CN101967501B - 基于pH的反馈补料生产赖氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及发酵法生产赖氨酸，具体涉及基于pH的反馈控制补加碳源和氮源发酵生产赖氨酸的方法。在赖氨酸好氧发酵进行过程中，利用pH的反馈来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动；所述控制包括向发酵液中流加葡萄糖和氨的混合溶液、硫酸铵和氨的混合溶液、或葡萄糖、硫酸铵和氨的混合溶液来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动；从而分别间接维持了发酵液中葡萄糖的浓度在预先设定点附近波动、间接维持了发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比在预先设定点附近波动、间接维持了发酵液中葡萄糖的浓度在预先设定点附近波动，且发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比在预先设定点附近波动。
Description
技术领域
本发明涉及发酵法生产赖氨酸的方法，具体地说涉及一种基于pH的反馈控制补加碳源和氮源发酵生产赖氨酸的方法。
技术背景
L-赖氨酸(以下简称赖氨酸)是八种人体必需氨基酸中最重要的一种，它对调节生物体内代谢平衡，提高生物对谷类蛋白质的吸收，改善人类膳食营养和动物营养，促进生长发育均有重要作用。赖氨酸被广泛用作动物饲料添加剂、食品添加剂、药品等。2006年全球赖氨酸的消费量达到85万吨，其中90％的赖氨酸用作饲料添加剂，约5％用作食品添加剂，5％用作医药中间体。
赖氨酸的工业生产始于1958年，日本木下祝郎、中山清等采用紫外线照射谷氨酸棒杆菌得到了一株营养缺陷型突变株，其L-赖氨酸生成量达到工业生产水平。目前，微生物发酵法已成为生产赖氨酸的主要方法，工业生产规模逐年扩大。近年来，随着原材料价格的上涨和市场的激烈竞争，为了提高赖氨酸产率和降低生产成本，仍有大量关于赖氨酸发酵方面的研究报道，主要集中在选育高产赖氨酸菌株、改进发酵工艺和开发新资源等方面。
赖氨酸产生菌属于具有多重遗传标记的突变株，能在胞外大量积累赖氨酸是由于菌体的代谢调节处于异常状态，对环境条件非常敏感。发酵条件如碳源、氮源、无机盐、pH及溶解氧等对赖氨酸的合成有重要影响。其中，底物(葡萄糖)浓度是影响菌体代谢的一个重要参数，它主要通过控制相关酶的合成或活性影响菌体的代谢途径，通常称作葡萄糖效应(俞俊棠，《新编生物工艺学》，化学工业出版社，2003年，110页)。葡萄糖可通过“葡萄糖效应”阻遏、抑制多种酶的合成，如氨基酸合成酶等，这种阻遏作用主要是其分解代谢物引起的。在以葡萄糖为碳源的赖氨酸发酵中，葡萄糖的分解代谢物阻遏会引起多种副产物如丙氨酸等的积累，从而影响糖对赖氨酸的转化率(张克旭，《代谢控制发酵》，中国轻工业出版社，1998年，299页)。
目前，赖氨酸发酵主要采用的是批式发酵模式。在菌体生长阶段需要提供一定浓度的葡萄糖以获得足够浓度的菌体，而在菌体产酸阶段需要维持较低的葡萄糖浓度，这样能够激活赖氨酸合成途径的关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，从而强化二氧化碳固定反应，提高赖氨酸产率。为了实现上述发酵模式，在赖氨酸的生产过程中一般采用补料的方法，但是现有的补料方法主要是按照预定程序流加，属于无反馈的流加，虽然操作比较简单，但是不能真实反映发酵过程中葡萄糖浓度的变化；或者靠人工定时取样分析再调整流加速率，糖浓度的控制滞后，导致葡萄糖浓度波动大。另外，由于在线测定葡萄糖浓度有困难，所以目前无法实现在线测定发酵液中葡萄糖的浓度并及时反馈控制。因此在赖氨酸发酵生产过程中，其补料具有盲目性，发酵生产的重复性也较差。
在赖氨酸发酵生产过程中，准确控制及时补加氮源也是十分重要的。在赖氨酸发酵生产的不同阶段，菌体内的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化的二氧化碳固定反应与丙酮酸激酶催化生成丙酮酸的途径的分配系数直接影响赖氨酸的得率。由于发酵液中铵根和硫酸根的存在能够激活赖氨酸合成途径中关键酶天冬氨酸激酶(文献Agric.Biol.Chem.，1979，43(12)，P.2480)，有利于解除天冬氨酸对于磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的反馈抑制，增加二氧化碳固定反应的代谢流量，从而达到强化赖氨酸合成途径的效果，所以发酵液中的硫酸铵浓度与上述的分配系数直接有关，维持适宜的硫酸铵浓度是调节上述两个途径分配系数的关键。因此在赖氨酸的发酵生产中还需要流加氮源硫酸铵和氨，既维持了适宜的pH值，又能够提高赖氨酸的产量。在赖氨酸的发酵生产中目前普遍采用的是按照预定程序或人工定时取样分析后流加硫酸铵，用发酵液的pH值作为反馈信号控制氨的流加。这种方式导致硫酸铵浓度(相当于铵离子摩尔浓度的二分之一，在发酵的pH下，发酵液中氨的存在形态主要是铵离子)的控制也不精确并且重复性差，影响赖氨酸的发酵生产。
发明内容
本发明的目的之一在于克服现有的赖氨酸生产方法在补料时具有盲目性，影响生产控制，使得发酵产量低的缺陷。提供一种通过检测发酵液中的pH变化，利用pH值反馈控制补料，维持一定的葡萄糖浓度和/或维持一定的硫酸铵与赖氨酸摩尔浓度比，从而简化生产工艺，在不增加额外设备的情况下使赖氨酸的发酵产量大幅度提高的pH反馈补料生产赖氨酸的方法。
本发明的目的之二在于上述维持一定葡萄糖浓度和/或维持一定的硫酸铵与赖氨酸摩尔浓度比的基础上，提出了分段控制赖氨酸发酵生产的方法，进一步促进赖氨酸的发酵生产。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明提供的基于pH的反馈补料生产赖氨酸的方法，包括使用常规方法制备生产赖氨酸的种液，然后进行赖氨酸好氧发酵；本发明是在赖氨酸好氧发酵进行过程中，按照赖氨酸好氧发酵过程中葡萄糖消耗速率和氨消耗速率之间的比例关系(该比例关系可以由本领域技术人员针对不同的发酵菌种自行测定得到)，配制葡萄糖和氨的混合溶液，通过向发酵液中流加该混合溶液来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动，使之既不产生葡萄糖抑制，也不构成限制，达到维持一定的葡萄糖浓度，从而提高赖氨酸发酵产量的目的。此时硫酸铵的流加可采用常规方法；
或，在赖氨酸好氧发酵进行过程中，按照赖氨酸好氧发酵过程中所需的硫酸铵添加速率(由赖氨酸合成速率乘以拟维持的发酵液中的硫酸铵与赖氨酸摩尔浓度比得到)和氨消耗速率之间的比例关系(该比例关系可以由本领域技术人员针对不同的发酵菌种自行测定得到)，配制硫酸铵和氨的混合溶液，通过向发酵液中流加该混合溶液来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动，使之既不产生硫酸铵抑制，也不构成限制，达到维持一定的硫酸铵与产生的赖氨酸摩尔浓度比，从而提高赖氨酸发酵产量的目的。此时葡萄糖的流加可采用常规方法；
或，在赖氨酸好氧发酵进行过程中，按照赖氨酸好氧发酵过程中葡萄糖消耗速率、所需的硫酸铵添加速率(由赖氨酸合成速率乘以拟维持的发酵液中的硫酸铵与赖氨酸摩尔浓度比得到)和氨消耗速率之间的比例关系(该比例关系可以由本领域技术人员针对不同的发酵菌种自行测定得到)，配制葡萄糖、硫酸铵和氨的混合溶液，通过向发酵液中流加该混合溶液来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动，使之既不产生葡萄糖抑制和硫酸铵抑制，也不构成限制，达到维持发酵液中一定的葡萄糖浓度和维持一定的硫酸铵与产生的赖氨酸摩尔浓度比，从而提高赖氨酸发酵产量的目的；
或，将上述3种控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动的技术方案联合使用，来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动。
本发明的基于pH的反馈补料生产赖氨酸的方法具体包括以下步骤：
(1)按常规方法制备生产赖氨酸的种液：配制生产赖氨酸的种子培养基，按常规方法灭菌；将生产赖氨酸的菌种接入生产赖氨酸的种子培养基中；在适宜的温度下摇床培养至对数期得到生产赖氨酸的种液；
(2)好氧发酵：将步骤(1)制得的生产赖氨酸的种液接入经常规方法灭菌的生产赖氨酸的发酵培养基中，得到发酵液，其中：生产赖氨酸的种液的接种量为生产赖氨酸的发酵培养基质量的8％～18％，发酵液中的初始葡萄糖浓度为40克/升～180克/升；在好氧发酵的过程中控制发酵液的温度为30℃～34℃，利用pH的反馈来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动；通过在好氧发酵过程中调节向发酵液中通入的空气量及调节对发酵液的搅拌转速，使得发酵液中的溶解氧保持在1％～20％饱和度。
所述的控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动是：
(1)按照赖氨酸好氧发酵过程中葡萄糖消耗速率和氨消耗速率之间的比例关系，配制葡萄糖和氨的混合溶液，通过向发酵液中流加该混合溶液来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动；或
(2)按照赖氨酸好氧发酵过程中所需的硫酸铵添加速率和氨消耗速率之间的比例关系，配制硫酸铵和氨的混合溶液，通过向发酵液中流加该混合溶液来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动；或
(3)按照赖氨酸好氧发酵过程中葡萄糖消耗速率、所需的硫酸铵添加速率和氨消耗速率之间的比例关系，配制葡萄糖、硫酸铵和氨的混合溶液，通过向发酵液中流加该混合溶液来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动；或
(4)将上述(1)、(2)和(3)所述的3种控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动的技术方案联合使用，来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动。
在好氧发酵开始进行时所加的流加液是氨水或液氨。采用常规的手动或自动的pH控制方法，通过向发酵液中流加氨水或液氨，来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值；此时，发酵液中葡萄糖的浓度、发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比在持续降低。此后，
当发酵液中葡萄糖的浓度降低到预先设定点时，将流加液换成葡萄糖和氨的混合溶液，采用常规的手动或自动的pH控制方法，通过向发酵液中流加该混合溶液，来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动，从而间接维持了发酵液中葡萄糖的浓度在预先设定点附近波动；在发酵结束前1～2小时，将流加液改为氨水或液氨。采用常规的手动或自动的pH控制方法，通过向发酵液中流加氨水或液氨，来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动，直到消耗残余葡萄糖到所需浓度，发酵结束；或
当发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比降低到预先设定的发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比的预先设定点时，将流加液换成硫酸铵和氨的混合溶液，采用常规的手动或自动的pH控制方法，通过向发酵液中流加该混合溶液，来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动，从而间接维持了发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比在预先设定点附近波动；在发酵结束前1～2小时，将流加液改为氨水或液氨。采用常规的手动或自动的pH控制方法，通过向发酵液中流加氨水或液氨，来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动，直到消耗残余葡萄糖到所需浓度，发酵结束；或
当发酵液中葡萄糖的浓度降低到预先设定的发酵液中葡萄糖的浓度的预先设定点，并且，发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比降低到预先设定的发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比的预先设定点时，将流加液换成葡萄糖、硫酸铵和氨的混合溶液，采用常规的手动或自动的pH控制方法，通过向发酵液中流加该混合溶液，来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动，从而间接维持了发酵液中葡萄糖的浓度在预先设定点附近波动，并且，发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比在预先设定点附近波动；在发酵结束前1～2小时，将流加液改为氨水或液氨。采用常规的手动或自动的pH控制方法，通过向发酵液中流加氨水或液氨，来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动，直到消耗残余葡萄糖到所需浓度，发酵结束。
所述的葡萄糖和氨的混合溶液中葡萄糖与氨的质量浓度比为8∶1～15∶1之间的任意一个值，葡萄糖的浓度为400克/升～600克/升；所述的发酵液中葡萄糖的浓度降低到预先设定点，其预先设定点为葡萄糖的浓度为5克/升～20克/升之间的任意一个值。
所述的硫酸铵和氨的混合溶液中硫酸铵与氨的质量浓度比为2∶1～4∶1之间的任意一个值，硫酸铵的浓度为100克/升～200克/升；所述的发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比的预先设定点为1∶2～1∶4之间的任意一个值。
所述的葡萄糖、硫酸铵和氨的混合溶液中，葡萄糖∶硫酸铵∶氨的质量浓度比为8～15∶2～4∶1，葡萄糖的浓度为400克/升～600克/升；所述的发酵液中葡萄糖的浓度的预先设定点为5克/升～20克/升之间的任意一个值，所述的发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比的预先设定点为1∶2～1∶4之间的任意一个值。
本发明中pH值的反馈控制可通过市售的pH电极(传感器)、仪表和执行机构完成，或由人工完成。
本发明中所述的生产赖氨酸的种子培养基和发酵培养基，本领域人员可根据现有技术，按照生产赖氨酸时各种不同菌种所需种子培养基和发酵培养基，采用常规培养基配方进行配制。本发明的方法对于这些种子培养基和发酵培养基均适用。
所述的菌种可以是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)或钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)等。
所述的谷氨酸棒杆菌可以是谷氨酸棒杆菌FERM-P 1709、谷氨酸棒杆菌DSM 5714、谷氨酸棒杆菌DSM 12866、谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5101、中国科学院过程工程研究所的谷氨酸棒杆菌TK26、天津科技大学的谷氨酸棒杆菌TK12或上海工业微生物研究所的谷氨酸棒杆菌FH128等。
所述的黄色短杆菌可以是黄色短杆菌FERM-P 1708、黄色短杆菌FERM-P6463、黄色短杆菌FERM-P 6464、江南大学的黄色短杆菌XQ-8、江南大学的黄色短杆菌WSH-L 1或江南大学的黄色短杆菌FB42等。
所述的乳糖发酵短杆菌可以是乳糖发酵短杆菌FERM-P 1712或江南大学的乳糖发酵短杆菌AL039等。
所述的钝齿棒杆菌可以是沈阳药科大学的钝齿棒杆菌D60-95等。
本发明提供的基于pH的反馈补料生产赖氨酸的方法，是基于这样的构思：在赖氨酸好氧发酵过程中，需要补加氨水或液氨，在调节pH的同时，氨能够提供菌体生长和赖氨酸合成所需的氮源。由于好氧发酵过程的氨消耗速率与葡萄糖消耗速率存在一定的比例关系，可以考虑补加氨水或液氨调节pH的同时补加葡萄糖，利用pH来控制葡萄糖的流加速率从而间接维持发酵液中葡萄糖的浓度一定；另一方面，赖氨酸合成速率与氨消耗速率之间存在比例关系，由此可计算得到为了维持一定的发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比所需的硫酸铵添加速率。本发明根据葡萄糖消耗速率、所需的硫酸铵添加速率和氨消耗速率的关系，将葡萄糖、硫酸铵和氨按此关系配制在同一溶液中，用该混合溶液调节发酵液的pH值。在向发酵液中流加该混合溶液以调节pH的过程中，通过将pH控制在很窄的范围内，使得加入的氨(按当量计)与合成赖氨酸消耗的氨量相等，所以流加该混合溶液控制pH的同时，随同氨加入发酵液中的葡萄糖量正好补充了消耗的葡萄糖量，和/或随同氨加入发酵液的硫酸铵与合成的赖氨酸成一定比例。因而，只要将pH控制在很窄的范围内，就可以保证发酵液中葡萄糖的浓度和/或发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比只在很窄的范围内波动。这样的方法可以在不改变生产设备的情况下，仅在补料罐中加入葡萄糖、硫酸铵和氨的混合溶液，就能够通过pH信号的反馈来间接控制葡萄糖和/或硫酸铵的补加，即，在控制发酵液的pH的同时实现发酵液中葡萄糖浓度和/或发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比的控制。而pH的控制是很成熟的技术，可以很方便地使用市售的pH电极(传感器)、控制仪表和执行机构来完成，也可以人工控制。
与现有技术相比，本发明提供的基于pH的反馈补料生产赖氨酸的方法的优点在于：通过利用pH信号反馈控制葡萄糖和/或硫酸铵的补加，从而间接控制了发酵液中葡萄糖的浓度和/或发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比，达到较准确的控制葡萄糖浓度和/或发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比的目的，并且可以提高目的产物赖氨酸的产量。在发酵过程中不需要增加额外设备，操作简单，适合于工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明：
实施例1
使用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)DSM 12866进行pH反馈控制补料发酵生产赖氨酸，所用培养基如下：
1)种子培养基(g/L)：蔗糖25.0，玉米浆30.0mL，(NH4)2SO42.0，乙酸铵6.0，MgSO4·7H2O 0.4，KH2PO4·3H2O 1.0，L-丙氨酸0.35，味精0.1，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，生物素50μg，菸酰胺5mg，硫胺素0.2mg，pH7.0～7.2，0.075MPa压力灭菌15分钟。
2)发酵培养基(g/L)：葡萄糖50.0，玉米浆40.0mL，(NH4)2SO425.0，KH2PO4·3H2O 3.0，MgSO4·7H2O 1.5，FeSO4·7H2O 0.015，MnSO4·H2O 0.015，生物素0.8mg，菸酰胺0.8mg，硫胺素0.45mg，pH7.0～7.2，0.075MPa压力灭菌15分钟。
从生长良好的活化斜面刮一满环菌苔转入装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，9层纱布封口，31.5℃、200rpm摇床培养22小时，按8％的接种量接入含有3L发酵培养基的5升自动控制发酵罐Biotech-2002(上海保兴生物设备工程有限公司)中，发酵罐带有温度、pH、溶解氧自动控制功能。在发酵过程中，发酵温度控制在31.5℃，通过调节通气量和搅拌转速控制溶解氧在5～10％饱和度之间。开始阶段通过pH反馈用蠕动泵自动流加质量浓度为25％的氨水控制发酵液的pH，pH控制范围设定为6.5～6.6。发酵8小时，发酵液中残余葡萄糖浓度降至20克/升，停止流加质量浓度为25％的氨水，开始向发酵液中流加葡萄糖和氨的混合溶液控制发酵液的pH，pH控制范围设定为6.5～6.6，流加的混合溶液中葡萄糖浓度为500克/升，氨浓度为50克/升。发酵12小时，发酵液中硫酸铵浓度降至10克/升，开始采用恒速补料的方式流加硫酸铵溶液，流加速率为8mL/h，流加的硫酸铵溶液浓度为500克/升，在27小时停止流加硫酸铵。在28小时停止流加葡萄糖和氨的混合溶液，改为流加质量浓度为25％的氨水控制发酵液的pH，pH控制范围设定为6.5～6.6，直至30小时结束发酵。
发酵过程中pH始终维持在6.5～6.6；在流加葡萄糖和氨的混合溶液期间发酵液中葡萄糖浓度维持在18.5克/升～21.5克/升。发酵结束时，发酵液中残余葡萄糖浓度为5克/升，总葡萄糖糖消耗180克/升，赖氨酸产量为66.1克/升，对葡萄糖得率为36.7％。与不补料的分批发酵(初始葡萄糖浓度为180克/升，赖氨酸产量53.9克/升，发酵40小时)相比，产量提高了23％，发酵周期缩短了25％。
实施例2
其它发酵条件同实施例1。其中：菌种采用黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)FERM-P 1708，接种量为10％，发酵培养基中初始葡萄糖浓度为60克/升，初始硫酸铵浓度为22克/升，发酵温度为30℃。开始阶段通过pH反馈用蠕动泵自动流加质量浓度为25％的氨水控制发酵液的pH，pH控制范围设定为7.4～7.5。发酵9小时，发酵液中残余葡萄糖浓度降至10克/升，开始采用恒速补料的方式流加葡萄糖溶液，流加速率为30mL/h，流加的葡萄糖溶液浓度为600克/升，此时仍然在流加质量浓度为25％的氨水。发酵13小时，发酵液中硫酸铵浓度降至5克/升，赖氨酸浓度升至15克/升，硫酸铵与赖氨酸摩尔浓度比是1∶2.8，停止流加质量浓度为25％的氨水，开始向发酵液中流加硫酸铵和氨的混合溶液控制发酵液的pH，pH控制范围设定为7.4～7.5，流加的混合溶液中硫酸铵浓度为200克/升，氨浓度为100克/升。在29小时停止流加葡萄糖溶液以及硫酸铵和氨的混合溶液，改为流加质量浓度为25％的氨水控制发酵液的pH，pH控制范围设定为7.4～7.5，直至30小时结束发酵。
发酵过程中pH始终维持在7.4～7.5；在流加硫酸铵和氨的混合溶液期间发酵液中硫酸铵与赖氨酸摩尔浓度比维持在1∶2.8～1∶3.2之间。发酵结束时，发酵液中残余葡萄糖浓度为3克/升，总葡萄糖糖消耗180克/升，赖氨酸产量为67.5克/升，对葡萄糖得率为37.5％。与不补料的分批发酵(初始葡萄糖浓度为180克/升，赖氨酸产量53.9克/升，发酵40小时)相比，产量提高了25％，发酵周期缩短了25％。
实施例3
其它发酵条件同实施例1。其中：菌种采用谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5101，发酵培养基中初始葡萄糖浓度为40克/升，初始硫酸铵浓度为10克/升，发酵温度为34℃。开始阶段通过pH反馈用蠕动泵自动流加质量浓度为25％的氨水控制发酵液的pH，pH控制范围设定为6.95～7.05。发酵6小时，发酵液中残余葡萄糖浓度降至15克/升，硫酸铵浓度降至3克/升，赖氨酸浓度升至6克/升，硫酸铵与赖氨酸摩尔浓度比是1∶1.8，停止流加质量浓度为25％的氨水，开始向发酵液中流加葡萄糖、硫酸铵和氨的混合溶液控制发酵液的pH，pH控制范围设定为6.95～7.05，流加的混合溶液中葡萄糖浓度为400克/升，硫酸铵浓度为200克/升，氨浓度为50克/升。在28小时停止流加葡萄糖、硫酸铵和氨的混合溶液，改为流加质量浓度为25％的氨水控制发酵液的pH，pH控制范围设定为6.95～7.05，直至30小时结束发酵。
发酵过程中pH始终维持在6.95～7.05；在流加葡萄糖、硫酸铵和氨的混合溶液期间，发酵液中残余葡萄糖浓度维持在13.5克/升～16.5克/升，硫酸铵与赖氨酸摩尔浓度比维持在1∶1.8～1∶2.2。发酵结束时，发酵液中残余葡萄糖浓度为2克/升，总葡萄糖糖消耗180克/升，赖氨酸产量为66.5克/升，对葡萄糖得率为36.9％。与不补料的分批发酵(初始葡萄糖浓度为180克/升，赖氨酸产量53.9克/升，发酵40小时)相比，产量提高了23.4％，发酵周期缩短了25％。
实施例4
其它发酵条件同实施例1。其中：采用的菌种为江南大学的乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)AL039，接种量为18％，发酵培养基中初始葡萄糖浓度为90克/升，初始硫酸铵浓度为35克/升。开始阶段(第一阶段)通过pH反馈用蠕动泵自动流加质量浓度为25％的氨水控制发酵液的pH，pH控制范围设定为6.95～7.05。发酵8小时，发酵液中残余葡萄糖浓度降至5克/升，停止流加质量浓度为25％的氨水，开始第二阶段，向发酵液中流加葡萄糖和氨的混合溶液控制发酵液的pH，pH控制范围设定为6.95～7.05，流加的混合溶液中葡萄糖浓度为600克/升，氨浓度为40克/升。发酵到20小时，发酵液中硫酸铵浓度降到8克/升，赖氨酸浓度升至35克/升，硫酸铵与赖氨酸摩尔浓度比是1∶3.95，停止流加葡萄糖和氨的混合溶液，开始第三阶段，向发酵液中流加葡萄糖、硫酸铵和氨的混合溶液控制发酵液的pH，pH控制范围设定为6.95～7.05，流加的混合溶液中葡萄糖浓度为600克/升，硫酸铵浓度为180克/升，氨浓度为60克/升。在64小时停止流加葡萄糖、硫酸铵和氨的混合溶液，改为流加质量浓度为25％的氨水控制发酵液的pH，pH控制范围设定为6.95～7.05，直至65小时结束发酵。
在第一阶段，pH维持在6.95～7.05；在第二阶段，pH维持在6.95～7.05，葡萄糖浓度维持在3.5克/升～6.5克/升；在第三阶段，pH维持在6.95～7.05，葡萄糖浓度维持在3.5克/升～6.5克/升，硫酸铵与赖氨酸摩尔浓度比维持在1∶3.8～1∶4.2。发酵结束时，残余葡萄糖浓度为5克/升，总葡萄糖糖消耗272克/升，赖氨酸产量为109克/升，对葡萄糖得率为40％。与葡萄糖、硫酸铵独立补料的常规发酵方式(通过pH反馈用蠕动泵自动流加质量浓度为25％的氨水控制发酵液的pH；当残余葡萄糖浓度在5克/升左右、硫酸铵浓度在8克/升左右时开始流加，定时人工取样分析，将拟流加的葡萄糖和硫酸铵分8批加入。总葡萄糖糖消耗250克/升，赖氨酸产量95克/升，对葡萄糖得率为38％)相比，产量提高了15％，对葡萄糖得率提高了5％。
实施例5
其它发酵条件同实施例1。其中：采用的菌种为上海工业微生物研究所的谷氨酸棒杆菌FH128，接种量为8％，发酵培养基中初始葡萄糖浓度为60克/升，初始硫酸铵浓度为40克/升。在发酵过程中，发酵温度控制在32℃，通过调节通气量和搅拌转速控制溶解氧在1～5％饱和度之间。开始阶段(第一阶段)通过pH反馈用蠕动泵自动流加质量浓度为25％的氨水控制发酵液的pH，pH控制范围设定为6.95～7.05。发酵到9小时，发酵液中残余葡萄糖浓度降至10克/升，停止流加质量浓度为25％的氨水，开始第二阶段，向发酵液中流加葡萄糖和氨的混合溶液控制发酵液的pH，pH控制范围设定为6.95～7.05，流加的混合溶液中葡萄糖浓度为500克/升，氨浓度为38克/升。发酵到25小时，发酵液中硫酸铵浓度降到15克/升，赖氨酸浓度升至49.8克/升，硫酸铵与赖氨酸摩尔浓度比是1∶3，停止流加葡萄糖和氨的混合溶液，开始第三阶段，向发酵液中流加葡萄糖、硫酸铵和氨的混合溶液控制发酵液的pH，pH控制范围设定为6.95～7.05，流加的混合溶液中葡萄糖浓度为500克/升，硫酸铵浓度为100克/升，氨浓度为50克/升。在64小时停止流加葡萄糖、硫酸铵和氨的混合溶液，改为流加质量浓度为25％的氨水控制发酵液的pH，pH控制范围设定为6.95～7.05，直至65小时结束发酵。
在第一阶段，pH维持在6.95～7.05；在第二阶段，pH维持在6.95～7.05，葡萄糖浓度维持在8.5克/升～10.5克/升；在第三阶段，pH维持在6.95～7.05，葡萄糖浓度维持在8.5克/升～10.5克/升，硫酸铵与赖氨酸摩尔浓度比维持在1∶2.8～1∶3.2。发酵结束时，残余葡萄糖浓度为5克/升，总葡萄糖糖消耗266克/升，赖氨酸产量为109克/升，对葡萄糖得率为41％。与葡萄糖、硫酸铵独立补料的常规发酵方式(通过pH反馈用蠕动泵自动流加质量浓度为25％的氨水控制发酵液的pH，当残余葡萄糖浓度在10克/升、硫酸铵浓度在15克/升时开始流加，定时人工取样分析，将拟流加的葡萄糖和硫酸铵分8批加入。总葡萄糖糖消耗250克/升，赖氨酸产量95克/升，对葡萄糖得率为38％)相比，产量提高了15％，对葡萄糖得率提高了8％。
实施例6
其它发酵条件同实施例1。其中：采用的菌种为中国科学院过程工程研究所的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)TK26，接种量为10％，发酵培养基中初始葡萄糖浓度为100克/升，初始硫酸铵浓度为35克/升，在发酵过程中，通过调节通气量和搅拌转速控制溶解氧在10～15％饱和度之间。开始阶段(第一阶段)通过pH反馈用蠕动泵自动流加质量浓度为25％的氨水控制发酵液的pH，pH控制范围设定为6.95～7.05。发酵到15小时，发酵液中残余葡萄糖浓度降至10克/升，停止流加质量浓度为25％的氨水，开始第二阶段，向发酵液中流加葡萄糖和氨的混合溶液控制发酵液的pH，pH控制范围设定为6.95～7.05，流加的混合溶液中葡萄糖浓度为400克/升，氨浓度为27克/升。发酵到23小时，发酵液中硫酸铵浓度降到20克/升，赖氨酸浓度升至44克/升，硫酸铵与赖氨酸摩尔浓度比是1∶2，停止流加葡萄糖和氨的混合溶液，开始第三阶段，向发酵液中流加葡萄糖、硫酸铵和氨的混合溶液控制发酵液的pH，pH控制范围设定为6.95～7.05，流加的混合溶液中葡萄糖浓度为400克/升，硫酸铵浓度为120克/升，氨浓度为30克/升。在67小时停止流加葡萄糖、硫酸铵和氨的混合溶液，改为流加质量浓度为25％的氨水控制发酵液的pH，pH控制范围设定为6.95～7.05，直至68小时结束发酵。
在第一阶段，pH维持在6.95～7.05；在第二阶段，pH维持在6.95～7.05，葡萄糖浓度维持在8.5克/升～10.5克/升；在第三阶段，pH维持在6.95～7.05，葡萄糖浓度维持在8.5克/升～10.5克/升，硫酸铵与赖氨酸摩尔浓度比维持在1∶1.8～1∶2.2。发酵结束时，残余葡萄糖浓度为3克/升，总葡萄糖糖消耗300克/升，赖氨酸产量为135克/升，对葡萄糖得率为45％。与葡萄糖、硫酸铵独立补料的常规发酵方式(通过pH反馈用蠕动泵自动流加质量浓度为25％的氨水控制发酵液的pH，当残余葡萄糖浓度在10克/升、硫酸铵浓度在20克/升时开始流加，定时人工取样分析，将拟流加的葡萄糖和硫酸铵分10批加入。总葡萄糖糖消耗302.5克/升，赖氨酸产量121克/升，对葡萄糖得率为40％)相比，产量提高了11％，对葡萄糖得率提高了12.5％。
实施例7
其它发酵条件同实施例1。其中：采用的菌种为沈阳药科大学的钝齿棒杆菌D60-95，接种量为10％，发酵培养基中初始葡萄糖浓度为80克/升，初始硫酸铵浓度为42克/升，在发酵过程中，通过调节通气量和搅拌转速控制溶解氧在15～20％饱和度之间。开始阶段(第一阶段)通过pH反馈用蠕动泵自动流加质量浓度为25％的氨水控制发酵液的pH，pH控制范围设定为6.95～7.05。发酵到12小时，发酵液中残余葡萄糖浓度降至10克/升，停止流加质量浓度为25％的氨水，开始第二阶段，向发酵液中流加葡萄糖和氨的混合溶液控制发酵液的pH，pH控制范围设定为6.95～7.05，流加的混合溶液中葡萄糖浓度为500克/升，氨浓度为36克/升。发酵到21小时，发酵液中硫酸铵浓度降到15克/升，赖氨酸浓度升至49克/升，硫酸铵与赖氨酸摩尔浓度比是1∶2.95，停止流加葡萄糖和氨的混合溶液，开始第三阶段，向发酵液中流加葡萄糖、硫酸铵和氨的混合溶液控制发酵液的pH，pH控制范围设定为6.95～7.05，流加的混合溶液中葡萄糖浓度为500克/升，硫酸铵浓度为100克/升，氨浓度为45克/升。在67小时停止流加葡萄糖、硫酸铵和氨的混合溶液，改为流加质量浓度为25％的氨水控制发酵液的pH，pH控制范围设定为6.95～7.05，直至68小时结束发酵。
在第一阶段，pH维持在6.95～7.05；在第二阶段，pH维持在6.95～7.05，葡萄糖浓度维持在8.5克/升～10.5克/升；在第三阶段，pH维持在6.95～7.05，葡萄糖浓度维持在8.5克/升～10.5克/升，硫酸铵与赖氨酸摩尔浓度比维持在1∶2.8～1∶3.2。发酵结束时，残余葡萄糖浓度为5克/升，总葡萄糖糖消耗290克/升，赖氨酸产量为145克/升，对葡萄糖得率为50％。与葡萄糖、硫酸铵独立补料的常规发酵方式(通过pH反馈用蠕动泵自动流加质量浓度为25％的氨水控制发酵液的pH，当残余葡萄糖浓度在10克/升、硫酸铵浓度在15克/升时开始流加，定时人工取样分析，将拟流加的葡萄糖和硫酸铵分10批加入。总葡萄糖糖消耗298克/升，赖氨酸产量128克/升，对葡萄糖得率为43％)相比，产量提高了14％，对葡萄糖得率提高了16.3％。
Claims (10)
1.一种基于pH的反馈补料生产赖氨酸的方法，其特征是：在赖氨酸好氧发酵进行过程中，利用pH的反馈来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动；所述的控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动是：
(1)按照赖氨酸好氧发酵过程中葡萄糖消耗速率和氨消耗速率之间的比例关系，配制葡萄糖和氨的混合溶液，通过向发酵液中流加该混合溶液来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动；或
(2)按照赖氨酸好氧发酵过程中所需的硫酸铵添加速率和氨消耗速率之间的比例关系，配制硫酸铵和氨的混合溶液，通过向发酵液中流加该混合溶液来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动；或
(3)按照赖氨酸好氧发酵过程中葡萄糖消耗速率、所需的硫酸铵添加速率和氨消耗速率之间的比例关系，配制葡萄糖、硫酸铵和氨的混合溶液，通过向发酵液中流加该混合溶液来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动；或
(4)将上述(1)、(2)和(3)所述的3种控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动的技术方案联合使用，来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的向发酵液中流加葡萄糖和氨的混合溶液来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动，是当发酵液中葡萄糖的浓度降低到预先设定点时，通过向发酵液中流加葡萄糖和氨的混合溶液，来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动，从而间接维持了发酵液中葡萄糖的浓度在预先设定点附近波动。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的向发酵液中流加硫酸铵和氨的混合溶液来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动，是当发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比降低到预先设定的发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比的预先设定点时，向发酵液中流加硫酸铵和氨的混合溶液，来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动，从而间接维持了发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比在预先设定点附近波动。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的向发酵液中流加葡萄糖、硫酸铵和氨的混合溶液来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动，是当发酵液中葡萄糖的浓度降低到预先设定的发酵液中葡萄糖的浓度的预先设定点，并且，发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比降低到预先设定的发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比的预先设定点时，向发酵液中流加葡萄糖、硫酸铵和氨的混合溶液，来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动，从而间接维持了发酵液中葡萄糖的浓度在预先设定点附近波动，并且，发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比在预先设定点附近波动。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征是：所述的葡萄糖和氨的混合溶液中葡萄糖与氨的质量浓度比为8∶1～15∶1之间的任意一个值，葡萄糖的浓度为400克/升～600克/升；所述的发酵液中葡萄糖的浓度降低到预先设定点，其预先设定点为葡萄糖的浓度为5克/升～20克/升之间的任意一个值。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征是：所述的硫酸铵和氨的混合溶液中硫酸铵与氨的质量浓度比为2∶1～4∶1之间的任意一个值，硫酸铵的浓度为100克/升～200克/升；所述的发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比的预先设定点为1∶2～1∶4之间的任意一个值。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征是：所述的葡萄糖、硫酸铵和氨的混合溶液中，葡萄糖∶硫酸铵∶氨的质量浓度比为8～15∶2～4∶1，葡萄糖的浓度为400克/升～600克/升；所述的发酵液中葡萄糖的浓度的预先设定点为5克/升～20克/升之间的任意一个值，所述的发酵液中硫酸铵与产生的赖氨酸的摩尔浓度比的预先设定点为1∶2～1∶4之间的任意一个值。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征是：生产赖氨酸的菌种是谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌或钝齿棒杆菌。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征是：在赖氨酸好氧发酵开始进行时向发酵液中所加的流加液是氨水或液氨，通过向发酵液中流加氨水或液氨，来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征是：在赖氨酸好氧发酵结束前1～2小时，将流加液改为氨水或液氨，通过向发酵液中流加氨水或液氨，来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间的任意一个值附近波动，直到消耗残余葡萄糖到所需浓度。
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