后的混合液12000rpm离心5min，再经0.22μm滤膜过滤器过滤，即可得到噬菌体PK-1的裂解液。
将挑选出的菌株分别在LB平板上传代5-10次后，再重复以上操作检测各菌株的抗性，最终筛选得到一株具有噬菌体抗性的聚谷氨酸生产菌株——地衣芽孢杆菌PGA11，如图2所示。经测序检测，地衣芽孢杆菌PGA11的16S rRNA的测序结果如SEQ ID NO.1所示。
(5)菌株保藏
将步骤(4)选育的地衣芽孢杆菌PGA11送去保藏，分类命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，菌株号为PGA11，已于2023年06月07日保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27576，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例3：抗噬菌体聚谷氨酸生产菌株的摇瓶实验
摇瓶发酵培养基：白砂糖40g/L；谷氨酸钠40g/L；三水合磷酸氢二钾20g/L；磷酸二氢钾1g/L；硫酸铵5g/L；一水合硫酸锰0.03g/L；无水硫酸镁0.1g/L；一水合柠檬酸1g/L，pH为6.5-7.2。每200mL分装于1000mL摇瓶中，将抗噬菌体聚谷氨酸生产菌株PGA11接种于摇瓶中，在37℃、200rpm下培养72h，通过20％碱液调节pH。结果如表1所示，当发酵液pH为6.37，OD660＝6.90时，可得聚谷氨酸的含量为12.58g/L。
表1摇瓶实验结果
实施例4：抗噬菌体聚谷氨酸生产菌株的5L罐发酵实验
一级种子液：葡萄糖21g/L；谷氨酸钠10.5g/L；磷酸氢二钾2.1g/L；鱼粉蛋白胨5g/L；七水合硫酸镁0.5g/L，pH为6.5-7.2。每50mL分装于250mL规格的平底三角瓶中，将抗噬菌体聚谷氨酸生产菌株PGA11接种于一级种子液中，在37℃、200rpm下培养17h。
二级种子液：白砂糖60g/L；谷氨酸钠40g/L；三水合磷酸氢二钾20g/L；磷酸二氢钾1g/L；硫酸铵5g/L；一水合硫酸锰0.03g/L；无水硫酸镁0.1g/L；一水合柠檬酸1g/L，pH为6.5-7.2。每200mL分装于1000mL三角瓶中，将培养好的一级种子液以5％v/v的接种量，接种到二级种子液中，培养条件为37℃、200rpm培养7h。
三级发酵培养基：白砂糖60g/L；谷氨酸钠45g/L；三水合磷酸氢二钾5g/L；磷酸二氢钾1g/L；硫酸铵5g/L；一水合硫酸锰0.03g/L；无水硫酸镁0.1g/L；一水合柠檬酸1g/L，pH为6.5-7.2。将培养好的二级种子液以5％v/v的接种量接种于三级发酵培养基中，培养条件为37℃、700rpm、流速5.0L/min，定期取样检测，发酵培养至48h下罐。发酵过程中保持搅拌转速不变，20％碱液调节pH不低于6.2，适当提高或降低通风量，如图3所示，发酵48h，其OD660为5.43时，可得聚谷氨酸含量为43.88g/L。
实施例5：噬菌体PK-1裂解液侵染抗噬菌体聚谷氨酸生产菌株的7L罐发酵实验
一级种子液、二级种子液同实施例4、三级发酵培养基碳源替换为葡萄糖50g/L，其它组成同实施例4。
将培养好的二级种子液以5％v/v的接种量接种于三级发酵培养基中，培养条件为37℃、700rpm、流速5.0L/min，20％碱液调节pH不低于6.2。当发酵过程进行到4h时，往三级发酵罐中加入1mL的噬菌体PK-1的裂解液，结果如图4所示，发酵48h，其OD660为11.40，可得聚谷氨酸含量33.56g/L。
由于不具有噬菌体抗性的菌株感染了噬菌体之后，菌株会被裂解破碎，其OD值和产量都会很低，本实施例用噬菌体PK-1的裂解液侵染抗噬菌体聚谷氨酸生产菌株PGA11，结果发现，具有噬菌体抗性的PGA11菌株不受噬菌体影响，依然具有较高的OD值和聚谷氨酸产量。
实施例6：抗噬菌体聚谷氨酸生产菌株以甘油为碳源的7L罐发酵实验
一级种子液：葡萄糖21g/L；谷氨酸钠10.5g/L；磷酸氢二钾2.1g/L；鱼粉蛋白胨5g/L；七水合硫酸镁0.5g/L，pH为6.5-7.2，每50mL分装于250mL规格的平底三角瓶中，将抗噬菌体聚谷氨酸生产菌株PGA11接种于一级种子液中，在37℃、200rpm下培养17h。
二级种子液：甘油60g/L；鱼粉蛋白胨1g/L；谷氨酸钠45g/L；三水合磷酸氢二钾5g/L；磷酸二氢钾1g/L；硫酸铵5g/L；一水合硫酸锰0.03g/L；无水硫酸镁0.1g/L；一水合柠檬酸1g/L，pH为6.5-7.2。每200mL分装于1000mL三角瓶中，将培养好的一级种子液以5％v/v的接种量，接种到二级种子液中，培养条件为37℃、200rpm培养7h。
三级发酵培养基：甘油60g/L；谷氨酸钠45g/L；三水合磷酸氢二钾5g/L；磷酸二氢钾1g/L；硫酸铵5g/L；一水合硫酸锰0.03g/L；无水硫酸镁0.1g/L；一水合柠檬酸1g/L，pH为6.5-7.2。将培养好的二级种子液以5％v/v的接种量接种于三级发酵培养基中，培养条件为37℃、700rpm、流速6.5L/min，定期取样检测，发酵培养至48h下罐。发酵过程中保持搅拌转速不变，20％碱液调节pH不低于6.2，适当提高或降低通风量，如图5所示，发酵48h，其OD660为7.18，可得聚谷氨酸含量为36.73g/L。
实施例7：抗噬菌体聚谷氨酸生产菌株以糖蜜为碳源的40m3罐发酵实验
一级种子液：葡萄糖21g/L；谷氨酸钠10.5g/L；磷酸氢二钾2.1g/L；鱼粉蛋白胨5g/L；七水合硫酸镁0.5g/L，pH为6.5-7.2，每50mL分装于250mL规格的平底三角瓶中，将抗噬菌体聚谷氨酸生产菌株PGA11接种于一级种子液中，在37℃、200rpm下培养17h。
二级种子液：葡萄糖60g/L；鱼粉蛋白胨1g/L；谷氨酸钠45g/L；三水合磷酸氢二钾5g/L；磷酸二氢钾1g/L；硫酸铵5g/L；一水合硫酸锰0.03g/L；无水硫酸镁0.1g/L；一水合柠檬酸1g/L，pH为6.5-7.2。每200mL分装于1000mL三角瓶中，将培养好的一级种子液以5％v/v的接种量，接种到二级种子液中，培养条件为37℃、200rpm培养7h。
三级发酵培养基：糖蜜60g/L；谷氨酸钠4.5g/L；三水合磷酸氢二钾5g/L；磷酸二氢钾1g/L；硫酸铵8g/L；一水合硫酸锰0.03g/L；无水硫酸镁0.1g/L；一水合柠檬酸1g/L，pH为6.5-7.2。将培养好的二级种子液以5％v/v的接种量接种于三级发酵培养基中，培养条件为37℃、转速0-8h，80rpm，8-48h 100rpm、通气量初始750m3/h，逐级增加至发酵中期2000m3/h，维持至发酵结束。定期取样检测，发酵培养至48h下罐。发酵过程中用20％碱液调节pH不低于6.2。配置500g/L糖蜜补料液，121℃下灭菌20min备用。待发酵至12h，将补料液以恒定的流速流加至发酵体系中，控制流加速度300L/h，如图6所示，发酵48h，其OD660为14.40，可得聚谷氨酸含量为38.10g/L。
本发明提供了一株具有噬菌体抗性的地衣芽孢杆菌及其在制备聚谷氨酸中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (10)

1.一株具有噬菌体抗性的地衣芽孢杆菌，分类命名为地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis，菌株号为PGA11，已于2023年06月07日保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27576。
2.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述的地衣芽孢杆菌对噬菌体PK-1具有抗性。
3.根据权利要求2所述的地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述的噬菌体PK-1分离自聚谷氨酸发酵生产过程中受到噬菌体污染的细胞发酵液。
4.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌的选育方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)等离子体诱变处理：将野生型地衣芽孢杆菌的菌悬液置于等离子体下照射进行诱变处理，获得诱变处理后的地衣芽孢杆菌；
(2)将步骤(1)诱变处理后的地衣芽孢杆菌制备成菌悬液涂布于平板上，向平板中滴加5-10μL噬菌体PK-1的裂解液，经30-37℃培养12-24h后，获得没有出现噬菌斑的地衣芽孢杆菌；
(3)将步骤(2)获得的没有出现噬菌斑的地衣芽孢杆菌涂布于LB平板上，传代5-10次后经检验，获得具有噬菌体抗性的地衣芽孢杆菌。
5.根据权利要求4所述的选育方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的噬菌体PK-1裂解液是由受噬菌体污染的细胞发酵液，经过分离纯化后，再培养获得的。
6.根据权利要求4所述的选育方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中，所述的菌悬液，其制备方法是将地衣芽孢杆菌接种于种子培养基中，37℃振荡培养12-24h后离心得到的，其浓度范围为107-108CFU/mL。
7.权利要求1所述的具有噬菌体抗性的地衣芽孢杆菌在生产聚谷氨酸中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在生产聚谷氨酸时，所述的地衣芽孢杆菌能够抵抗噬菌体的侵染。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的生产聚谷氨酸，其发酵培养基为：谷氨酸或谷氨酸盐，碳源，氮源，无机盐和有机酸，溶剂为水，pH为6.5-7.2；
其中，所述的谷氨酸或谷氨酸盐为谷氨酸钠，优选10-95g/L谷氨酸钠；
所述的碳源包括葡萄糖、白砂糖、甘油和糖蜜中的任意一种或几种的组合，15-100g/L葡萄糖、白砂糖、甘油或糖蜜；
所述的氮源为硫酸铵，优选5-50g/L硫酸铵；
所述的无机盐包括锰离子、镁离子、钾离子、磷离子中的任意一种或几种的组合，优选0-1g/L一水合硫酸锰，0.05-2g/L无水硫酸镁，0.05-35g/L三水合磷酸氢二钾；0.05-35g/L磷酸二氢钾；
所述的有机酸为柠檬酸，优选1-5g/L一水合柠檬酸。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的生产聚谷氨酸，其发酵条件为：37℃、700rpm、流速5-6.5L/min，pH不低于6.2。
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