CN1982467B - 基于pH的反馈补料生产谷氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生产谷氨酸的方法，具体地说涉及一种基于pH的反馈控制补加有机碳源(底物)生产谷氨酸的方法。在好氧发酵时，按照发酵液中葡萄糖消耗量和氨消耗量之间的比例关系配制葡萄糖和氨的混合溶液，通过向发酵液中加入葡萄糖和氨的混合溶液来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间，使之既不产生葡萄糖抑制，也不构成限制，至将预先配制的葡萄糖和氨的混合溶液耗尽时停止。该方法利用pH值反馈控制补料，简化了生产工艺，在不增加额外设备的情况下提高了谷氨酸的产量和转化率，适合于工业化生产。

Description

基于pH的反馈补料生产谷氨酸的方法

技术领域

本发明涉及生产谷氨酸的方法，具体地说涉及一种基于pH的反馈控制补加有机碳源(底物)生产谷氨酸的方法。

技术背景

在氨基酸生产工业中，谷氨酸的生产占有重要地位，约占氨基酸总产量的2/3以上。谷氨酸单钠即味精，具有强烈的鲜味，是目前世界上用量最大的调味品。此外，谷氨酸在医药和工业上也有广泛的应用。自从日本首次以发酵法制取谷氨酸成功以来，微生物发酵法已成为生产谷氨酸的主要方法，工业生产规模逐年扩大。目前，谷氨酸发酵的生产技术相当成熟。近年来，随着原材料价格的上涨和市场的激烈竞争，为了提高谷氨酸产率和降低生产成本，仍有大量关于谷氨酸发酵方面的研究报道，主要集中在选育高产谷氨酸菌株、改进发酵工艺和开发新资源等方面。

谷氨酸产生菌属于营养缺陷型突变株，能在胞外大量积累谷氨酸是由于菌体的代谢调节处于异常状态，对环境条件非常敏感。发酵条件如生物素、碳源、氮源、无机盐、pH及溶氧等对谷氨酸的合成有重要影响。其中，底物(如葡萄糖)浓度是控制菌体代谢过程的一个重要参数，主要通过控制相关酶的合成或活性影响菌体的代谢途径。葡萄糖可通过“葡萄糖效应”阻遏、抑制多种酶的合成，如氨基酸合成酶等，这种阻遏作用主要是其分解代谢物引起的。在以葡萄糖为碳源的谷氨酸发酵中，葡萄糖的分解代谢物阻遏会引起多种副产物如乳酸的积累，从而影响糖对谷氨酸的转化率。

目前，我国谷氨酸发酵行业主要采用的是批式发酵模式。在这种生产模式中，维持一定的底物(如葡萄糖)浓度对于谷氨酸的发酵非常重要。为达到经济技术的要求，要提高单批次发酵过程的谷氨酸产量就要提高初始培养基中的底物(如葡萄糖)浓度，但底物(如葡萄糖)浓度过高引起渗透压过大， 影响菌体的代谢及谷氨酸产率。反之，初始葡萄糖浓度较低有利于菌体的生长，但后期发酵液中的残糖迅速耗尽，其生产能力不能得到最大限度的发挥。

为解决上述问题，一般采用在发酵过程中补料的方法。补料技术按补料方式可以分为间歇补料、连续补料和重复补料几种。连续补料又可分为恒速、指数和变速流加。通过补料可以解除底物抑制，减少中间代谢产物的生成，并能维持适宜的环境条件使菌体长期、有效地分泌谷氨酸，从而提高发酵过程的产酸率和转化率。目前，补料技术已成为谷氨酸发酵工艺的主要手段。但是这些现有的补料方法都是按照事先设定的程序进行操作，由于发酵生产的多变性，各批次之间有差异，而糖又不能在线检测，所以难以确切知道发酵过程中底物的实际变化，其补料具有盲目性，影响生产控制。

发明内容

本发明的目的在于克服现有生产谷氨酸的方法在补料时具有盲目性、影响生产控制、使得发酵产量低的缺陷，提供一种通过检测发酵液中的pH变化，利用pH值反馈控制补料，从而简化生产工艺，在不增加额外设备的情况下使谷氨酸的发酵产量大幅度提高的反馈补料生产谷氨酸的方法。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供的基于pH的反馈补料生产谷氨酸的方法，包括使用常规方法制备种液，然后进行好氧发酵，其特征是：在好氧发酵时，按照发酵液中葡萄糖消耗量和氨消耗量之间的比例关系配制葡萄糖和氨的混合溶液，通过向发酵液中加入葡萄糖和氨的混合溶液来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间，使之既不产生葡萄糖抑制，也不构成限制，至将预先配制的葡萄糖和氨的混合溶液耗尽时停止。

该方法的具体步骤如下：

(1)制备种液：配制种子培养基，按常规方法灭菌；将菌种接入种子培养基中，接种量一般为1～10％；在适宜的温度下摇床培养至对数期；

所述的菌种是北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)As1.299(中国科学院微生物研究所菌种保藏中心保藏的北京棒杆菌As1.299)。

(2)好氧发酵：将步骤(1)制得的种液接入经常规方法灭菌的发酵培养基中，控制发酵液的温度为30～38℃，通入适量空气，搅拌，保持溶氧浓度为10～30％空气饱和度；在好氧发酵中，发酵液的pH设定在6.5～7.5之间，发酵液中的初始葡萄糖浓度为40～150克/升；在发酵过程中，随着葡萄糖转化为谷氨酸，导致发酵液的pH降低，当发酵液的pH降至设定点以下时，向发酵液中加入葡萄糖和氨的混合溶液即流加液直至pH回升至设定点；至将预先配制的葡萄糖和氨的混合溶液耗尽时停止。

所述混合溶液中葡萄糖的浓度为100～600克/升，葡萄糖与氨的比例为7～8克葡萄糖/克氨。

pH值的反馈控制可通过市售的pH电极(传感器)和仪表完成，或由人工完成。

本发明中所述的种子培养基和发酵培养基，本领域人员可根据现有技术，按照生产谷氨酸时各种不同菌种所需种子培养基和发酵培养基，采用常规培养基配方进行配制。本发明的方法对于这些种子培养基和发酵培养基均适用。

本发明提供的基于pH的反馈补料生产谷氨酸的方法，是基于这样的构思：在谷氨酸发酵过程中，需要补加大量氨水或液氨，一部分氨提供菌体生长和谷氨酸合成所需的氮源，另一部分氨用于调节pH。因此，可以考虑流加的同时补加葡萄糖，利用pH来控制葡萄糖流加速率及残糖浓度。本发明根据葡萄糖消耗速率和氨消耗速率的关系，将葡萄糖和氨按此关系配在同一溶液中，用该混合溶液中和发酵产生的谷氨酸从而调节pH值。在向发酵液中补加该混合溶液以调节pH的过程中，通过将pH控制在很窄的范围内，使得加入的碱(氨)量(按当量计)与产酸量相等，所以补加该混合溶液控制pH的同时，随同加入发酵液中的葡萄糖量正好补充了消耗的葡萄糖量，从而使发酵液中的葡萄糖浓度维持在一定范围。因而，只要将pH控制在很窄的范围内，就可以保证发酵液中的葡萄糖浓度只在很窄的范围内波动。这样的方法可以在不改变生产设备的情况下，仅在补料罐中加入氨和葡萄糖的混合溶液，就能够在控制发酵液的pH的同时实现发酵液中葡萄糖浓度的控制，即通过pH信号的反馈来间接控制葡萄糖的补加。而pH的控制是很成熟的技术，可以很方便的使用市售的pH电极(传感器)、控制仪表和执行机构来完成。用仪表设定拟控制的pH值的范围，由仪表自动控制。

与现有技术相比，本发明提供的基于pH的反馈补料生产谷氨酸的方法优点在于：通过利用pH信号反馈控制葡萄糖的补加，从而间接控制了发酵液中的葡萄糖浓度，达到较准确的控制葡萄糖浓度的目的，并且可以提高目的产物谷氨酸的产量。在发酵过程中不需要增加额外设备，操作简单，适合于工业化生产。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明：

实施例1.

使用的微生物菌种为北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)As1.299。用上述菌株进行pH反馈控制补料发酵，所用培养基有两种：

1)种子培养基：葡萄糖25克/升，玉米浆25克/升，磷酸氢二钾1克/升，硫酸镁0.6克/升，尿素5克/升，Fe²⁺/Mn²⁺2ppm，用NaOH和盐酸调pH值为6.7，于115℃灭菌。

2)发酵培养基：葡萄糖120克/升，玉米浆6克/升，磷酸氢二钾1克/升，硫酸镁0.6克/升，Fe²⁺/Mn²⁺2ppm，用NaOH和盐酸调pH值为7.0，于115℃灭菌。

取50ml种子培养基置于1L摇瓶中，接入新鲜斜面种子，32℃、260rpm摇床培养8h，按5％的接种量接入含有发酵培养基的5升自动控制发酵罐中，发酵温度控制在：0～10h，32℃；10h以后，36℃。开始阶段通过蠕动泵自动流加25％的氨水控制pH在6.95～7.05，通过调节通气量和搅拌转速控制溶氧在10～20％空气饱和度。当发酵液中残糖浓度降至20克/升(12h)时，开始向发酵液中流加葡萄糖和氨的混合溶液控制发酵液的pH和糖浓度，流加的混合溶液中葡萄糖浓度为500克/升，氨浓度为68.3克/升。控制过程为：当pH降至6.95时，开始自动流加葡萄糖与氨的混合溶液至发酵液的pH升至7.05。发酵结束后，谷氨酸最大产量为50克/升，对葡萄糖转化率为30.7％。在发酵过程中残糖浓度维持在22～24克/升。与不补料的分批发酵的谷氨酸产量(32.8克/升，初糖浓度为150克/升)相比，产量提高了0.52倍，转化率提高了0.42倍。

实施例2.

其他发酵条件同实施例1。当发酵液中残糖浓度降至10克/升(14h)时，开始向发酵液中流加葡萄糖和氨的混合溶液控制发酵液的pH和糖浓度，流加 的混合溶液中葡萄糖浓度为500克/升，氨浓度为68.3克/升。控制过程为：当pH降至6.95时，开始自动流加葡萄糖与氨的混合溶液至发酵液的pH升至7.05。发酵结束后，谷氨酸最大产量为53克/升，对葡萄糖转化率为32.3％。在发酵过程中残糖浓度维持在8.5～10.5克/升。与不补料的分批发酵的谷氨酸产量(32.8克/升，初糖浓度为150克/升)相比，产量提高了0.62倍，转化率提高了0.49倍。

实施例3.

其他发酵条件同实施例1。发酵培养基中用纯生物素(2.84微克/升)和硫胺素(75.73克/升)代替玉米浆进行发酵。当发酵液中残糖浓度降至20克/升(13h)时，开始向发酵液中流加葡萄糖和氨的混合溶液控制发酵液的pH和糖浓度，流加的混合溶液中葡萄糖浓度为500克/升，氨浓度为68.3克/升。控制过程为：当pH降至6.95时，开始自动流加葡萄糖与氨的混合溶液至发酵液的pH升至7.05。发酵结束后，谷氨酸最大产量为48克/升，对葡萄糖转化率为29.6％。在发酵过程中残糖浓度维持在20～24克/升。与不补料的分批发酵的谷氨酸产量(32.8克/升，初糖浓度为150克/升)相比，产量提高了0.46倍，转化率提高了0.36倍。

Claims (6)

1.一种基于pH的反馈补料生产谷氨酸的方法，包括制备种液和进行好氧发酵，其特征是：在好氧发酵时，按照发酵液中葡萄糖消耗量和氨消耗量之间的比例关系配制葡萄糖和氨的混合溶液，通过向发酵液中加入葡萄糖和氨的混合溶液来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间，使之既不产生葡萄糖抑制，也不构成限制，至将预先配制的葡萄糖和氨的混合溶液耗尽时停止；

所述的加入的葡萄糖和氨的混合溶液中葡萄糖的浓度为100～600克/升，葡萄糖与氨的比例为7～8克葡萄糖/克氨。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的发酵液的温度为30～38℃。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的发酵液的溶氧浓度为10～30％空气饱和度。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的发酵液中的初始葡萄糖浓度为40～150克/升。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的发酵液的pH值的反馈控制是通过pH电极和仪表完成，或由人工完成。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的菌种是北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)As1.299。